Или вы можете просто позволить автоматическому измерению камеры справиться с этим — но это помогает узнать, что происходит под капотом.

2 голосов

Michael C / 07 августа 2016

Строго говоря, Значение экспозиции (EV) — это стандартизированная шкала комбинаций значений диафрагмы и времени экспозиции, которые эквивалентны без учета какого-либо конкретного уровня освещенности или яркости. в сцене. Каждый шаг по шкале EV удваивает или уменьшает вдвое количество света, попадающего на сенсор или пленку, если количество света, попадающего на переднюю часть объектива, постоянно. Если не указано иное, EV также считается основанным на чувствительности пленки / датчика ISO 100.

EV 0 определяется как время воздействия 1 секунда при f / 1. Если уменьшить диафрагму (Av — для значения диафрагмы)) на одну ступень и удвоить время экспозиции (Tv — для значения времени), мы пропустим вдвое меньше света через объектив в два раза дольше, что позволит получить такое же общее количество свет, чтобы ударить пленку или датчик. Таким образом, 2 секунды при f / 1,4 также равны EV 0. Так же 1/2 секунды при f / 0,7 (мало линз, способных к f / 0,7).

Помните, что шкала f-числа основана на дроби с фокусным расстоянием объектива, деленным на диаметр объектива входного зрачка ( эффективная апертура — который измеряется от передней части объектива). Чтобы уменьшить ареальный размер входного зрачка вдвое, диаметр изменяют на 1 / √2 или примерно на 1 / 1.4. Диафрагма f / 1.4 имеет ширину 1 / 1.4x (что равносильно тому, чтобы сказать, что ширина 0.7X), как диафрагма f / 1 на том же объективе и имеет половину площади. Апертура f / 0,7 в 1 / 0,7 раза шире (это то же самое, что сказать, что ширина 1,4х), чем диафрагма F / 1, и имеет двойную площадь.

Соотношение между каждым значением на шкале EV аналогично: каждое увеличение или уменьшение одного EV вдвое или вдвое увеличивает общую экспозицию. Опять же, EV 0 определяется как 1 секунда при f / 1.
Если мы наполовину уменьшим общее количество света, мы получим значение EV 1 — 1 секунда при f / 1,4 или 1/2 секунды при f / 1, 1/4 секунды при f / 0,7 и т. Д.
Уменьшите вдвое экспозицию с EV1, чтобы получить EV 2 — 1 секунду при f / 2, 1/2 секунды при f / 1. 4 или 1/4 секунды при f / 1 и т. Д.

Если мы пойдем в другом направлении, мы перейдем к отрицательным EV. EV -1 вдвое больше экспозиции EV 0. Это 2 секунды при f / 1 (или 1 секунда при f / 0.7 и т. Д.)

Иногда говорят, что удельная яркость света равна Значение экспозиции . Это использование обязательно включает в себя предполагаемое, но редко формулируемое условие, что надлежащая экспозиция 18% серого будет результатом использования определенного EV при уровне освещенности, на который делается ссылка.

Из глубины статьи Википедии для EV :

Строго говоря, EV не является мерой яркости или освещенности; скорее, EV соответствует яркости (или освещенности), для которой камера с заданной скоростью ISO будет использовать указанный EV для получения номинально правильной экспозиции. Тем не менее, среди производителей фотооборудования распространена практика выражать яркость в EV для скорости ISO 100, например, при указании диапазона измерения (Ray 2000, 318) или чувствительности автофокуса. И практика давно установлена; Ray (2002), 592) цитирует Ulffers (1968) в качестве раннего примера. Правильно следует указывать постоянную калибровки измерителя, а также скорость ISO, но это делается редко.

Возьмите, к примеру, правило «солнечной шестнадцати». Правила «Sunny Sixteen» гласят, что при ярком солнечном свете диафрагма f / 16 требует времени срабатывания затвора, которое является обратной величиной чувствительности ISO датчика или пленки. Таким образом, если мы используем ISO 100 и снимаем при ярком дневном свете, мы использовали бы выдержку 1/100 с диафрагмой f / 16. Эта комбинация Tv и Av находится в пределах 1/3 ступени от того, что определено как EV 15 (1/125 @ f / 16 или эквивалентный).

Поэтому, хотя мы можем сказать: «Прямой солнечный свет — это EV 15», мы действительно говорим, что использование комбинации Tv и Av, равной EV 15, приведет к правильному экспонированию объектов среднего серого или объектов с эквивалентной отражательной способностью под прямыми солнечными лучами с пленкой или датчиком с чувствительностью к свету ISO 100. Мы можем так же легко использовать комбинацию, равную EV 15, чтобы сделать сильно недодержанную фотографию в темной комнате.

Если мы использовали 1/125 @ f / 16 с ISO 100, мы использовали EV 15, чтобы сделать полностью черную фотографию.

настройка и коррекция для начинающих

Содержание

1. Что такое экспозиция
2. Диафрагма
3. Выдержка
4. Светочувствительность
5. Взаимосвязь параметров
6. Использование гистограммы в оценке экспозиции
7. Шкала экспозиции и прием брекетинга в фотографии
8. Шкала экспозиции
9. Что такое брекетинг
10. Механизм замера величины экспозиции

​При просмотре фотографий встречаются снимки, на которых некоторые участки настолько яркие, что теряются детали изображения. Или, наоборот, на фотографии часть кадра очень темная, скрывающая все подробности изображения. Опытный фотограф сразу скажет, что в обоих случаях неправильно выбраны параметры экспозиции.

Что такое экспозиция

Что такое экспозиция в фотоаппарате? Экспозиция – один из краеугольных камней фотографического искусства. Учебники, самоучители, обучающие видео и интернет курсы с первых страниц и с первых минут рассказывают об экспозиции, ее элементах, ее значении для получения хороших фотографий. Затем обстоятельно излагается, как же пользоваться экспозицией в фотоаппарате и как правильно ее выбирать.

Для получения фотографического изображения необходимо, чтобы свет, отразившись от окружающих объектов, через объектив цифрового фотоаппарата попал на светочувствительную матрицу. Экспозицией как раз и называется количество света, попавшее на светочувствительный слой за определенное время.

От нее зависит яркость полученного снимка: недостаточное количество полученного света приводит к затемненному изображению, от его избытка изображение засвечивается.

Для получения идеально яркого фотографического изображения необходимо правильно устанавливать экспозицию, то есть иметь возможность каким-либо способом изменять ее. Для этого, во-первых, можно варьировать количество попадающего на матрицу света, во-вторых, менять чувствительность матрицы.

Технически в фотокамере это достигается изменением диафрагмы, выдержки и светочувствительности.​

Диафрагма

Диафрагма – непрозрачная перегородка в объективе фотоаппарата с отверстием переменного диаметра. При увеличении размера отверстия световой поток, попадающий на матрицу камеры, возрастает, делая изображение более ярким. При уменьшении диаметра отверстия световой поток уменьшается, ослабляя яркость изображения.

Принято, что значение диафрагмы (диафрагменное число) задается отношением фокусного расстояния объектива (f) к диаметру отверстия диафрагмы. Диафрагменные числа образуют следующий ряд: f/1; f/1,4; f/2 и т. д. Часто просто пишут 2,8; 4; 5,6; 8; 11; 16; 22; 32; 45; 64. Способ записи не важен. Главное помнить, что каждому следующему значению диафрагмы соответствует в 2 раза меньшая величина освещенности.

Выдержка

Выдержка – период времени, в течение которого затвор (специальная заслонка в камере), открыт и пропускает световой поток на матрицу. Выдержка в фототехнике измеряется в секундах и их частях: 30; 15; 8; 4; 2; 1; 1/2; 1/4; 1/8; 1/15; 1/30; 1/60; 1/125; 1/250 и т.д. Показатели эти стандартные, составляющие шкалу выдержки, которая используется практически во всех фотоаппаратах.

Светочувствительность

Светочувствительность (ISO) – параметр, характеризующий чувствительность матрицы фотоаппарата к попадающему на нее световому потоку.​ Измеряется в единицах, каждое следующее значение больше предыдущего в 2 раза: 100, 200, 400, 800 и т.д. Чем больше выбранное значение ISO, тем ярче кадр и наоборот.

При выборе больших величин светочувствительности растет уровень цифрового шума, влияющий на качество получаемого изображения.

Фотоэкспозиция измеряется в экспозиционных числах (EV — Exposure Value). Это условная величина, представляющую собой комбинацию показателей диафрагмы, выдержки и светочувствительности, необходимую для фотоизображения нормальной ярости при определенном освещении. Величина экспозиции связана со световым числом (Light Value, LV), характеризующим освещенность какой-либо сцены во время фотосъемки. Считают, что при ISO = 100 единиц EV=LV.

Существуют таблица LV для наиболее характерных фотографических сцен, а также таблица значений EV для различных показателей диафрагмы и выдержки. Таблицы достаточно удобны в применении.

Взаимосвязь параметров

Регулировать количество света, попадающего на матрицу камеры, возможно, изменяя диафрагму и выдержку. Эти два параметра называются экспопарой, что подчеркивает их взаимосвязь при экспонировании. Одинаковое EV в кадре можно получить при различных, но зависящих друг от друга показателях диафрагмы и выдержки.

Например, EV будет равно 7, если выставить следующие величины диафрагмы и выдержки: 2.0 — 1/30; 4.0 — 1/8; 5,6 – 1/4 и т.д.

Это явление — одно из проявлений закона взаимозаместимости (закона Бунзена – Роско). Практическое значение данного закона в следующем. Диафрагма и выдержка применяются не только для экспонирования кадра.

Диафрагма отвечает также за глубину резкости, а правильная выдержка нужна для фотографирования движущегося объекта, чтобы не допустить смазанности изображения. Закон взаимозависимости позволяет правильно проэкспонировать кадр, подбирая значения экспопары, обеспечивающие четкость и резкость снимка.

В приведенном примере экспонирование кадра осуществлялось при ISO, равной 100 единиц. До 90-х годов 20 века (в эпоху пленочных фотоаппаратов) изменение светочувствительности практически не использовалось для фотоэкспозиции. Для этого пришлось бы для каждого кадра менять пленку на другую, имеющую нужную величину ISO, что на практике затруднительно.

Однако с появлением цифровых камер стало возможным экспонировать изображение, меняя светочувствительность матрицы. И хотя фотографы-профессионалы по-прежнему рекомендуют устанавливать минимальные значения ISO и менять их как можно реже, современные камеры позволяют получать снимки хорошего качества при достаточно высоких показателях ISO (до 1600). Таблица экспозиции для различных показателей диафрагмы и выдержки и в этом случае также применяется.

Необходимо только помнить, что при повышении значения ISO в два раза, соответствующее экспозиционное число возрастает на 1 единицу.

Использование гистограммы в оценке экспозиции

Одно из преимуществ цифровой камеры – возможность сразу оценить качество полученного снимка на ЖК экране. В режиме Live view на экране отображается живое изображение объектов, на которые направлена камера. Это дает возможность лучше выстроить кадр, настроить резкость, выставить фокус.

К сожалению, качество изображения и подсветка экрана, искажающая баланс света и тени, не позволяют с его помощью правильно экспонировать снимок.

Однако в современных фотоаппаратах есть функция, позволяющая быстро и достаточно точно это сделать. Это гистограмма, графически показывающая распределение уровней яркости изображения. Появляется возможность сразу оценить уровень экспонирования и внести в настройки необходимые коррективы.

Гистограмму можно вывести на экран после производства снимка. Существуют модели камер, в которых гистограмма строится на стадии настройки перед съемкой. К сожалению, многие фотолюбители, даже зная, что такое гистограмма в фотоаппарате, не используют ее возможности, ссылаясь на сложность и непонятность.

Горизонтальная ось гистограммы показывает значение яркости изображения. Изменение яркости происходит от черного цвета, отмеченного крайней левой точкой, до белого, показанного на графике крайней правой точкой. Вертикальная ось отображает количество пикселей соответствующей яркости. Получаемый график дает наглядное представление об уровне яркости полученного изображения и о возможных ошибках экспонирования.

Чтобы понять, как правильно интерпретировать гистограмму, необходимо мысленно разделить ее горизонтальную ось на три равные части. Если большинство пикселей расположены в левой трети графика, и они упираются в его левую границу, то с большой долей вероятности можно говорить о недоэкспонированности снимка.

Если же пик пикселей упирается в правую границу гистограммы, скорей всего снимок засвечен.

При концентрации пикселей преимущественно в средней части графика выбрана правильная экспозиция.

Данная функция очень наглядно показывает точность экспонирования, что очень удобно, особенно когда съемка проводится в автоматическом режиме. Достаточно часто микропроцессор фотоаппарата ошибается в некоторых сценах, и, если вовремя не проведена корректировка экспозиции, фотосъемка может быть необратимо испорчена. Если знать, как пользоваться гистограммой, этих неприятностей можно избежать.

Шкала экспозиции и прием брекетинга в фотографии

Чтобы полностью раскрыть все возможности, которыми обладает цифровой фотоаппарат, необходимо разбираться в таких понятиях, как шкала экспозиции и прием брекетинга.

Шкала экспозиции

В цифровой фотоаппарат встроен прибор, измеряющий экспозицию — экспонометр. Точнее, экспонометр измеряет не ее, а отражаемый от объекта фотосъёмки свет.

Микропроцессор камеры по заложенным в него алгоритмам затем экспонирует кадр. Показания экспонометра отображается на экране фотоаппарата и в видоискателе в виде шкалы с отрицательными и положительными числами (обычно от -3 до 3). Эти цифры обозначают экспозиционные числа. В автоматических режимах стрелка указывает на нулевое значение, так как в этом случае процессором камеры осуществляется автоэкспозиция кадра. В ручном режиме смещение стрелки индикатора вправо означает, что снимок получится засвеченным. Если же стрелка находится в области отрицательных чисел – кадр будет затемнен.

В автоматических режимах стрелка экспонометр всегда показывает 0, показывая, что экспонирование проведено правильно. Но это не всегда так. Экспонометр калибруется по яркости предмета, который обладает 18% отражательной способностью. Условия освещенности при этом: день, небо с небольшой облачностью. Если условия съемки сильно отличается от стандартных, автоматика фотоаппарата достаточно часто выбирает экспозицию неправильно.

С помощью шкалы легко осуществляется ручная экспокоррекция изображения. Например, в фотоаппаратах Canon, достаточно перейти в один из творческих режимов, нажать кнопку +/- и, вращая диск управления и перемещая стрелку индикатора вправо или влево, сделать кадр соответственно светлее или темнее. Необходимые значения диафрагмы, выдержки и светочувствительности камера установит автоматически.

Что такое брекетинг

Что такое брекетинг? Еще один способ получения хороших фотографий в условиях плохого освещения и недостатка времени — брекетинг экспозиции. Прием заключается в производстве серии фотоснимков (от 3 до 5) с разным уровнем экспонирования. Обычно один кадр делается при значении 0 на шкале экспонометра. Затем значение EV увеличивается на 1 шаг и производится снимок. Третья фотография делается после уменьшения EV на 1 шаг. Отбор наиболее удачного снимка проводится позже. Размер шага можно изменять – автоматика допускает его градацию от 1/3 до целого EV.

Профессиональные фотоаппараты оснащаются ручным управлением режима брекетинга. Оно позволяет выбрать множество параметров функции и преследует достижение с помощью этого приема высокохудожественных фоторабот. Именно с использованием брекетинга создаются HDR фотографии, когда несколько последовательных снимков, сделанных с разным уровнем ISO, постобработкой объединяются в один.

Фотоаппараты среднего ценового диапазона снабжены режимом AEB, делающим несколько снимков с заданным шагом изменения экспозиционного числа после однократного нажатия на кнопку затвора.

Механизм замера величины экспозиции

Экспонометр в зависимости от заданного режима осуществляет замер экспозиции и передает полученные данные в процессор камеры. Процессор проводит анализ информации и с помощью программных алгоритмов экспонирует изображение.

Режимы измерения яркости объекта в цифровых камерах выбираются либо фотографом при ручном управлении, либо микропроцессором камеры при автоэкспозиции.

Автоматика обеспечивает в большинстве случаев удовлетворительное качество снимков, однако для получения фотографий высокого художественного уровня необходимо знать и понимать, что такое экспозамер и как использовать его на практике.

Выделяют несколько видов экспозамеров:

• Точечное измерение — Экспозамер в данном случае проводится на ограниченном участке кадра (1—5% от всего изображения), обычно в центре. Яркость остальных участков в расчет не принимается. Благодаря этому точность измерения на выбранном участке очень высока, что обеспечивает его правильное экспонирование. Обычно применяется для фотографирования одиночного предмета на однородном, затемненном фоне, когда требуется получить его четкое, высококонтрастное изображение. Сложный режим, применяемый профессионалами.
• Центровзвешенное (усредненное) измерение — Проводится экспозамер в пределах центральной зоны кадра, ограниченной маркерами видоискателя. Площадь измерения составляет в зависимости от модели фотоаппарата от 60%до 80%. Данный режим обеспечивает оптимальное использование наиболее чувствительных участков матрицы, так как ISO фотосканера плавно снижается от центра к краям. Режим идеален для портретной и репортажной съемки.
• Частичное измерение — Присутствует не у всех фотоаппаратов. Представляет собой режим, при котором площадь кадра, на которой производится замер (10-15%), больше, чем при точечном замере, но меньше, чем при центровзвешенном. Применяется при необходимости сфотографировать объект, игнорируя излишнюю яркость или, наоборот, сильную затененность краев кадра, При таком режиме может сильно страдать детализация снимка (особенно по краям).
• Матричное (мультизонное) измерение — Самый распространенный способ измерения, который установлен по умолчанию в автоматических режимах большинства фотоаппаратов. Он заключается в том, что кадр делится на несколько зон, в каждой из которых производится замер освещенности. Затем процессор сводит все данные воедино, рассчитывает усредненное значение освещенности и уже на его основании выбирает экспозицию. В большинстве случаев обеспечивает хорошее качество снимков, однако в сложных условиях освещения может приводить к ошибкам экспонирования. Подходит новичкам в начале знакомства с фотографией.

Совет! Выбор режима экспозамера зависит от условий съемки. Если освещенность в кадре относительно равномерная, яркость объектов примерно одного тона, то экспозамер лучше осуществлять с помощью матричного измерения.

Как «приручить» ручные настройки камеры в смартфонах Xiaomi

Камера в смартфоне – привычный атрибут, без которого уже сложно представить современный мобильный телефон. И как любая техника – камеры обладают разными характеристиками и возможностями.

Уровень качества мобильных камер уже вплотную подошел к качеству полноразмерных агрегатов начального и среднего уровня. В основном это произошло за счет применения особых алгоритмов и программных возможностей в современных смартфонах.

Xiaomi не стала исключением из правил! Компания оснащает свои смартфоны современными модулями камер от таких именитых брендов как Sony, Samsung и Omnivision. Помимо этого, Xiaomi использует фирменное приложение «Камера» и собственные алгоритмы по обработке снимков.

Зачастую мы используем автоматический режим съемки, для того чтобы быстро и просто запечатлеть понравившийся нам момент. Однако для того, чтобы снять свой «маленький шедевр» более качественно, необходимо разобраться с расширенными возможностями камеры. Для этого необходимо знать, что такое ручные настройки и с чем их едят. Давайте вместе познакомимся с ними более детально!

Используя режим ручной настройки, вы можете вручную изменить такие параметры, как баланс белого, выдержка, значение ISO и фокус. Благодаря данному режиму ваш смартфон превращается в небольшую DSLR камеру. А теперь подробнее о каждом показателе, чтобы знать, что и как менять!

Баланс белого — это один из параметров, который отвечает за уровни цветопередачи. Используя данное значение, вы сможете подредактировать цветопередачу фотографии так, чтобы она совпадала с реальным цветовым охватом объекта съемки. В приложении «Камера» вы можете использовать как ранее заготовленные варианты, так и настроить это значение вручную.

Выдержка — это интервал времени, в течение которого на матрицу будет попадать свет. Простыми словами — значение выдержки показывает, какое количество времени будет задействовано на создание одной фотографии. Таким образом, если вы хотите запечатлеть быстродвижущийся объект, например, воду, вырывающуюся из фонтана — необходимо использовать короткую выдержку. Если же вы хотите заснять объект, который мало освещен, то лучше всего использовать длинную выдержку. Но важно помнить, что если выдержка будет слишком длинной, то кадр может оказаться засвеченным, с короткой выдержкой это также работает в обратную сторону.

Значение ISO отражает светочувствительность камеры к свету. Чем выше данный параметр, тем светлее будет ваш снимок (также количество цветного шума увеличится).

Фокус отвечает за четкость картинки на различном расстоянии. Изменяя его, вы сможете сфокусироваться на близком/дальнем объектах.

Используя данное свойство можно найти интересные кадры даже среди обыденных вещей!

Теперь на примере фотографий, сделанных на смартфон Xiaomi Mi 5c, отследим изменения, которые можно внести с помощью ручных настроек.

При создании этого снимка были использованы ручное выставление фокуса, для того чтобы захватить капли, и заниженное значение ISO для повышения качества. (Значение фокуса было выставлено на 15 ед, а выдержка — на 100, остальные параметры в режиме авто).

Это фото было сделано с помощью ручной настройки значений ISO и выдержки (ISO 40/выдержка 1с), благодаря чему мы смогли получить интересный световой эффект от фар проезжающих автомобилей.

Снимок сделан ночью и сопровождался не самыми приятными погодными условиями. Для создания были заложены ручные настройки для ISO — 40, выдержка — 4с и фокус — бесконечность. Благодаря этому мы получили достаточно яркую фотографию с маленьким количеством шумов. Также, благодаря относительно длинной выдержке, вода приобрела «резиновый» эффект.

Используя ручные настройки мобильной камеры, вы можете стать повелителем света! Эта фотокарточка была сделана с помощью настройки ISO (40), выдержки (1с) и фокуса (бесконечность). Благодаря этому мы получили футуристический световой луч и при этом практически отсутствие автомобиля в кадре.

Данная фотография демонстрирует возможности камеры при использовании длинной выдержки, а именно – 16 с. Мы получили яркую и детализированную картинку в центре, однако негативные следы от длинной выдержки заметны на нижней части кадра — трава получилось смазанной из-за ветра и той самой выдержки.

Современный смартфон стал действительно многофункциональным устройством. И теперь необязательно иметь в одном кармане телефон, в другом диктофон, в третьем фотоаппарат. Если правильно обращаться с гаджетом, он может не только порадовать, но и удивить! Потому, зная более подробно о возможностях вашего смарта, мы желаем вам, чтобы каждый кадр был наполнен эмоциями и воспоминаниями. ;

EligoVision — Интерактивные Технологии — EV Toolbox 2.0

Быстрый старт

Что такое EligoVision Toolbox (EV Toolbox)

EV Toolbox — это новый инструментARий дополненной реальности (Augmented Reality), созданный в России и работающий на базе собственной технологии дополненной реальности от компании EligoVision — «живые 3D метки®».

EV Toolbox — это новый, простой и удобный программный продукт, позволяющий 3D дизайнерам и программистам создавать собственные презентации на основе технологии дополненной реальности и зарабатывать на них.

Дополненная реальность (AR) — это интерактивная технология, которая позволяет накладывать «поверх» изображения с камеры специальные компьютерные 2D и 3D объекты таким образом, что создается впечатление, что они непосредственно находятся в реальном мире.

EV Toolbox — это набор программ для создания и просмотра презентаций с дополненной реальностью. EV Toolbox состоит из двух программ: EV Studio и prEView. С помощью EV Studio создается проект, в котором задается сценарий презентации. Проект из EV Studio экспортируется как eva-пакет. Проигрыватель prEView позволяет просматривать созданный eva-пакет в режиме реального времени.

Примеры AR проектов в EV Toolbox

Специально для вас мы создали в EV Toolbox пять уже готовых примеров презентаций. Они наглядно показывают возможности инструментARия.

В них мы включили следующие сценарии презентаций:

1. Размещение модели на метке (Model on Marker)
2. Презентация частей модели через событие перекрытия метки на примере снятия этажей с модели здания (Model Components)
3. Пример презентации с использованием безмаркерных меток (Markerless Technology)
4. Презентация “Изба 2.0.” с включением в презентацию видео и скелетной анимации (IZBA 2.0).
5. Презентация “Мертвец и будильник” с программированием взаимосвязей между двумя независимыми моделями (Deadman and Alarm).>

Для просмотра любого готового примера презентации достаточно открыть эту презентацию, а затем во вкладке File выбрать опцию Preview package. Откроется окно с подключенной к вашему ПК камеры. Далее необходимо нажать кнопку Play и поднести к камере одну из двух меток.

Распечатать метки можно в панели основного меню (стартовый экран при запуске EV Toolbox) в нижней части по ссылке Print Markers. Выйти в основное меню можно через File > Back to Main Menu.

Создание AR презентации в EV Toolbox

Давайте посмотрим, как создается презентация дополненной реальности в инструментARии EV Toolbox по шагам.

Начнем с несложной задачи, где в результате на метке будет появляться простая 3D модель (Model on Marker).

1. В меню выбираем

   Файл > Новый проект

   .
2. Открывается экран проекта. Слева расположена панель проекта, где показаны все добавленные в проект объекты взаимодействия. Справа находится панель свойств, где показываются свойства объектов из панели проекта. По центру располагается рабочая область, где можно настраивать сценарий презентации (если выбрать

   Сценарий

   в панели проекта) и отображение графических элементов в презентации.
3. Для создания презентации нам нужно добавить объекты метки и модели.
4. Для добавления объекта метки выбираем в меню

   Презентация > Создать объект > Объект метки

   , в открывшемся диалоге справа расположены настройки создаваемого объекта. Выбираем маркерную технологию распознавания (о достоинствах и недостатках различных технологий см. в разделе Метки), и файл с паттерном

   ev_pattern.png

   (один из двух предложенных нами паттернов; о том, как создавать собственные паттерны меток читайте ниже).
5. Добавляем объект модели:

   Презентация > Создать объект > Объект модели

   , в качестве ресурса модели выбираем файл

   ev_model.fbx

   . Также при создании необходимо выбрать объект метки, к которому будет привязана создаваемая модель. Для этого нажимаем на изображение и в открывшемся диалоге выбираем созданный на предыдущем шаге объект модели.
6. После добавления открываются свойства объекта модели, где можно настроить как будет располагаться модель относительно метки. Масштаб и расположение могут быть подобраны в автоматическом режиме, для этого достаточно нажать на кнопку

   Автоматически

   .
7. Теперь можно посмотреть что получилось. Выбираем в меню

   Файл > Предпросмотр

   . Запускается окно prEView, нажимаем кнопку

   Play

   и презентация запускается.
   
8. Созданную презентацию можно сохранить как проект EV Studio (*.evproj), eva-пакет (

   Файл > Экспорт пакета

   ) и в дальнейшем просматривать в prEView или экспортировать исполняемый файл (

   Файл > Экспорт приложения

   ) (экспорт eva-пакета и приложения доступны тольно в версиях Standard и выше).

Что дальше:

• как работает система взаимодействия
• что еще можно настраивать в объекте модели
• какие требования к меткам
• какие еще есть объекты взаимодействия

Система взаимодействия

Взаимодействие в презентации дополненной реальности задается с помощью объектов взаимодействия и соединений между ними.

У каждого объекта взаимодействия есть

• параметры,
• события,
• действия.

Параметры объекта настраиваются в панели свойств. Например, у объекта модели есть параметр ресурса модели, какая именно модель будет использоваться.

Событие – это извещение системы о том, что с объектом что-то произошло. Например, система определила, что в зоне видимости камеры появилась или исчезла метка. Или сработал поставленный на определенное время таймер, или закончилось проигрывание видео, или иное событие.

С помощью действий мы, например, можем показать или скрыть модель, запустить анимацию.

Cоединение позволяет настроить необходимый набор действий, который должен отреагировать на произошедшее событие. Например, когда видео заканчивается, то нужно скрыть его и произвести следующее действие, например, появление текста на экране.

У некоторых действий есть параметры. Параметры действий задаются или значением, или символом, который должен быть среди параметров события.

Ресурсы

Метки

На данный момент поддерживаются две технологии трекинга:

• Маркерная технология распознаёт только квадратные изображения в специальной рамке (см. подробнее о Маркерной технологии распознавания), однако она более надёжна и менее требовательна к вычислительным ресурсам компьютера.
• Безмаркерная технология позволяет использовать изображения с произвольным соотношением сторон без рамки (в отличие от маркерных меток). Такая технология распознавания имеет некоторые требования к самому изображению (см. в разделе Безмаркерной технологии)

Маркерная технология распознавания

Для работы маркера требуется его печатная версия и файл с изображением его внутренней части (паттерна). На рисунке схематично показаны пропорции печатного маркера и содержимое соответствующего файла с паттерном.

Пропорции маркера (слева) и содержимое соответствующего файла с паттерном (справа). Пунктирная рамка показана только для обозначения границ изображения и в само изображение включаться не должна.

Файл с паттерном должен в точности содержать изображение внутренней части маркера, включая белые поля, но исключая шаблон (линии с точками). Изображение должно быть черным на белом фоне. Промежуточные оттенки серого допускаются при достаточном контрасте изображения по отношению к фону. В картинке не должно быть прозрачных или полупрозрачных пикселей. Для хранения изображений рекомендуются использовать формат PNG, также поддерживаются TIFF, JPG и BMP. Рекомендуется использование только чёрных и белых пикселей, соотношение сторон 1×1. Также необходимо отметить, что размер изображения будет автоматически приведён к 128×128 пикселей, а цвета изображения будут переведены в чёрный и белый цвета (без оттенков серого), что может повлиять на качество и, что гораздо важнее, контрастность изображения. Для того, чтобы избежать упомянутых проблем, рекомендуется использовать изображения, размер которых в точности равен 128×128 пикселей, содержащих только чёрные и белые пиксели.

Маркеры желательно печатать на твердой поверхности, чтобы исключить деформацию, из-за которой могут возникать проблемы с распознаванием. Для корретного определения ориентации паттерн не должен обладать симметрией при повороте на 90 или 180 градусов. На рисунке показаны примеры неправильного и правильного в этом отношении паттернов.

Паттерн, обладающий симметрией при повороте на 90 градусов (слева) и паттерн, не обладающий такой симметрией (справа).

В случае использования в проекте нескольких меток, их паттерны должны значительно различаться между собой. Если различия заключаются в мелких деталях, то при удалении от камеры такие метки могут интерпретироваться как идентичные.

Создание маркера

Для создания собственного маркера скачайте векторное изображение шаблона и откройте его в любом графическом редакторе. Поместите внутрь рамки изображение так чтобы оно не пересекалось с линиями и точками шаблона (поля должны быть достаточными для того чтобы при удалении от камеры изображения не слились). Распечатайте маркер в удобном для вас масштабе, чтобы было комфортно им манипулировать не рискуя случайно перекрыть рукой (пальцем) линии шаблона. При использовании нескольких маркеров в одном проекте рекомендуется сохранять единый масштаб, особенно если предполагается их взаимодействие.

Допускается использование цветного изображения. Цвет при распознавании не учитывается, только оттенок. Не забывайте о контрасте между изображением и фоном.

Создайте паттерн, вырезав в графическом редакторе линии шаблона из маркера. Сохраните файл в описанном выше формате. EV Toolbox может самостоятельно конвертировать изображение в нужный формат при условии что изображение не содержит линий шаблона. Конвертация происходит автоматически при добавлении маркера

Безмаркерная технология распознавания

Безмаркерные метки представляют собой изображения без каких-либо рамок. Рекомендуемый формат изображения — PNG без прозрачности, однако поддерживаются также JPG, TIFF и BMP, изображение может быть как чёрно-белым, так и цветным, а также может иметь произвольное соотношение сторон.

Основным требованием к изображению, как и в маркернгой технологии, является ассиметричность по отношению к повороту на 90 и 180 градусов. Из трёх изображений ниже крайнее левое почти симметрично относительно поворота на 180 градусов. Центральное изображение таким свойством не обладает и может быть использовано в качестве метки.

Стоит отметить, что изображения с большим числом угловатых элементов распознаются лучше. Так, крайнее правое изображение лучше всего подходит для использования в качестве паттерна безмаркерной метки из-за наличия большого числа трещин, которые и будут распознаваться в первую очередь.

Объекты взаимодействия

Что добавится в EV Toolbox в дальнейшем

• Импорт аудио и видео из распространенных форматов
• Редактирование графа сцены
• Редактор моделей
• Постэффекты
• Скриптовые возможности
• Построение 2d интерфейса для проектов
• Поддержка мобильных платформ

Что такое режим «Профи» в приложении «Камера» как его использовать

Иногда сделать качественный профессиональный снимок в режиме автоматических настроек очень трудно, а иногда просто невозможно. Трудность фотографирования может возникнуть при слабом освещении при съемке против света или при других условиях. В таком случае нам на помощь приходит режим «Профи» в приложении «Камера». Здесь мы рассмотрим все возможности этого профессионального режима Xiaomi-камеры и как их применять.

Оглавление
► Режим «Профи» в приложении «Камера»
► Ручной/Профессиональный режим
► Баланс белого (WB)
► Фокусировка (Camera Focus)
► Выдержка (Speed Shutter)
► ИСО (ISO)
► Экспокоррекция (EV)
► Объективы (Lens Mode)
► Соотношение сторон (Aspect Ratio)
► Таймер (Self Timer)
► Линии сетки (Gridlines)
► Горизонт (Horizon)
► Выделение области фокусировки или (Focus Peaking)
► Проверка экспозиции (Exposure Verification)

Режим «Профи» в приложении «Камера»

Во многих приложениях камеры есть так называемый «Ручной/Профессиональный режим». В телефонах Xiaomi этот режим именуется как режим «Профи» в приложении «Камера». Этот режим служит для получения качественных профессиональных фотоснимков в практически любых условиях освещенности. Адаптация камеры под конкретные условия съемки осуществляется вручную путем множественных настроек. Правильное применение этих настроек и позволяет делать красивые и качественные фотографии.

Ручной/Профессиональный режим «Профи» в приложении «Камера»

Ручной/Профессиональный режим это режим фотосъемки, предусматривающий ручное редактирование параметров фотографии таких как:

• WB – баланс белого
• F – фокусировка (Camera Focus)
• S – выдержка (Speed Shutter – скорость затвора/время экспозиции)
• ISO – ИСО
• EV – Экспокоррекция
• LENS – Объективы (Lens Mode – UW/WIDE/TELE)

А также параметров камеры:

• Вспышка
• Режим измерения экспозиции
• 48 – Режим Ultra HD 48MP
• Эффекты
• Соотношение сторон (Aspect Ratio)
• Таймер (Self Timer)
• Линии сетки (Gridlines)
• Горизонт (Horizon)
• Выделение области фокусировки или «Пикинг-фокус» (Focus Peaking)
• Проверка экспозиции (Exposure Verification)

Соответственно вы можете вручную изменять настройки этих параметров для получения необходимого эффекта фотоснимков.

① Баланс белого (WB)

Для настройки правильной передачи цветовых оттенков в.ч. оттенка белого режим «Профи» в приложении «Камера» имеет четыре стандартных пресета баланса белого – Дневной, Теплый, Холодный и Облачный. А также помимо этого здесь вы можете установить вручную значение баланса белого в диапазоне от 2000 до 8000К.

② Фокусировка (Camera Focus)

Название этого параметра говорит само за себя. Вы можете выбрать между ручной и автоматической фокусировкой. Говоря простым языком, чем больше выбранное вами значение, тем дальше от объектива будет находиться область фокусировки.

③ Выдержка (Speed Shutter)

Выдержка это скорость, с которой открывается и закрывается затвор камеры, чем формируется время экспозиции. Скорость автоматического затвора определяется экспонометром камеры, а если вы устанавливаете выдержку вручную, примите во внимание, что чем дольше открыт затвор, тем больше света попадает на фото-матрицу, делая ваше изображение ярче.

④ ИСО (ISO)

ISO – это, по сути, чувствительность камеры к свету. Значение ISO может быть определенно автоматически при помощи экспонометра камеры, а также вы можете настроить значение ISO вручную. Только учтите, что более высокое значение делает камеру более чувствительной к свету, но при этом увеличивает уровень цифрового шума.

⑤ Экспокоррекция (EV)

Экспокоррекция – это функция, которая позволяет принудительно изменять измеренную экспозицию для увеличения яркости или затемнения изображения.

⑥ Объективы (LENS)

Эта опция служит для выбора необходимого объектива телефона. Вы можете переключаться между доступными объективами: WIDE (широкоугольный), UW (широкоугольный) и TELE (телеобъектив).

⑦ Соотношение сторон (Aspect Ratio)

Соотношение сторон это соотношение высоты к ширине изображения, которое формирует визуальный размер фотографии. Его можно установить соответственно 3:4 / 9:16 или Full т.е. полноэкранный.

⑧ Таймер (Self Timer)

Таймер или правильней сказать Автоспуск служит для задержки срабатывания затвора камеры после нажатия кнопки спуска затвора. Временной интервал задержки можно установить 3, 5 или 10 секунд. Используется этот режим, как правило, для коллективных фото с присутствием на снимке самого фотографа.

⑨ Линии сетки (Gridlines)

Линии сетки это удобный вспомогательный инструмент для получения качественных профессиональных фотографий. При включенной опции на экране видоискателя отображаются параллельно вертикальные и горизонтальные линии формирующие сетку. С помощью этой сетки легко выставить пропорцию фотографируемого объекта и поместить его строго по горизонтали или с привязкой к вертикальным линиям окружающего фона. Также эти линии сетки позволяют легко применить так называемое правило третей.

⑩ Горизонт (Horizon)

Эта опция тоже относится к вспомогательной, но является неотъемлемым атрибутом профессиональной камеры. При включенной опции в середине экрана видоискателя отображается индикатор в виде линии, по которой легко установить телефон с привязкой к горизонту.

⑪ Выделение области фокусировки (Focus Peaking)

Выделение области фокусировки или по народному «Пикинг-фокус» это визуальное отображение на видоискателе пиковой фокусировки областей максимальной контрастности в реальном времени с помощью вспомогательной функции «Live View». Это визуально помогает перед съемкой определить, какие детали изображения находится в фокусе. Сфокусированные детали подсвечиваются красной обводкой, а не сфокусированные выглядят обычно.

⑫ Проверка экспозиции (Exposure Verification)

Функция проверки экспозиции направлена на выявление слишком высвеченных (бликующих) деталей и слишком темных областей. Работает эта функция так: недоэкспонированные области заштрихованы синим цветом, а переэкспонированные красным. Это позволяет более точно отрегулировать выдержку. При необходимости можно поиграться со значениями ISO.

Теперь зная как использовать режим «Профи» в приложении «Камера» приступаем к созданию красивых профессиональных фотографий!

Также для возможности делать фотографии высокого качества можно в телефон установить Google камеру. Для этого предлагаем выбрать наиболее подходящий мод GCam из нашей подборки:

• GCam 6 (Google Camera серии 6X)
• GCam 7 (Google Camera серии 7X)
• GCam 8 (Google Camera серии 8X)

• Мегапиксельная камера это круто? Давайте разберемся нужна ли нам камера смартфона с высоким разрешением, чтобы делать более качественные снимки и записывать видео.

• Если ты не являешься профессиональным фотографом и только хочешь им стать, и тебе сложно сделать четкую фотографию без какой-либо размытости, OIS создан, чтобы помочь.

• «Google Camera Technologies» одна из самых передовых технологий камер. Давайте посмотрим, что она привносит в нашу жизнь!

• Что нужно учитывать и как выбрать хороший камерофон при покупке телефона. Добро пожаловать в мир камерофонов!

• Если ты решил избавиться от root, есть несколько способов сделать это. Здесь ты узнаешь, как удалить Magisk и вместе с ним root-доступ.

• Если так оказалось, что вам понадобилась веб-камера, а у вас ее нет – это не проблема. Здесь мы рассмотрим простой способ, как быстро создать Full-HD веб-камеру, используя свой телефон.

• Вы столкнулись с дилеммой, что делать со старым телефоном, лежащим в ящике стола? Его можно легко за 3 простых шага превратить в камеру видеонаблюдения.

• Иногда сделать качественный снимок в режиме автоматических настроек очень трудно. Тогда на помощь приходит режим «Профи» в приложении «Камера».

• Многие хотят чтобы их камера Xiaomi делала фото и видео как камера iPhone. Итак, рассмотрим три простых подхода как превратить камеру Xiaomi в камеру iPhone.

• Zygisk успешно скрывает наличие ROOT на устройстве для любых приложений. Правильно активируем модуль в менеджере Magisk.

• Оригинальный способ как просто быстро и главное правильно обновить утилиту «Magisk Manager» и сам модуль «Magisk» до версии 24.3 Stable.

• Новый 100% метод «В ДВА ШАГА» получения ROOT прав на любом Android смартфоне с помощью готовых пакетов «Авто-инсталляторов».

• Хватит тратить ресурсы памяти и CPU своего телефона на бесполезные приложения. Самый простой способ удаления любых системных приложений без рутирования телефона.

• Для того чтобы узнать поддерживает ли твой Android смартфон Camera2 API и активирована она в его системе есть отличный простой способ проверить это.

• Если нужно подключить телефон к ПК, но не хочется возиться с установкой драйверов, есть отличный фирменный способ для MIUI устройств.

• Функция «Фото с движением» помогает запечатлеть что-то в движении. Чтобы выбрать лучший отдельный кадр, используйте функцию «Отличный снимок».

• Разблокированный загрузчик позволяет нам устанавливать в смартфон сторонние приложения и любые кастомные прошивки. При этом мы также можем продолжать пользоваться официальной глобальной прошивкой MIUI.

• Функция Экспорта / импорта XML-Config файлов с готовыми шаблонами конфигураций настроек для «GCam 7.3».

• Для добавления в меню настроек «Chrome» опции «Dark mode» и включения тёмной темы интерфейса на Android нужно выполнить ряд несложных последовательных шагов.

• В этом посте продемонстрированы примеры фотографий, снятых в разных режимах при дневном освещении и вечером при освещении уличных фонарей.

Шаг изменения экспозиции 1 3 ev canon. Понятие «стоп» экспозиции

«Стоп» — это шаг увеличения или уменьшения количества света, попадающего в объектив. Шаг обозначает, что света на пленку или матрицу камеры попадет в два раза больше (или меньше).

В фотографии «стоп», или «ступень» — понятие довольно распространенное, но многие понимают его неправильно, многие боятся, потому что оно звучит сложно. На самом деле «стоп» — это очень просто.

Изменение экспозиции на стоп (или на одну ступень) означает удвоение (уменьшение или увеличение вдвое) количества света, которое попадает в объектив.

Например, если вы услышите, что вам нужно было увеличить экспозицию на 1 ступень, это означает, что необходимо было захватить в два раза больше света, чем вы получили на фотоснимке.

Экспозиция представляет собой совокупность двух показателей: скорости срабатывания затвора и величины . Каждый из них может изменяться в 1 стоп. Вдобавок на экспозицию влияет ISO.

Так как все показатели имеют разные единицы измерения, то и был изобретен удобный способ для сравнения — изменение экспозиции на стоп.

Стоп и выдержка

Выдержка затвора камеры — время, в течение которого затвор камеры остается открытым во время фотографирования. Чем дольше затвор открыт, тем больше света попадает на чувствительный элемент фотоаппарата и тем больше будет общее воздействие. Удвоение или уменьшение вполовину времени работы скорости затвора производит увеличение или уменьшение воздействия на 1 стоп.

Изменение от 1/200 доли секунды до 1/100 (увеличение времени) позволяет фотоэлементу получить в два раза больше света, поэтому можно сказать, что экспозиция в фотографии меняется на 1 ступень, снимок становится светлее. Аналогично изменение от 1/60 до 1/30 позволяет попасть на фотоэлемент в два раза больше света, что дает изменение экспозиции на 1 стоп.
Большинство камер позволяют установить скорость затвора с шагом в 1/3, так что 3 позиции скорости срабатывания затвора будут соответствовать коррекции экспозиции в 1 ступень.

При регулировке выдержки, например, между 1/60 и 1/125 вы можете обнаружить 1/80 и 1/100 секунды. Это повышает точность экспонирования, но надо понимать, что это между 1/60 и 1/80 один щелчок, но 1/3 стопа.

Стоп и диафрагма

Диафрагма измеряется с помощью «f-числа», которое иногда называют «f-стоп», она показывает величину диаметра отверстия. Необходимо помнить, что меньшее f-число соответствует больше открытой диафрагме, при которой большее количество света попадает на светочувствительный элемент, в то время как более высокое f-число означает более узкую диафрагму (меньше света).

Диафрагма (оно же относительное отверстие) вычисляется сложнее, и шаг, обозначающий увеличение на 1 стоп, происходит при увеличении диафрагмы на 1,4.

Базовая диафрагма — 1 (хотя в мире не много объективов, у которых диафрагма может раскрыться до 1, но они есть, существуют даже такие, у которых f меньше единицы). Умножая на 1,4, получаем стандартный диафрагменный ряд: 1; 1,4; 2; 2,8; 4 и т.д. каждое последующее число говорит о том, что количество света, проходящего через объектив, стало больше или меньше в два раза. То есть снимок на 2,8 с выдержкой 1/60 секунды будет засвечен также, как снимок на 4 с выдержкой 1/30. Чем больше число диафрагмы, тем сильнее она закрывается и тем меньше света попадает на снимок.

Большинство современных камер позволяют управлять диафрагмой с шагом в 1/3 стопа.

ISO , или светочувствительность, отвечает за общее воздействие света на светочувствительный элемент. Чем меньше ISO, тем шире должна быть открыта диафрагма и длиннее выдержка.

Удвоение числа ISO делает необходимым уменьшение экспозиции на 1 стоп. В старых фотокамерах это означало, что фотограф установил в фотоаппарат пленку с большей чувствительностью, а в современных, что мы увеличили чувствительность матрицы к свету.
Например, переход от ISO 100 до ISO 200 удваивает чувствительность датчика, тем самым при тех же условиях съемки следует уменьшать выдержку или зажимать диафрагму на 1 стоп. Переход от ISO 800 до ISO 400 — снижает на 1 стоп. Большинство современных камер позволяют изменять ISO с шагом 1 пункт.

Все можно менять!

Так зачем же они нужны — эти стопы? Изменение на шаг в экспозиции кадра дает нам возможность напрямую сравнить выдержку, диафрагму и ISO. Это означает, что фотограф может легко жонглировать этими компонентами, с целью достичь нужного результата.

Дело в том, что все фотографы, кроме разве что тех, кто снимает в фотостудии, вынуждены работать с тем светом, который есть. Мы не можем отрегулировать мощность солнца так, как нам надо. Давайте рассмотрим несколько примеров:

1) спортивный журналист, снимающий быстродвижущиеся объекты (шахматисты не в счет), вынужден заботиться в первую очередь о выдержке. Соответственно, его не устроит экспопара f=8,0 и 1/125 при чувствительности матрицы ISO 100, которую ему предлагает экспонометр. Ему необходима выдержка 1/500, то есть необходимо сделать выдержку короче на 2 стопа. Чтобы снимок был хорошо проэкспонирован, фотограф вынужден будет открыть диафрагму на 2 стопа. То есть поставить f=4,0;

2) фотопортретист, который находится недалеко от спортивного журналиста, снимает уже победителей на пьедестале, тоже воспользовался этим же экспонометром и получил те же параметры f=8,0 и 1/125 при ISO 100. И он тоже недоволен, так как любит размытый фон, который можно получить только при диафрагме 2,8. То есть фотограф хочет открыть диафрагму на 3 стопа. Соответственно и выдержку он должен укоротить на 3 стопа с 1/125 до 1/1000;

3) а рядом еще один фотограф, который снимает жучков. И у него проблемы — при диафрагме 8,0 глубина резкости недостаточная, он хочет минимум 16,0, то есть закрыть диафрагму на 2 стопа. И требуется корректировка выдержки на два стопа — до 1/30. И тут перед ним встает другой вопрос: как снимать с рук на выдержке 1/30? Фотограф, конечно, покряхтит-покряхтит и пожертвует ISO. Поднимет ISO с 100 до 400, и выдержка 1/125 скроет дрожание рук.

Изменение в стоп экспозиции — удобный способ влиять на кадр, не изменяя отдельные параметры экспозиции. Но почему же фотографы так неохотно меняют ISO, когда оно решает столько проблем? Да все просто — чем больше ISO, тем больше шума на матрице — таких пикселей, которые не до конца поняли, как они должны были быть освещены и экспонируются, как бог на душу положит. Чаще всего это проявляется зелеными точками на темном фоне.

Настройка экспозиции

При регулировке трех компонентов экспозиции фотограф должен знать, что каждый из них влияет на фотографию и другими способами, которые могут быть не всегда желательны.
Выдержка — если скорость затвора будет слишком медленной, снимок может быть размытым от движения камеры или движения объекта.

Диафрагма — широко открытая диафрагма дает малую глубину резкости. Если ее открыть сильно, то можно получить проблемы с поддержанием в фокусе многих деталей. С другой стороны, малая глубина резкости поможет акцентировать внимание на главном объекте съемки.

Чувствительность ISO — чем больше увеличить ISO камеры, тем больше цифрового шума будет на фотографиях. Это может сделать изображение слишком зернистым и уменьшить его четкость.

Как и все в фотографии, для регулировки этих трех параметров требуется соблюдение баланса. Необходимо решить, какой эффект нужно получить, чтобы выбрать такие величины, которые сведут к минимуму все возможные недостатки. Изменение экспозиции с помощью стопов — удобный способ влияния на общую картинку кадра, оно дает больший контроль над всей сценой фотографии.

Стопы в студийных приборах

Нередко, при работе в студии можно услышать такие фразы как «уменьшил мощность импульсного осветителя на 1 стоп» или «разница между освещением 2 стопа». Дело в том, что в студийной съемке используют те же термины, и понятие «стоп» оказалось очень удобным. Ведь можно запутаться при пересчете джоулей, люменов и люксов в числа диафрагмы. Гораздо проще сказать: «Поменяй мощность на 1 стоп», и становится понятно — будет выдавать света в два раза больше или меньше. (большинство) даже градацию мощности ведут в стопах.

Брекетинг экспозиции — это термин, используемый для описания техники создания трех или более кадров одного сюжета с разными значениями экспозиции в каждом из них.

Идея использования метода брекетинга экспозиции возникла для того что бы убедиться, что за время съемки одного сюжета у автора точно будет одна фотография с удачной экспозицией. Это стало обычной практикой при фотосъемке природы и городских пейзажей.

На первый взгляд, может показаться, что с существованием Фотошопа данный подход к съемке не имеет смысла, ведь многие недоэкспонированные или засвеченные снимки можно легко реабилитировать с помощью редактора. Тем ни менее, многие фотографы стремятся создавать сразу хорошие и красивые фотографии!

Брекетинг экспозиции особенно полезен в сложных условиях освещения, когда трудно подобрать верную экспозицию. Сделав несколько кадров, созданных при различных настройках фотоаппарата. Глядя на них, можно определить для себя, в каком случае экспозиция была установлена наиболее удачно. Если вы фотографируете при ярком солнечном свете, когда, с одной стороны, возникают яркие тени, а с другой, в кадре есть яркие области, брекетинг может оказаться отличным решением, особенно если вы решите создать изображение с расширенным динамическим диапазоном (HDR).

Обычный способ Брекетинга экспозиции заключается в том, что бы использовать одинаковое значение диафрагмы (например, f/16 для пейзажей), и вносить изменения в скорость затвора. Поменять выдержку вы сможете, фотографируя в ручном режиме (M). Выдержку каждый раз можно менять, увеличивая её в два раза, например, используя такие значения — 1/15, 1/30, 1/60. Можно менять выдержку, увеличивая её на половину ступени — 1/30, 1/ 45, 1 /60, или даже на треть ступени — 1/30, 1/40, 1/50, 1/60 для более тонкой настройки экспозиции.

Пошаговое руководство по брекетингу экспозиции

Брекетинг экспозиции. Шаг №1. Ручная настройка

Выберите ручной режим (M), установите диафрагму на значение f/16. Используйте режим Оценочного замера экспозиции и установите значение экспозиции на «0».

Брекетинг экспозиции. Шаг №2. Настройка выдержки

Сделайте первый снимок, используя те настройки фотоаппарата, которые вы считаете верными. При той же диафрагме, вручную измените выдержку, так же, сделайте снимок с увеличенной на один шаг экспозицией, и уменьшенной (то есть «+1» и «-1»).

Брекетинг экспозиции. Шаг №3. Тонкая настройка

Если освещение кажется вам слишком контрастным, то сделайте не три фотографии, а пять, увеличив и уменьшив экспозицию еще на один шаг. Таким образом, вы сделаете фотографии с такими настройками экспозиции: -0,7 e.v.; -0,3 e.v.; 0; +0,3 e.v.; + 0,7 e.v..

Как использовать Автоматический брекетинг (AEB)

Функция брекетинга экспозиции на камере это отличный способ, который обеспечит вам идеальную экспозицию. Основная идея в том, чтобы снять несколько кадров вашего сюжета, а затем выбрать лучший из них. Это особенно полезно, если объект статичен, например, вы фотографируете пейзаж. Брекетинг будет не так полезен при съемке движущихся объектов, даже, если речь идет о портретах, где человек, так, или иначе может пошевелиться, пока вы меняете настройки.

Брекетинг экспозиции был особенно популярен в дни пленочной фотографии, когда у фотографов не было возможности сразу же взглянуть на результат съемки через дисплей. Автоматическая экспозиционная вилка позволяет автоматически делать серию снимков с различными параметрами экспозиции. Изменяя выдержку (или диафрагму), камера автоматически устанавливает экспозицию с заданным шагом (обычно от 1/3 до 2-х остановок), чтобы захватить три или более последовательных снимка. Брекетинг обеспечивает правильную экспозицию в ситуациях, когда вам необходимо снимать очень быстро, и у вас нет времени проверить гистограмму. Автоматическая экспозиционная вилка делает этот процесс намного легче, потому что она позволяет снять серию кадров из точно такой же позиции с разной экспозицией.

На следующем рисунке показан процесс работы Автоматического брекетинга экспозиции и процесс выбора кадра с наилучшей экспозицией.

Большинство цифровых камер по умолчанию, могут снимать три последовательных кадра, в то время как есть камеры, с помощью которых вы можете снимать пять, семь или девять кадров. Вы также можете выбрать шаг экспозиции, от 1/3 до 2 шагов. Для сюжетов с высокой контрастностью, к которым вы собираетесь применить режим HDR, для достижения наилучших результатов, лучше установить шаг 1 или 2.

Ниже представлена пошаговая инструкция по настройке автоматического брекетинга экспозиции.

Шаг 1: Установите режим автоматического брекетинга экспозиции

В зависимости от фирмы изготовителя и марки фотоаппарата функция установки брекетинга экспозиции может быть установлена по-разному. В некоторых камерах предусмотрена отдельная кнопка, а в некоторых эта опция доступна через меню.

Уверен, что многие (если не все) начинающие фотолюбители сталкивались с загадочными и не всегда понятными «стопами» и «ступенями». И тот, и другой термин широко распространены и употребимы фотографами, фотолюбителями и сочувствующими. C точки зрения русской академической фотографической мысли, термин «ступень» будут несколько правильнее «стопа», хотя речь в обоих случаях идет об изменении диафрагмы (про ступени и стопы в экспозиции поговорим отдельно).

Присутствие «стопов» наряду со «ступенями» сложилось исторически и, вероятнее всего, отражает «узость круга» людей, занимавшихся у нас в стране фотографией на заре ее существования: для полноценного общения хватало заимствованных слов и определений. Давайте попробуем сначала разобраться со «стопами», имеющими мало общего с одноименным дорожным знаком, но к «торможению» опосредованно относящимися.

Существует мнение, что английское фотографическое «stop » прижилось по следам «Стопов Вотерхауза» (Waterhouse stops ) — полосок металла с отверстиями по центру, вставлявшихся в объектив и выполнявших роль диафрагмы, названных по имени изобретателя — англичанина Джона Вотерхауза (John Waterhouse , 3. 8.1806-13.2.1879), астронома, метеоролога, химика и фотографа.

Про диафрагму

На заре фотографии было не до диафрагмы: низкая чувствительность фотоматериалов и темные объективы заставляли фотографов собирать весь доступный свет, а выдержки измерялись десятками секунд.

Со временем над чувствительностью успешно поработали, выдержки стали короче и появилась возможность подумать о качестве формируемого объективом изображения. О диафрагмировании и его благотворном влиянии уже было известно благодаря астрономам (еще в 1762 году Леонард Эйлер (Leonhard Euler ) — швейцарский, немецкий и российский математик — писал о необходимости использования диафрагм в телескопах («it is necessary likewise to furnish the inside of the tube with one or more diaphragms , perforated with a small circular aperture , the better to exclude all extraneous light «). В 1857 году Филипп Фон Зейдель математически описал 5 основных оптических аберраций : со всеми пятью можно бороться, исключая из формирования изображения лучи, проходящие через края объектива — чем и занимается диафрагма.

Появились диафрагмы для фотообъективов — круглые пластинки с отверстием необходимого диаметра по центру. Поначалу их использование приносило массу неудобств: откручивался передний элемент объектива, внутрь вставлялась диафрагма, потом все собиралось обратно — до следующей смены. Неудивительно, что появление объективов с прорезью в корпусе, куда легко вставлялись тонкие металлические пластинки с отверстиями, было с энтузиазмом встречено фотографирующей публикой. «Самоделкины» даже начали апгрейдить старые объективы, самостоятельно делая прорези. «Стопы» делали не произвольно, а так, чтобы разница в количестве пропускаемого света между соседствующими в наборе пластинками составляла ровно 2 раза.

Первенство изобретения быстросъемных пластинок-диафрагм приписывают Джону Вотерхаузу и датируют 1858 годом (некоторые источники заявляют, что Вотерхауз впервые рассказал о своих «стопах» еще в 1856 году, а Г. Р. Смит (H . R . Smyth ) описал схожее решение одновременно с Вотерхаузом). Так или иначе, новинка пришлась по вкусу и быстро стала стандартным аксессуаром для объектива, а наборы пластинок начали называть «стопами Вотерхауза» (Waterhouse stops ) — они «останавливали» часть света, откуда и пошло название. Кстати, аналог Вотерхаузовских стопов до сих пор находит применение в моноклестроении и даже в промышленно производимом «творческом объективе» Lensbaby .

Отсюда и повелось, что диафрагмирование объектива описывают «стопами»: «прикрой на один стоп» — означает уменьшить количество света в два раза, перейдя на следующее значение диафрагмы. Значения стандартизованы:

1/0.7; 1/1; 1/1.4; 1/2; 1/2.8; 1/4; 1/5.6; 1/8; 1/11; 1/16; 1/22; 1/32; 1/45; 1/64; 1/90; 1/128.

На большинстве современных фотоаппаратов и объективов указываются только знаменатели значений диафрагм, называющиеся диафрагменными числами. Часто перед ними ставится латинская буква «F «.

f/ 0.7 f /1.0 f /1.4 f /2 f /2.8 f /4 f /5.6 f /8 и так далее.

Кстати, привычная нам ирисовая диафрагма не сразу вошла в обиход объективостроения: стопы Вотерхауза были недороги, просты в изготовлении и использовании, эффективно выполняли возложенную на них функцию. Понятно, что таскать с собой набор железяк было неудобно, но дороговизна и сложность изготовления ирисовых диафрагм отсрочили их применение до конца 1870 годов — с этого времени большинство производителей объективов будут предлагать на выбор: обычный вариант со стопами Вотерхауза или дорогой — с ирисовой диафрагмой.

Применительно к изменению значения диафрагмы можно употреблять и «стоп» и «ступень». Если «стопы» стали калькой с английского, то «ступени» — термин отечественного происхождения, ближе стоящий к английскому Exposure Value (EV ).

Величину или ступени экспозиции (EV ) необходимо рассмотреть пристально и в отдельном материале. Вкратце: принципиально она схожа со стопом, но трактуется шире, обозначая изменение общего количества света, попадающего на матрицу/пленку, в зависимости не только от смены диафрагмы, но и от выдержки (иногда — и чувствительности). Изменение экспозиции на одну ступень означает изменение количества света, попадающего на матрицу или пленку в два раза. Сократите количество света в два раза – вы уменьшите экспозицию на 1 ступень; увеличьте в 2 раза – экспозиция изменится в плюс на одну ступень, независимо от измененного параметра — диафрагмы или выдержки.

Треугольник экспозиции является основополагающий способ связывания трех переменных, определяющих экспозицию фотографии: диафрагмы, выдержки и ISO.

Чтобы достичь желаемого результата, нужно сбалансировать все три параметра, чтобы настроить один из них, требующий корректировки, по крайней мере, одного из других. Они не только влияют на экспозицию, но также являются крупнейшими определяющими факторами глобального внешнего вида изображения; таким образом, их мастерство абсолютно важно, как для техники, так и для композиции.

Сторона 1: Диафрагма

— это показатель того, насколько открыт или закрыто пропускающее свет отверстие объектива. Более широкая диафрагма (или малое f-число ) означает, что свет будет пропускаться через объектив, просто потому, что отверстие больше. Более узкая диафрагма (или большее значение f ) позволяет уменьшить интенсивность света, падающего на матрицу фотоаппарата.

Вы зададитесь вопросом, почему мы хотели бы, чтобы меньше света достигало матрицы. Ответ в большинстве случаев заключается в том, что мы хотим увеличить глубину резкости. Она является результатом изменения рассматриваемого параметра f. Узкая «диафрагма» (более высокие f-числа) дают большую глубину резкости, позволяя большему количеству сцены находиться в фокусе (более применимо в пейзажной съемке). Более широкие диафрагмы создают небольшую глубину резкости, которая может помочь отделить главный объект от фона и является одним из величайших композиционных инструментов в вашем распоряжении (актуально для портретной фотографии или макросъемки).

Вы также должны знать, что большинство объективов являются самыми резкими в диапазоне f/5.6 — f/8. Тем не менее, многие фотографы готовы жертвовать некоторой резкостью объекта, ради эффекта объема, предоставляемого широко открытой апертурой.

1 / 2500, f/2,2 при фокусном расстоянии 135 мм и ISO 100

Сторона 2: скорость затвора

Количество света, падающее на матрицу камеры зависит от размера , и промежутка времени в течение которого свет поступает на матрицу, этот промежуток времени называется — временем экспозиции, регулируемым путем изменения скорости затвора – то есть параметра выдержки при настройке фотоаппарата. Удлинение времени экспозиции увеличивает размытость изображения, в том числе размытость изображения из — за дрожания камеры, короткие выдержки способствуют получению более резкого изображения.

Количество света поступающего на матрицу камеры зависит от выдержки – времени экспозиции, также имеет непосредственное влияние на насыщенность цвета

Если вы фотографируете закат, или групповой портрет, для нормальной тональности и резкости снимков потребуются разные параметры экспозиции. Это два очень разных сценария освещения с двумя очень разными результатами.

Оптимальная экспозиция может быть определена как выдержка с помощью которой фотограф достигает нужного эффекта на снимке будь то размытость струй водопада или резкость репортажного снимка фиксирующего определенный момент.

С технической точки зрения матрица фотоаппарата имеет ограниченный диапазон полезной экспозиции, иногда называют его динамический диапазон . Если по какой — либо причине у части снимка, фактическая экспозиция находится за пределами этого диапазона, то сенсор фотокамеры выдает снимки с неправильной экспозицией. Например, изображения могут быть не экспонированными «темными» или «белыми» — передержанными, в обоих случаях идет потеря информации о оттенках цвета и тона, необходимых для описания «деталей». Таким образом, целью регулировки выдержки в камере является контроль физического количество света от предмета, которое воспринимается матрицей камеры, для максимальной детализации изображения.

Выдержка — это показатель того, как долго затвор фотокамеры остается открытым и, как долго матрица подвергается воздействию света. Более высокая скорость затвора дает датчику меньше времени для восприятия света и, следовательно, приводит к более низкой экспозиции. Более продолжительная выдержка позволяет свету поступать на сенсор дольше и это приводит к более высокой экспозиции.

Поэтому причиной, по которой мы будем использовать более короткие выдержки, является необходимость остановки движения, будь то дрожание камеры или движущийся объект, что позволяет нам сохранять резкость. Помните, что до тех пор, пока затвор открыт, камера по существу записывает положение всех объектов в кадре; если один из них перемещается, в результате появляется нежелательное размытие (хотя иногда оно и желательное, как при съемке дорог ночного города).

Использование больших выдержек может также создать очень приятные эффекты при фотографировании водоемов. 6s, f/16 на ф.р. 17 мм и ISO 100

Читайте для определения нужного вам времени экспозиции

Еще раз убедиться в важности этого параметра можно прочитав статьи:

Сторона 3: Светочувствительность

В прошлом, когда фотопленка правила балом, не было такой гибкости в управлении светочувствительностью, которую мы имеем сейчас. Можно сказать, что треугольник экспозиции был треугольником с фиксированной стороной – пленки. Можно было бы контролировать чувствительность к свету меняя пленку, которая использовалась в зеркалке, но как только рулон установлен в камере, его не меняли пока не закончится. В настоящее время мы можем контролировать чувствительность сенсора «на лету», хотя технически мы не контролируем чувствительность; фактически контролируется усиление пост-изображения, применяемое к сигналу, вы интерпретировать это как о чувствительность.

Увеличение ISO по существу позволяет работать в условиях меньшего освещения. Как всегда, есть компромисс: увеличение ISO приводит к увеличению шума и меньшей детализации. Шум является результатом случайных колебаний электрического сигнала. При более низких значениях ISO величина сигнала изображения велика относительно шума (отношение сигнал / шум), что означает, что шум обычно остается ненавязчивым. При работе с более высокими ИСО сигнал изображения обычно близок по величине к шуму, и, таким образом, шум входит в изображение.

Подумайте о сигнале изображения и шуме, как о корзине с шарами. Если мой сигнал изображения составляет 1000 шаров, я не буду замечать, добавляет ли шум 4 или 5 шаров. Если мой сигнал изображения невелик, скажем, 10 шаров, это будет очень заметно, если шум добавит 5 шаров к куче. Когда я усилю этот сигнал с помощью повышения ISO, относительно высокий уровень шума также будет значительно усилен.

Итак, зачем использовать высокое ISO? Зачастую, когда вы работаете в условиях низкой освещенности, используя максимально возможную диафрагму и самую длинную выдержку вы можете не повышать значение светочувствительности. В противном случае ваш единственный выбор – увеличить ISO. Объектив не может физически открывать себя шире и, как обсуждалось выше, жертвовать резкостью для более длинных выдержек, редко бывает целесообразным. Предпочтительно иметь немного зернистости и четкое изображение, чем более гладкое изображение с меньшей детализацией.

В этой комнате мало света, кроме крошечных огней музыкальных столов, которые вы видите в правом углу. 1/80s, f/2,8 на 200 мм и ISO 6400

Шаг значения экспозиции EV и стопы

Мы называем конкретную комбинацию диафрагмы, скорости затвора, а ISO — значением экспозиции (EV) и часто ссылаемся на её изменение, которое либо удваивает половину количества света, доходящего до сенсора. Здесь математика может немного раздражать. Например шаг изменения светочувствительности от ISO 200 до 400 — увеличение на один стоп; изменение от выдержки от 1/30 до 1/120 секунд (большинство камер сделают это до 1/ 125) уменьшением на два стопа. Однако f-стопы, соответствующие апертуре, расположены в геометрической серии, которая приблизительно аппроксимирует степени квадратного корня из двух, другими словами, в следующей последовательности, каждый новый f-стоп представляет собой уменьшение отверстия диафрагмы: f/1.4, f/2, f/2.8, f/4, f/5.6, f/ 8, f/11, f/16, f/22. Понят последовательность интуитивно как в случае выдержки или чувствительности («удвоением» или «уменьшение вдвое») невозможно? Просто запомните последовательность. Изменение одного из параметров треугольника экспозиции на стоп требует коррекции одного из двух других параметров. Например, переход от f/2.8 к f/8 означает уменьшение параметра на 3 стопа, поэтому мы теперь используем 1/2 * 1/2 * 1/2 = 1/8 поступающего в объектив света.

(Сторона 4: Стабилизация изображения)

Нет, треугольник экспозиции не превратился в квадрат экспозиции. Это всего лишь примечание о стабилизации изображения: помните, что это может помочь вам работать с более медленными скоростями затвора, которые позволяют использовать более узкие диафрагмы для большей глубины резкости или меньшие ISO. Однако не делайте ошибку, приравнивая дрожание камеры с движением объекта. Стабилизация изображения помогает только в первом случае, она идеально подходит для статических предметов.

Примеры

Давайте рассмотрим некоторые показательные примеры треугольника экспозиции.

Все кадры сделаны на 85 мм.

Обратите внимание, что каждый раз, когда я уменьшалась диафрагма на один стоп, также уменьшалась и скорость затвора на один стоп; таким образом, общая экспозиция одинакова в каждом снимке. Тем не менее, различия весьма заметны. В примере f/1.4 цветок в центре кадра довольно заметно отелен от фона. При f/8 глубина резкости намного больше; забор гораздо более заметен, и неясно, на чем сосредоточен акцент в фото. Кроме того, на последних двух изображениях есть риск получить смаз из-за дрожания камеры, фотографируя выдержкой медленнее, чем обратная величина фокусного расстояния, 1/85.

Два идентичных экспозиции снимка, с скорректированным ISO для компенсации выдержек при одинаковых параметрах диафрагмы.

Обратите внимание, что в последнем примере камера была зафиксирована в не достаточной степени для экспозиции 1/8 с на ф. р. 85 мм. Увеличивая скорость затвора на 4 стопа до разумной скорости для этого фокусного расстояния и компенсируя увеличение ISO на 4 стопа, можно получить резкое изображение с большой глубиной резкости. Помните, что высокое ISO и четкое изображение всегда предпочтительнее низкого ISO и размытого изображения.

Знание треугольника экспозиции имеет решающее значение для получения технически правильных фотографий и контроля над композицией. Поместите камеру в ручной режим и начните экспериментировать с тремя переменными. У вас появится интуитивное понимание зависимости экспозиции и композиции кадра от треугольника экспозиции.

Экспозиция находится под контролем трех составляющих: выдержки, диафрагмы и ISO. Понимание того, что такое «шаг» (здесь и далее: также широко используется термин «ступень» ) экспозиции, позволяет нам сопоставлять и изменять эти элементы так, чтобы получить желаемый результат.

Зачастую люди, которые занимаются фотографией, не до конца понимают, что такое шаг экспозиции или ошибочно предполагают, что это какой-то сложный термин. В действительности все достаточно просто.

Шаг — предполагает двукратное увеличение или сокращение количества света, попадающего во время съемки на светочувствительный элемент камеры.

Например, если фотограф говорит, что хочет увеличить экспозицию на один шаг, это означает, что он будет использовать в два раза больше света, чем во время прошлого снимка.

Шаг экспозиции является мерой, связанной с двукратным увеличением или уменьшением освещения. Автор фотографии Хамед Сабер .

Под экспозицией подразумевается количество света, которое запечатлеется на снимке, на нее влияет три фактора: длительность выдержки, размер диафрагмы и ISO, или светочувствительность фотоматериала. Все три фактора измеряются в разных единицах, поэтому было введено понятие шага — простого инструмента, необходимого для их сопоставления.

Шаг и выдержка

Выдержка, или скорость затвора, обозначает отрезок времени, в течение которого затвор камеры остается открытым. Чем дольше затвор открыт, тем больше света проникает, следовательно, тем сильнее экспозиция. Двукратное увеличение или уменьшение выдержки равнозначно повышению или понижению на 1 шаг экспозиции.

Типичные шаги экспозиции, выраженные через выдержку. Подписи (слева направо, сверху вниз): короче выдержка и меньше света; длиннее выдержка и больше света; 1 шаг; выдержка в секундах.

К примеру, переход от выдержки от 1/100 к 1/200 секунды в два раза снижает количество проникающего света, поэтому мы говорим, что мы снизили экспозицию на один шаг. По аналогии, переход с выдержки 1/60 на 1/30 секунды в два раза увеличивает количество света, т.е. экспозиция повышается на 1 шаг.

Большинство камер позволяют регулировать скорость затвора с точностью до 1/3 шага экспозиции, поэтому 3 сдвига регулировочного диска будут давать 1 полный шаг экспозиции.

Шаг и ISO

Параметр ISO обозначает то, насколько сенсор камеры чувствителен к свету, попадающему на него (в случае с аналоговой фотографией, ISO означает, насколько светочувствительна пленка ). Более чувствительный сенсор даст аналогичную экспозицию кадра при более слабом освещении — это позволит использовать более узкую диафрагму или короткую выдержку.

Типичные шаги экспозиции, выраженные через ISO. Подписи (слева направо, сверху вниз): ниже светосила и меньше света; выше светосила и больше света; 1 шаг; значения ISO.

ISO измеряется по шкале, схожей с ASA, используемой для пленки. Чем выше значение ISO, тем выше светочувствительность сенсора. Как и в случае с выдержкой, удвоение ISO приводит к повышению экспозиции на 1 шаг и наоборот, двукратное снижение ISO приводит к понижению экспозиции на 1 шаг.

К примеру, переключение с ISO 100 на ISO 200 удваивает чувствительность сенсора и повышает экспозицию на 1 шаг. Переход с ISO 800 на ISO 400, напротив, снижает экспозицию на 1 шаг. Большинство камер позволяют изменять ISO как раз на 1 шаг экспозиции при каждом переключении.

Шаг и значение диафрагмы

Изменение диафрагмы обозначается как «f-число» (также называют «f-шагом»), представляющее собой диаметр отверстия объектива. Чем ниже значение диафрагмы («f-число»), тем шире отверстие и больше света попадает на светочувствительный элемент. С другой стороны, чем выше значение диафрагмы, тем уже отверстие и меньше количество проникающего света.

Типичные шаги экспозиции, выраженные через значение диафрагмы. Подписи (слева направо, сверху вниз): выше значение диафрагмы, уже отверстие и меньше света; ниже значение диафрагмы, шире отверстие и больше света; 1 шаг, значения диафрагмы или «f-число».

Так как значения диафрагмы рассчитываются отдельно, числа не связаны просто с двукратным увеличением или уменьшением, вместо этого производится умножение или деление на 1,41 (квадратный корень 2). Например, переход от диафрагмы f/2.8 к f/4 является снижением экспозиции на 1 шаг и рассчитывается следующим образом: 4 = 2.8 * 1,41. А переключение с f/16 на f/11 является повышением экспозиции на 1 шаг и рассчитывается, как 11 = 16 / 1,41.

Как и в случае с выдержкой, большинство современных камер позволяют управлять диафрагмой с точностью до 1/3 шага экспозиции.

Шаг экспозиции — это универсальная величина

Самое больше преимущество, которое дает нам понимание термина шаг экспозиции, — это возможность сопоставлять выдержку, диафрагму и ISO. Благодаря этому мы с легкостью можем изменять эти факторы, сохраняя при этом общую экспозицию.

Предположим, вы делаете снимок, используя выдержку 1/60, диафрагму f/8 и ISO 200. Вы замечаете, что кадр хорошо экспонирован, но объект вышел несколько размытым. Поэтому вы решаете укоротить выдержку до 1/120 секунды.

Это изменение на 1 шаг сделало бы снимок темным, потому что в сравнении с прошлым кадром, теперь используется в два раза меньше света. Для того чтобы компенсировать эту разницу, вам необходимо будет вернуть экспозицию обратно на 1 шаг за счет других параметров. Это легко, так как у нас есть замечательный инструмент для сопоставления.

Можно сильнее открыть диафрагму, чтобы она пропускала больше света, переключив ее с f/8на f/5.6 (увеличение на 1 шаг экспозиции) — это приведет к возвращению к исходной экспозиции. Или же можно удвоить ISO, переключив с 200 на 400, что также даст увеличение на 1 шаг экспозиции.

Как вы видите, использование шага экспозиции является удобным инструментом, если вам необходимо подстроить камеру, не портя общую экспозицию снимка.

Учитывайте следующие факторы при настройке экспозиции

Регулируя три компонента экспозиции, вы должны помнить, что каждый из них оказывает особенное воздействие на фотографию. В некоторых случаях это воздействие может оказаться нежелательным.

Скорость затвора (выдержка) — если выдержка будет слишком длинной, снимок может получиться размытым из-за движения камеры или объекта.

Диафрагма — чем шире диафрагма, тем меньше глубина резкости, поэтому, используя самую широкую диафрагму, вы можете столкнуться с проблемой, как сохранить все необходимые элементы в фокусе. С другой стороны, малая глубина резкости может помочь выделить объект, что часто оказывается очень полезным — именно в таких случаях не стоит использовать закрытую диафрагму.

ISO — чем выше ISO, тем больше цифрового шума появляется на фотографиях. Из-за этого снимок может выглядеть слишком «зернистым» и нерезким.

Как и все в фотографии, настройка вышеописанных параметров представляет собой попытку отыскать идеальный баланс. Прежде всего необходимо решить, какой эффект вы хотите получить на снимке, и в соответствии с этим выбрать параметры, позволяющие реализовать задумку при минимальных возможных недостатках. Шаг экспозиции в данном процессе действительно является очень полезным инструментом, который помогает легко менять настройки и дает больше контроля над съемкой.

Пути и механизмы захвата внеклеточных везикул

1. Raposo G, Stoorvogel W. Внеклеточные везикулы: экзосомы, микровезикулы и друзья. Джей Селл Биол. 2013; 200:373–83. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

2. Théry C, Regnault A, Garin J, Wolfers J, Zitvogel L, Ricciardi-Castagnoli P, et al. Молекулярная характеристика экзосом, происходящих из дендритных клеток. Избирательное накопление белка теплового шока hsc73. Джей Селл Биол. 1999; 147: 599–610. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

3. Валади Х., Экстрем К., Боссиос А., Шёстранд М., Ли Дж. Дж., Лётвалл Дж. О. Опосредованный экзосомами перенос мРНК и микроРНК представляет собой новый механизм генетического обмена между клетками. Nat Cell Biol. 2007; 9: 654–9. [PubMed] [Google Scholar]

4. Jung T, Castellana D, Klingbeil P, Cuesta Hernández I, Vitacolonna M, Orlicky DJ и др. Зависимость CD44v6 от подготовки преметастатической ниши экзосомами. Неоплазия. 2009; 11:1093–105. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

5. Qu JL, Qu XJ, Zhao MF, Teng YE, Zhang Y, Hou KZ и др. Экзосомы рака желудка способствуют пролиферации опухолевых клеток посредством активации PI3K/Akt и MAPK/ERK. Копать печень Dis. 2009 г.;41:875–80. [PubMed] [Google Scholar]

6. Janowska-Wieczorek A, Wysoczynski M, Kijowski J, Marquez-Curtis L, Machalinski B, Ratajczak J, et al. Микровезикулы, полученные из активированных тромбоцитов, вызывают метастазирование и ангиогенез при раке легкого. Инт Джей Рак. 2005; 113: 752–60. [PubMed] [Google Scholar]

7. Аль-Майя А.Х., Айронс С.Л., Пинк Р.С., Картер Д.Р., Кадхим М.А. Возможная роль экзосом, содержащих РНК, в опосредовании нецелевого действия ионизирующего излучения. Радиационное разрешение 2012;177:539–45. [PubMed] [Google Scholar]

8. Clayton A, Harris CL, Court J, Mason MD, Morgan BP. Экзосомы антигенпрезентирующих клеток защищены от комплемент-опосредованного лизиса за счет экспрессии CD55 и CD59. Евр Дж Иммунол. 2003; 33: 522–31. [PubMed] [Google Scholar]

9. Raposo G, Nijman HW, Stoorvogel W, Liejendekker R, Harding CV, Melief CJ, et al. В-лимфоциты секретируют антигенпрезентирующие везикулы. J Эксперт Мед. 1996; 183:1161–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

10. Келлер С., Райдингер Дж., Рупп А.К., Янссен Дж.В., Альтевогт П. Экзосомы, полученные из жидкости организма, как новый шаблон для клинической диагностики. J Transl Med. 2011;9:86. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

11. Silverman JM, Clos J, de’Oliveira CC, Shirvani O, Fang Y, Wang C, et al. Путь секреции, основанный на экзосомах, отвечает за экспорт белка из Leishmania и связь с макрофагами. Дж. Клеточные науки. 2010; 123:842–52. [PubMed] [Google Scholar]

12. Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, et al. Диффузия крови и Th2-супрессивные эффекты галектин-9-содержащих экзосом, высвобождаемых инфицированными вирусом Эпштейна-Барр клетками карциномы носоглотки. Кровь. 2009 г.;113:1957–66. [PubMed] [Google Scholar]

13. Tang F, Kaneda M, O’Carroll D, Hajkova P, Barton SC, Sun YA, et al. Материнские микроРНК необходимы для зиготического развития мышей. Гены Дев. 2007; 21: 644–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

14. Jacobs LA, Bewicke-Copley F, Poolman MG, Pink RC, Mulcahy LA, Baker I, et al. Мета-анализ с использованием новой базы данных miRStress выявил микроРНК, которые часто связаны с реакцией на радиацию и гипоксию. ПЛОС Один. 2013;8:e80844. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

15. Мативанан С., Джи Х., Симпсон Р.Дж. Экзосомы: внеклеточные органеллы, важные для межклеточной коммуникации. J Протеомика. 2010;73:1907–20. [PubMed] [Google Scholar]

16. Camussi G, Deregibus MC, Bruno S, Cantaluppi V, Biancone L. Экзосомы/микровезикулы как механизм межклеточной коммуникации. почки инт. 2010;78:838–48. [PubMed] [Google Scholar]

17. Aliotta JM, Pereira M, Johnson KW, de Paz N, Dooner MS, Puente N, et al. Попадание микровезикул в клетки костного мозга опосредует тканеспецифические изменения мРНК путем прямой доставки мРНК и индукции транскрипции. эксп Гематол. 2010; 38: 233–45. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

18. Луо С.С., Исибаси О., Исикава Г., Исикава Т., Катаяма А., Мисима Т. и др. Трофобласты ворсинок человека экспрессируют и секретируют специфические для плаценты микроРНК в кровоток матери через экзосомы. Биол Репрод. 2009; 81: 717–29. [PubMed] [Google Scholar]

19. Ogorevc E, Kralj-Iglic V, Veranic P. Роль внеклеточных везикул в фенотипической трансформации рака. Радиол Онкол. 2013;47:197–205. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

20. Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. Доставка siRNA в мозг мыши путем системной инъекции экзосом-мишеней. Нац биотехнолог. 2011;29: 341–5. [PubMed] [Google Scholar]

21. Tang K, Zhang Y, Zhang H, Xu P, Liu J, Ma J и др. Доставка химиотерапевтических препаратов в микрочастицах опухолевых клеток. Нац коммун. 2012;3:1282. [PubMed] [Google Scholar]

22. Montecalvo A, Larregina AT, Shufesky WJ, Stolz DB, Sullivan ML, Karlsson JM, et al. Механизм переноса функциональных микроРНК между дендритными клетками мыши через экзосомы. Кровь. 2012; 119: 756–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

23. Atay S, Gercel-Taylor C, Taylor DD. Экзосомальный фибронектин, полученный из трофобласта человека, индуцирует провоспалительную продукцию IL-1β макрофагами. Am J Reprod Immunol. 2011;66:259–69. [PubMed] [Google Scholar]

24. Barrès C, Blanc L, Bette-Bobillo P, André S, Mamoun R, Gabius HJ, et al. Галектин-5 связывается с поверхностью экзосом ретикулоцитов крысы и модулирует поглощение везикул макрофагами. Кровь. 2010; 115: 696–705. [PubMed] [Google Scholar]

25. Christianson HC, Svensson KJ, van Kuppevelt TH, Li JP, Belting M. Экзосомы раковых клеток зависят от протеогликанов гепарансульфата клеточной поверхности для их интернализации и функциональной активности. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:17380–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

26. Svensson KJ, Christianson HC, Wittrup A, Bourseau-Guilmain E, Lindqvist E, Svensson LM, et al. Поглощение экзосом зависит от передачи сигналов ERK1/2-белком теплового шока 27 и опосредованного липидным рафтом эндоцитоза, отрицательно регулируемого кавеолином-1. Дж. Биол. Хим. 2013; 288:17713–24. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

27. Feng D, Zhao WL, Ye YY, Bai XC, Liu RQ, Chang LF, et al. Клеточная интернализация экзосом происходит посредством фагоцитоза. Движение. 2010; 11: 675–87. [PubMed] [Академия Google]

28. Fitzner D, Schnaars M, van Rossum D, Krishnamoorthy G, Dibaj P, Bakhti M, et al. Селективный перенос экзосом с олигодендроцитов на микроглию путем макропиноцитоза. Дж. Клеточные науки. 2011; 124:447–58. [PubMed] [Google Scholar]

29. Näslund TI, Paquin-Proulx D, Paredes PT, Vallhov H, Sandberg JK, Gabrielsson S. Экзосомы из грудного молока ингибируют инфицирование дендритных клеток ВИЧ-1 и последующий перенос вируса на CD4+. Т-клетки. СПИД. 2014; 28:171–80. [PubMed] [Академия Google]

30. Морелли А.Е., Ларрегина А.Т., Шуфески В.Дж., Салливан М.Л., Штольц Д.Б., Папворт Г.Д. и соавт. Эндоцитоз, внутриклеточная сортировка и процессинг экзосом дендритными клетками. Кровь. 2004; 104:3257–66. [PubMed] [Google Scholar]

31. Yuyama K, Sun H, Mitsutake S, Igarashi Y. Модулируемая сфинголипидами секреция экзосом способствует очищению микроглии от амилоида-β. Дж. Биол. Хим. 2012; 287:10977–89. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

32. Franzen CA, Simms PE, Van Huis AF, Foreman KE, Kuo PC, Gupta GN. Характеристика поглощения и интернализации экзосом клетками рака мочевого пузыря. Биомед Рез Инт. 2014;2014:619829. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

33. Tian T, Zhu YL, Hu FH, Wang YY, Huang NP, Xiao ZD. Динамика интернализации экзосом и трафика. J Cell Physiol. 2012; 228:1487–95. [PubMed] [Google Scholar]

34. Parolini I, Federici C, Raggi C, Lugini L, Palleschi S, De Milito A, et al. рН микроокружения является ключевым фактором для движения экзосом в опухолевых клетках. Дж. Биол. Хим. 2009; 284:34211–22. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

35. Назаренко И., Рана С., Бауманн А., МакАлиар Дж., Хеллвиг А., Тренделенбург М. и соавт. Тетраспанин Tspan8 клеточной поверхности вносит вклад в молекулярные пути индуцированной экзосомами активации эндотелиальных клеток. Рак Рез. 2010;70:1668–78. [PubMed] [Академия Google]

36. Pan Q, Ramakrishnaiah V, Henry S, Fouraschen S, de Ruiter PE, Kwekkeboom J, et al. Передача малой сайленсинговой РНК от клетки к клетке в печени может расширить терапевтический охват РНК-интерференции (РНКи) кишечника. 2012;61:1330–9. [PubMed] [Google Scholar]

37. Rana S, Yue S, Stadel D, Zöller M. К адаптированным экзосомам: экзосомальная тетраспаниновая сеть способствует выбору клеток-мишеней. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44:1574–84. [PubMed] [Google Scholar]

38. Zech D, Rana S, Büchler MW, Zöller M. Опухолевые экзосомы и активация лейкоцитов: амбивалентные перекрестные помехи. Сигнал сотовой связи. 2012;10:37. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

39. Obregon C, Rothen-Rutishauser B, Gitahi SK, Gehr P, Nicod LP. Экзовезикулы активированных дендритных клеток человека сливаются с покоящимися дендритными клетками, что позволяет им презентовать аллоантигены. Ам Джей Патол. 2006; 169:2127–36. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

40. Tian T, Wang Y, Wang H, Zhu Z, Xiao Z. Визуализация клеточного поглощения и внутриклеточного переноса экзосом с помощью микроскопии живых клеток. Джей Селл Биохим. 2010; 111:488–96. [PubMed] [Академия Google]

41. Escrevente C, Keller S, Altevogt P, Costa J. Взаимодействие и поглощение экзосом клетками рака яичников. БМК Рак. 2011;11:108. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

42. Keller S, König AK, Marmé F, Runz S, Wolterink S, Koensgen D, et al. Системное присутствие и стимулирующий рост опухоли эффект высвобождения экзосом карциномы яичника. Рак Летт. 2009; 278:73–81. [PubMed] [Google Scholar]

43. Xie Y, Zhang H, Li W, Deng Y, Munegowda MA, Chibbar R, et al. Дендритные клетки рекрутируют экзосомы Т-клеток через экзосомальный LFA-1, что приводит к ингибированию ответов CD8+CTL за счет подавления цитотоксичности, опосредованной пептидом/MHC класса I и Fas-лигандом. Дж Иммунол. 2010; 185:5268–78. [PubMed] [Академия Google]

44. Hao S, Bai O, Li F, Yuan J, Laferte S, Xiang J. Зрелые дендритные клетки с экзосомами стимулируют эффективные ответы цитотоксических Т-лимфоцитов и противоопухолевый иммунитет. Иммунология. 2007; 120:90–102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

45. Nanjundappa RH, Wang R, Xie Y, Umeshappa CS, Chibbar R, Wei Y, et al. GP120-специфическая направленная на экзосомы Т-клеточная вакцина, способная стимулировать DC- и CD4(+) Т-независимые ответы ЦТЛ. вакцина. 2011;29:3538–47. [PubMed] [Академия Google]

46. Темчура В.В., Тенбуш М., Нчинда Г., Наби Г., Типплер Б., Зеленюк М. и соавт. Усиление иммуностимулирующих свойств экзосомальных вакцин за счет включения компетентного по слиянию G-белка вируса везикулярного стоматита. вакцина. 2008; 26:3662–72. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]

47. Koumangoye RB, Sakwe AM, Goodwin JS, Patel T, Ochieng J. Отслоение клеток опухоли молочной железы вызывает быструю секрецию экзосом, которые впоследствии опосредуют клеточную адгезию и распространение. ПЛОС Один. 2011;6:e24234. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

48. Фаббри М., Паоне А., Калоре Ф., Галли Р., Гаудио Э., Сантанам Р. и соавт. МикроРНК связываются с Toll-подобными рецепторами, вызывая прометастатическую воспалительную реакцию. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2110–16. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

49. Tumne A, Prasad VS, Chen Y, Stolz DB, Saha K, Ratner DM, et al. Нецитотоксическое подавление транскрипции вируса иммунодефицита человека типа 1 экзосомами, секретируемыми CD8+ Т-клетками. Дж Вирол. 2009; 83: 4354–64. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

50. Rana S, Zöller M. Отбор клеток-мишеней экзосом и важность экзосомальных тетраспанинов: гипотеза. Биохим Сок Транс. 2011; 39: 559–62. [PubMed] [Google Scholar]

51. Record M, Carayon K, Poirot M, Silvente-Poirot S. Экзосомы как новые переносчики везикулярных липидов, участвующие в межклеточных коммуникациях и различных патофизиологиях. Биохим Биофиз Акта. 2014; 1841: 108–20. [PubMed] [Google Scholar]

52. Hemler ME. Функции тетраспанина и связанные с ними микродомены. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005; 6: 801–11. [PubMed] [Академия Google]

53. Zöller M. Tetraspanins: push and pull в подавлении и стимулировании метастазирования. Нат Рев Рак. 2009; 9:40–55. [PubMed] [Google Scholar]

54. Escola JM, Kleijmeer MJ, Stoorvogel W, Griffith JM, Yoshie O, Geuze HJ. Селективное обогащение тетраспановыми белками внутренних везикул мультивезикулярных эндосом и экзосом, секретируемых В-лимфоцитами человека. Дж. Биол. Хим. 1998; 273:20121–7. [PubMed] [Google Scholar]

55. Heijnen HF, Schiel AE, Fijnheer R, Geuze HJ, Sixma JJ. Активированные тромбоциты высвобождают два типа мембранных везикул: микровезикулы путем отщепления поверхности и экзосомы, возникающие в результате экзоцитоза мультивезикулярных телец и альфа-гранул. Кровь. 1999;94:3791–9. [PubMed] [Google Scholar]

56. Rubinstein E, Ziyyat A, Prenant M, Wrobel E, Wolf JP, Levy S, et al. Снижение фертильности самок мышей, лишенных CD81. Дев биол. 2006; 290:351-8. [PubMed] [Google Scholar]

57. Zhu GZ, Miller BJ, Boucheix C, Rubinstein E, Liu CC, Hynes RO, et al. Остатки SFQ (173–175) в большой внеклеточной петле CD9 необходимы для слияния гамет. Разработка. 2002; 129:1995–2002. [PubMed] [Google Scholar]

58. Хелминг Л., Гордон С. Молекулярная основа слияния макрофагов. Иммунобиология. 2007; 212: 785–9.3. [PubMed] [Google Scholar]

59. Рубинштейн Э., Зийят А., Вольф Дж. П., Ле Наур Ф., Буше С. Молекулярные участники слияния сперматозоидов и яйцеклеток у млекопитающих. Semin Cell Dev Biol. 2006; 17: 254–63. [PubMed] [Google Scholar]

60. Такеда Ю., Татибана И., Миядо К., Кобаяши М., Миядзаки Т., Фунакоси Т. и др. Тетраспанины CD9 и CD81 предотвращают слияние мононуклеарных фагоцитов. Джей Селл Биол. 2003; 161: 945–56. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

61. Тали М. Роль тетраспанинов в репликации ВИЧ-1. Курр Топ Микробиол Иммунол. 2009 г.;339:85–102. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

62. Леви С., Шохам Т. Сеть тетраспанина модулирует иммунные сигнальные комплексы. Нат Рев Иммунол. 2005; 5: 136–48. [PubMed] [Google Scholar]

63. Вьюгина Ю., Эванс Дж.П. Новое понимание молекулярных основ взаимодействия сперматозоидов и яйцеклеток млекопитающих. Фронт биосай. 2008; 13: 462–76. [PubMed] [Google Scholar]

64. Джонстон Р.М. Биологическое значение экзосом: краткий обзор. Клетки крови Мол Дис. 2006; 36: 315–21. [PubMed] [Академия Google]

65. Lakkaraju A, Rodriguez-Boulan E. Бродячие экзосомы: новые роли в клеточной и тканевой полярности. Тенденции клеточной биологии. 2008; 18: 199–209. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

66. Schorey JS, Bhatnagar S. Функция экзосом: от иммунологии опухолей до биологии патогенов. Движение. 2008; 9: 871–81. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

67. Лебретон А., Серафин Б. Контроль качества, опосредованный экзосомами: рекрутирование субстрата и молекулярная активность. Биохим Биофиз Акта. 2008;1779: 558–65. [PubMed] [Google Scholar]

68. Aplin AE, Howe A, Alahari SK, Juliano RL. Передача сигнала и модуляция сигнала рецепторами клеточной адгезии: роль интегринов, кадгеринов, молекул иммуноглобулина-клеточной адгезии и селектинов. Pharmacol Rev. 1998; 50:197–263. [PubMed] [Google Scholar]

69. Marlin SD, Springer TA. Очищенная молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) представляет собой лиганд для клеток, ассоциированных с функцией лимфоцитов антигена 1 (LFA-1). 1987; 51: 813–19. [PubMed] [Академия Google]

70. Нольте-т Хоен Э.Н., Бушоу С.И., Андертон С.М., Стурфогель В., Ваубен М.Х. Активированные Т-клетки рекрутируют экзосомы, секретируемые дендритными клетками через LFA-1. Кровь. 2009; 113:1977–81. [PubMed] [Google Scholar]

71. Hwang I, Shen X, Sprent J. Прямая стимуляция наивных Т-клеток мембранными везикулами из антигенпрезентирующих клеток: разные роли молекул CD54 и B7. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100:6670–5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

72. Ханаяма Р., Танака М., Мива К., Шинохара А., Ивамацу А., Нагата С. Идентификация фактора, который связывает апоптотические клетки с фагоцитами. Природа. 2002; 417:182–7. [PubMed] [Академия Google]

73. Shukla D, Liu J, Blaiklock P, Shworak NW, Bai X, Esko JD, et al. Новая роль 3-O-сульфатированного гепарансульфата в проникновении вируса простого герпеса 1. Клетка. 1999; 99:13–22. [PubMed] [Google Scholar]

74. Garcia-Vallejo JJ, van Kooyk Y. Физиологическая роль DC-SIGN: рассказ о мышах и людях. Тренды Иммунол. 2013; 34: 482–6. [PubMed] [Google Scholar]

75. Flanagan MD, Lin S. Цитохалазины блокируют удлинение актиновых филаментов путем связывания с высокоаффинными сайтами, связанными с F-актином. Дж. Биол. Хим. 1980;255:835–8. [PubMed] [Google Scholar]

76. Lamaze C, Fujimoto LM, Yin HL, Schmid SL. Актиновый цитоскелет необходим для рецептор-опосредованного эндоцитоза в клетках млекопитающих. Дж. Биол. Хим. 1997; 272:20332–5. [PubMed] [Google Scholar]

77. Obregon C, Rothen-Rutishauser B, Gerber P, Gehr P, Nicod LP. Активное поглощение экзовезикул, происходящих из дендритных клеток, эпителиальными клетками индуцирует высвобождение медиаторов воспаления через TNF-альфа-опосредованный путь. Ам Джей Патол. 2009;175:696–705. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

78. Doherty GJ, McMahon HT. Механизмы эндоцитоза. Анну Рев Биохим. 2009; 78: 857–902. [PubMed] [Google Scholar]

79. Skokos D, Botros HG, Demeure C, Morin J, Peronet R, Birkenmeier G, et al. Экзосомы, происходящие из тучных клеток, индуцируют фенотипическое и функциональное созревание дендритных клеток и вызывают специфические иммунные ответы in vivo. Дж Иммунол. 2003; 170:3037–45. [PubMed] [Google Scholar]

80. Izquierdo-Useros N, Naranjo-Gómez M, Archer J, Hatch SC, Erkizia I, Blanco J, et al. Захват и перенос частиц ВИЧ-1 зрелыми дендритными клетками сходятся с путем экзосом-диссеминации. Кровь. 2009 г.;113:2732–41. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

81. Miyanishi M, Tada K, Koike M, Uchiyama Y, Kitamura T, Nagata S. Идентификация Tim4 как рецептора фосфатидилсерина. Природа. 2007; 450:435–9. [PubMed] [Google Scholar]

82. Паскетто М.В., Веккиа Л., Ковини Д., Диджилио Р., Скотти С. Направленная доставка лекарств с использованием иммуноконъюгатов: принципы и применение. J Иммунотер. 2011;34:611–28. [PubMed] [Google Scholar]

83. Кирххаузен Т. Клатрин. Анну Рев Биохим. 2000;69: 699–727. [PubMed] [Google Scholar]

84. Ван Л.Х., Ротберг К.Г., Андерсон Р.Г. Неправильная сборка клатриновых решеток на эндосомах обнаруживает регуляторный переключатель для образования покрытых ямок. Джей Селл Биол. 1993; 123:1107–17. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

85. Валле Р.Б., Герсковиц Дж.С., Агаджанян Дж.Г., Берджесс С.С., Шпетнер Х.С. Динамин, ГТФаза, участвующая в начальных стадиях эндоцитоза. Сиба нашел симптом. 1993; 176:185–93. обсуждение 93–7. [PubMed] [Google Scholar]

86. Herskovits JS, Burgess CC, Obar RA, Vallee RB. Влияние мутантного крысиного динамина на эндоцитоз. Джей Селл Биол. 1993;122:565–78. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

87. Ehrlich M, Boll W, Van Oijen A, Hariharan R, Chandran K, Nibert ML, et al. Эндоцитоз случайным инициированием и стабилизацией ямок, покрытых клатрином. Клетка. 2004; 118: 591–605. [PubMed] [Google Scholar]

88. Merrifield CJ, Feldman ME, Wan L, Almers W. Визуализация рекрутирования актина и динамина во время инвагинации одиночных ямок, покрытых клатрином. Nat Cell Biol. 2002; 4: 691–8. [PubMed] [Google Scholar]

89. Taylor MJ, Lampe M, Merrifield CJ. Петля обратной связи между рекрутированием динамина и актина во время клатрин-опосредованного эндоцитоза. PLoS биол. 2012;10:e1001302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

90. Damke H, Baba T, Warnock DE, Schmid SL. Индукция мутантного динамина специфически блокирует образование пузырьков, покрытых эндоцитами. Джей Селл Биол. 1994; 127:915–34. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

91. Marks B, Stowell MH, Vallis Y, Mills IG, Gibson A, Hopkins CR, et al. ГТФазная активность динамина и связанное с этим изменение конформации необходимы для эндоцитоза. Природа. 2001; 410: 231–5. [PubMed] [Google Scholar]

92. Chappie JS, Acharya S, Leonard M, Schmid SL, Dyda F. Димеризация домена G контролирует активность ГТФазы, стимулируемую сборкой динамина. Природа. 2010; 465:435–40. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

93. Ачирилоайе М., Барилко Б., Албанеси Дж. П. Существенная роль домена гомологии динамин-плекстрина в рецептор-опосредованном эндоцитозе. Мол Селл Биол. 1999;19:1410–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

94. Lee A, Frank DW, Marks MS, Lemmon MA. Доминантно-негативное ингибирование рецептор-опосредованного эндоцитоза мутантом динамина-1 с дефектным доменом гомологии плекстрина. Карр Биол. 1999; 9: 261–4. [PubMed] [Google Scholar]

95. Vallis Y, Wigge P, Marks B, Evans PR, McMahon HT. Важность домена гомологии плекстрина динамина в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Карр Биол. 1999;9:257–60. [PubMed] [Google Scholar]

96. Ramachandran R, Pucadyil TJ, Liu YW, Acharya S, Leonard M, Lukiyanchuk V, et al. Мембранная вставка вариабельной петли 1 домена гомологии плекстрина является критической для катализируемого динамином расщепления везикул. Мол Биол Селл. 2009;20:4630–9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

97. Benmerah A, Bayrou M, Cerf-Bensussan N, Dautry-Varsat A. Ингибирование сборки покрытых клатрином ямок мутантом Eps15. Дж. Клеточные науки. 1999; 112:1303–11. [PubMed] [Академия Google]

98. Андерсон Р.Г. Мембранная система кавеол. Анну Рев Биохим. 1998; 67: 199–225. [PubMed] [Google Scholar]

99. Курщалия ТВ, Партон Р.Г. Мембранные микродомены и кавеолы. Curr Opin Cell Biol. 1999; 11: 424–31. [PubMed] [Google Scholar]

100. Nabi IR, Le PU. Кавеолы/рафт-зависимый эндоцитоз. Джей Селл Биол. 2003; 161: 673–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

101. Партон Р.Г., Саймонс К. Многоликость кавеол. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8: 185–9.4. [PubMed] [Google Scholar]

102. Ньютон А.Дж., Кирххаузен Т., Мурти В.Н. Ингибирование динамина полностью блокирует компенсаторный эндоцитоз синаптических пузырьков. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:17955–60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

103. Nanbo A, Kawanishi E, Yoshida R, Yoshiyama H. ​​Экзосомы, полученные из инфицированных вирусом Эпштейна-Барра клеток, интернализуются посредством кавеолярно-зависимого эндоцитоза и способствуют фенотипической модуляции в клетки-мишени. Дж Вирол. 2013;87:10334–47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

104. Menck K, Klemm F, Gross JC, Pukrop T, Wenzel D, Binder C. Индукция и транспорт Wnt 5a во время индуцированной макрофагами злокачественной инвазии опосредуется двумя типами внеклеточных везикул. Онкотаргет. 2013;4:2057–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

105. Orth JD, Krueger EW, Cao H, McNiven MA. Большая ГТФаза динамин регулирует образование и движение актиновых комет в живых клетках. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:167–72. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

106. Razani B, Engelman JA, Wang XB, Schubert W, Zhang XL, Marks CB, et al. Мыши с отсутствием кавеолина-1 жизнеспособны, но демонстрируют признаки гиперпролиферативных и сосудистых аномалий. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:38121–38. [PubMed] [Google Scholar]

107. Swanson JA. Формирование чашечек в фагосомы и макропиносомы. Nat Rev Mol Cell Biol. 2008; 9: 639–49. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

108. Kerr MC, Teasdale RD. Определение макропиноцитоза. Движение. 2009; 10: 364–71. [PubMed] [Академия Google]

109. Grimmer S, van Deurs B, Sandvig K. Взрывы мембран и макропиноцитоз в клетках A431 требуют холестерина. Дж. Клеточные науки. 2002; 115: 2953–62. [PubMed] [Google Scholar]

110. Ahram M, Sameni M, Qiu RG, Linebaugh B, Kirn D, Sloane BF. Rac1-индуцированный эндоцитоз связан с внутриклеточным протеолизом во время миграции через трехмерный матрикс. Разрешение ячейки опыта. 2000; 260: 292–303. [PubMed] [Google Scholar]

111. Ридли А.Дж. Rho GTPases и динамика актина в выпячиваниях мембраны и переносе везикул. Тенденции клеточной биологии. 2006; 16: 522–9.. [PubMed] [Google Scholar]

112. Sanz-Moreno V, Gadea G, Ahn J, Paterson H, Marra P, Pinner S, et al. Активация и инактивация Rac контролируют пластичность движения опухолевых клеток. Клетка. 2008; 135:510–23. [PubMed] [Google Scholar]

113. Rudt S, Müller RH. Анализ фагоцитоза in vitro нано- и микрочастиц методом хемилюминесценции. III. Поглощение частиц с модифицированной поверхностью разного размера и его корреляция со свойствами частиц и распределением in vivo. Eur J Pharm Sci. 1993;1:31–9. [Google Scholar]

114. Стивенс Л., Эллсон С., Хокинс П. Роль PI3K в хемотаксисе и фагоцитозе лейкоцитов. Curr Opin Cell Biol. 2002; 14: 203–13. [PubMed] [Google Scholar]

115. Фадок В.А., Фелькер Д.Р., Кэмпбелл П.А., Коэн Дж.Дж., Браттон Д.Л., Хенсон П.М. Воздействие фосфатидилсерина на поверхность апоптотических лимфоцитов вызывает специфическое распознавание и удаление макрофагами. Дж Иммунол. 1992; 148:2207–16. [PubMed] [Google Scholar]

116. Shiratsuchi A, Kaido M, Takizawa T, Nakanishi Y. Фосфатидилсерин-опосредованный фагоцитоз инфицированных вирусом гриппа клеток мышиными перитонеальными макрофагами. Дж Вирол. 2000;74:9240–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

117. Фомина А.Ф., Диринк Т.Дж., Эллисман М.Х., Кахалан М.Д. Регуляция мембранного транспорта и субклеточной организации эндоцитарных компартментов, обнаруженная с помощью FM1-43 в покоящихся и активированных Т-клетках человека. Разрешение ячейки опыта. 2003; 291:150–66. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

118. Simons K, Ehehalt R. Холестерин, липидные рафты и болезни. Джей Клин Инвест. 2002; 110: 597–603. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

119. Тесье Э., Пешер Э.И. Липиды как модуляторы слияния мембран, опосредованного вирусными слитыми белками. Eur Biophys J. 2007; 36: 887–99. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

120. Palecek SP, Schmidt CE, Lauffenburger DA, Horwitz AF. Динамика интегрина в области хвоста мигрирующих фибробластов. Дж. Клеточные науки. 1996; 109: 941–52. [PubMed] [Google Scholar]

121. Глебов О.О., Брайт Н.А., Николс Б.Дж. Флотиллин-1 определяет клатрин-независимый эндоцитарный путь в клетках млекопитающих. Nat Cell Biol. 2006; 8: 46–54. [PubMed] [Академия Google]

122. Фрик М., Брайт Н.А., Риенто К., Брей А., Меррифед С., Николс Б.Дж. Совместная сборка флотиллинов индуцирует образование мембранных микродоменов, искривление мембраны и почкование пузырьков. Карр Биол. 2007; 17:1151–6. [PubMed] [Google Scholar]

123. Volonte D, Galbiati F, Li S, Nishiyama K, Okamoto T, Lisanti MP. Флотилины/кавателлины по-разному экспрессируются в клетках и тканях и образуют гетероолигомерный комплекс с кавеолином in vivo. Характеристика и картирование эпитопов нового зонда моноклонального антитела флотиллин-1. Дж. Биол. Хим. 1999;274:12702–9. [PubMed] [Google Scholar]

124. Bickel PE, Scherer PE, Schnitzer JE, Oh P, Lisanti MP, Lodish HF. Флотиллин и эпидермальный поверхностный антиген определяют новое семейство интегральных мембранных белков, ассоциированных с кавеолами. Дж. Биол. Хим. 1997; 272:13793–802. [PubMed] [Google Scholar]

125. Отто Г.П., Николс Б.Дж. Роль микродоменов флотиллина – эндоцитоз и не только. Дж. Клеточные науки. 2011; 124:3933–40. [PubMed] [Google Scholar]

126. Wang E, Norred WP, ​​Bacon CW, Riley RT, Merrill AH. Ингибирование биосинтеза сфинголипидов фумонизинами. Последствия для заболеваний, связанных с Fusarium moniliforme. Дж. Биол. Хим. 1991;266:14486–90. [PubMed] [Google Scholar]

127. Platt FM, Neises GR, Dwek RA, Butters TD. N-бутилдезоксиногиримицин является новым ингибитором биосинтеза гликолипидов. Дж. Биол. Хим. 1994; 269:8362–5. [PubMed] [Google Scholar]

128. Ян Р., Ланг Т., Зюдхоф Т.С. Слияние мембран. Клетка. 2003; 112: 519–33. [PubMed] [Google Scholar]

129. Черномордик Л.В., Меликян Г.Б., Чизмаджев Ю.А. Слияние биомембран: новая концепция, основанная на модельных исследованиях с использованием двух взаимодействующих плоских липидных бислоев. Биохим Биофиз Акта. 1987;906:309–52. [PubMed] [Google Scholar]

130. Черномордик Л.В., Козлов М.М. Механика слияния мембран. Nat Struct Mol Biol. 2008; 15: 675–83. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

131. Ян Р., Südhof TC. Слияние мембран и экзоцитоз. Анну Рев Биохим. 1999; 68: 863–911. [PubMed] [Google Scholar]

132. Валапала М., Вишваната Дж. К. Эндоцитоз липидного рафта и экзосомальный транспорт облегчают внеклеточный перенос аннексина А2. Дж. Биол. Хим. 2011; 286:30911–25. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

133. Yuana Y, Sturk A, Nieuwland R. Внеклеточные везикулы при физиологических и патологических состояниях. Blood Rev. 2013; 27:31–9. [PubMed] [Google Scholar]

134. Logozzi M, De Milito A, Lugini L, Borghi M, Calabrò L, Spada M, et al. Высокий уровень экзосом, экспрессирующих CD63 и кавеолин-1, в плазме больных меланомой. ПЛОС Один. 2009;4:e5219. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

135. Kharaziha P, Ceder S, Li Q, Panaretakis T. Экзосомы, полученные из опухолевых клеток: сообщение в бутылке. Биохим Биофиз Акта. 2012; 1826: 103–11. [PubMed] [Академия Google]

136. Маркус М.Э., Леонард Дж.Н. FedExosomes: инженерные терапевтические биологические наночастицы, которые действительно доставляют. Pharmaceuticals (Базель) 2013;6:659–80. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

137. Pegtel DM, Cosmopoulos K, Thorley-Lawson DA, van Eijndhoven MA, Hopmans ES, Lindenberg JL, et al. Функциональная доставка вирусных микроРНК через экзосомы. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107:6328–33. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

138. Zitvogel L, Regnault A, Lozier A, Wolfers J, Flament C, Tenza D, et al. Эрадикация укоренившихся опухолей мышей с использованием новой бесклеточной вакцины: экзосом, полученных из дендритных клеток. Нат Мед. 1998;4:594–600. [PubMed] [Google Scholar]

139. Casella JF, Flanagan MD, Lin S. Цитохалазин D ингибирует полимеризацию актина и индуцирует деполимеризацию актиновых филаментов, образующихся при изменении формы тромбоцитов. Природа. 1981; 293: 302–5. [PubMed] [Google Scholar]

140. Броули С.Х., Робинсон К.Р. Лечение цитохалазином нарушает эндогенные токи, связанные с поляризацией клеток в фукоидных зиготах: исследования роли F-актина в эмбриогенезе. Джей Селл Биол. 1985; 100:1173–84. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

141. Селден С.К., Рабинович П.С., Шварц С.М. Влияние агентов, разрушающих цитоскелет, на репликацию эндотелия крупного рогатого скота. J Cell Physiol. 1981; 108: 195–211. [PubMed] [Google Scholar]

142. Cantley LC. Путь фосфоинозитид-3-киназы. Наука. 2002; 296:1655–7. [PubMed] [Google Scholar]

143. Гринберг С. Сигнальная трансдукция фагоцитоза. Тенденции клеточной биологии. 1995; 5: 93–99. [PubMed] [Google Scholar]

144. Хазеки О., Хазеки К., Катада Т., Уи М. Ингибирующее действие вортманнина на фосфатидилинозитол-3-киназу-опосредованные клеточные события. J Липидно-медиатный клеточный сигнал. 1996;14:259–61. [PubMed] [Google Scholar]

145. Рыцарь З.А. Низкомолекулярные ингибиторы семейства PI3-киназ. Курр Топ Микробиол Иммунол. 2010; 347: 263–78. [PubMed] [Google Scholar]

146. Араки Н., Джонсон М.Т., Суонсон Дж.А. Роль фосфоинозитид-3-киназы в завершении макропиноцитоза и фагоцитоза макрофагами. Джей Селл Биол. 1996; 135:1249–60. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

147. Prieto-Sánchez RM, Berenjeno IM, Bustelo XR. Участие члена семейства Rho/Rac RhoG в кавеолярном эндоцитозе. Онкоген. 2006;25:2961–73. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

148. Rappoport JZ, Heyman KP, Kemal S, Simon SM. Динамика динамина при клатрин-опосредованном эндоцитозе в клетках PC12. ПЛОС Один. 2008;3:e2416. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

149. Ормерод К.Г., Рогашевская Т.П., Корссен Дж.Р., Мерсье А.Дж. Независимые от холестерина эффекты метил-β-циклодекстрина на химические синапсы. ПЛОС Один. 2012;7:e36395. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

150. Steinman RM, Mellman IS, Muller WA, Cohn ZA. Эндоцитоз и рециркуляция плазматической мембраны. Джей Селл Биол. 1983;96:1–27. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

151. McNeil PL, Steinhardt RA. Потеря, восстановление и поддержание целостности плазматической мембраны. Джей Селл Биол. 1997; 137:1–4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

152. Lundmark R, Doherty GJ, Howes MT, Cortese K, Vallis Y, Parton RG, et al. Белок GRAF1, активирующий ГТФазу, регулирует эндоцитарный путь CLIC/GEEC. Карр Биол. 2008; 18:1802–8. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

153. Stoeck A, Keller S, Riedle S, Sanderson MP, Runz S, Le Naour F, et al. Роль экзосом в конститутивном и индуцированном стимулом расщеплении эктодомена L1 и CD44. Биохим Дж. 2006; 393: 609–18. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]

154. Хакулинен Дж., Юнниккала С., Сорса Т., Мери С. Белок мембранного кофактора ингибитора комплемента (MCP; CD46) конститутивно выделяется из мембран раковых клеток в везикулах и преобразуется металлопротеиназы в функционально активную растворимую форму. Евр Дж Иммунол. 2004; 34:2620–9. [PubMed] [Google Scholar]

155. Hawari FI, Rouhani FN, Cui X, Yu ZX, Buckley C, Kaler M, et al. Высвобождение полноразмерного рецептора 1 ФНО 55 кДа в экзосомоподобных везикулах: механизм образования растворимых рецепторов цитокинов. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101:1297–302. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Внеклеточные везикулы: уникальные межклеточные средства доставки

1. Cocucci E, et al. Выпадающие микровезикулы: артефактов больше нет. Тенденции клеточной биологии. 2009;19(2):43–51. doi: 10.1016/j.tcb.2008.11.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

2. Valadi H, et al. Опосредованный экзосомами перенос мРНК и микроРНК представляет собой новый механизм генетического обмена между клетками. Nat Cell Biol. 2007; 9: 654–659. [PubMed] [Академия Google]

3. Skog J, et al. Микровезикулы глиобластомы транспортируют РНК и белок, которые способствуют росту опухоли и обеспечивают диагностические биомаркеры. Nat Cell Biol. 2008;10(12):1470–1476. дои: 10.1038/ncb1800. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

4. Ткач М., Тери С. Связь внеклеточными везикулами: где мы находимся и куда нам нужно идти. Клетка. 2016;164(6):1226–1232. doi: 10.1016/j.cell.2016.01.043. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

5. Abels ER, Breakefield XO. Введение во внеклеточные везикулы — биогенез, выбор груза РНК, содержание, высвобождение и поглощение. Селл Мол Нейробиол. 2016;36(3):301–312. doi: 10.1007/s10571-016-0366-z. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

6. Lo Cicero A, et al. Внеклеточные везикулы перетасовывают межклеточные сообщения: к добру или к худу. Curr Opin Cell Biol. 2015;35:69–77. doi: 10.1016/j.ceb.2015.04.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

7. Kowal J, et al. Протеомное сравнение определяет новые маркеры для характеристики гетерогенных популяций подтипов внеклеточных везикул. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(8):E968–E977. doi: 10.1073/pnas.1521230113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

8. Lai RC, et al. МСК секретируют как минимум 3 типа EV, каждый из которых имеет уникальную перестановку мембранных липидов, белков и РНК. J Внеклеточные везикулы. 2016;5:29828. doi: 10.3402/jev.v5.29828. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

9. van Balkom BW, et al. Количественный и качественный анализ малых РНК в эндотелиальных клетках и экзосомах человека дает представление о локализованном процессинге, деградации и сортировке РНК. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:26760. doi: 10.3402/jev.v4.26760. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

10. Koppers-Lalic D, et al. Добавление нематричных нуклеотидов отличает состав малых РНК в клетках от экзосом. Cell Rep. 2014;8(6):1649–1658. doi: 10.1016/j.celrep.2014.08.027. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

11. Коулман Б.М., Хилл А.Ф. Внеклеточные везикулы — их роль в упаковке и распространении неправильно свернутых белков, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Semin Cell Dev Biol. 2015;40:89–96. doi: 10.1016/j.semcdb.2015.02.007. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

12. Хосино А. и др. Интегрины экзосом опухоли определяют органотропное метастазирование. Природа. 2015; 527(7578):329–335. doi: 10.1038/nature15756. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

13. Pitt JM, et al. Внеклеточные везикулы: мастера межклеточной коммуникации и потенциальные клинические вмешательства. Джей Клин Инвест. 2016;126(4):1139–1143. doi: 10.1172/JCI87316. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

14. Hong X, et al. Щелевые контакты модулируют инвазию глиомы путем прямого переноса микроРНК. Онкотаргет. 2015;6(17):15566–15577. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

15. Connor Y, et al. Связь между опухолевыми клетками и эндотелием, опосредованная физическим наноразмерным каналом, модулирует эндотелиальный фенотип. Нац коммун. 2015;6:8671. doi: 10.1038/ncomms9671. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

16. Osswald M, et al. Злокачественная клеточная сеть в глиомах: потенциальные клинические последствия. Нейро Онкол. 2016;18(4):479–485. doi: 10.1093/neuonc/now014. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

17. Gan X, Gould SJ. Идентификация ингибирующего сигнала почкования, который блокирует высвобождение частиц ВИЧ и белков экзосом/микровезикул. Мол Биол Селл. 2011;22(6):817–830. дои: 10.1091/mbc.E10-07-0625. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

18. Nabhan JF, et al. Формирование и высвобождение опосредованных белком 1 микровезикул (ARMM), содержащих домен аррестина, на плазматической мембране за счет рекрутирования белка TSG101. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(11):4146–4151. doi: 10.1073/pnas.1200448109. [Статья PMC бесплатно] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

19. Rilla K, et al. Покрытые гиалуроновой кислотой внеклеточные везикулы — новая связь между гиалуроновой кислотой и раком. Adv Рак Res. 2014; 123:121–148. дои: 10.1016/B978-0-12-800092-2.00005-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

20. Minciacchi VR, et al. Внеклеточные везикулы при раке: экзосомы, микровезикулы и новая роль крупных онкосом. Semin Cell Dev Biol. 2015;40:41–51. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

21. Di Vizio D, et al. Большие онкосомы в тканях рака предстательной железы человека и в кровообращении мышей с метастатическим заболеванием. Ам Джей Патол. 2012;181(5):1573–1584. doi: 10.1016/j.ajpath.2012.07.030. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

22. Linares R, et al. Высокоскоростное центрифугирование вызывает агрегацию внеклеточных везикул. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:29509. doi: 10.3402/jev.v4.29509. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

23. Record M, et al. Экзосомы как новые переносчики везикулярных липидов, участвующие в межклеточных коммуникациях и различных патофизиологиях. Биохим Биофиз Акта. 2014; 1841(1):108–120. doi: 10. 1016/j.bbalip.2013.10.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

24. Ярмалавичюте А., Пиворюнас А. Экзосомы как потенциальные новые терапевтические средства против нейродегенеративных заболеваний. Фармакол рез. 2016 6 февраля; doi: 10.1016/j.phrs.2016.02.002. Epub перед печатью. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

25. Lener T, et al. Применение терапевтических средств на основе внеклеточных везикул в клинических испытаниях – документ с изложением позиции ISEV. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:30087. doi: 10.3402/jev.v4.30087. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

26. Jia S, et al. Новые технологии молекулярной диагностики на основе внеклеточных везикул. Эксперт Rev Mol Diagn. 2014;14(3):307–321. doi: 10.1586/14737159.2014.893828. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

27. Christ L, et al. Клеточные функции и молекулярные механизмы механизма разрыва мембран ESCRT. Тенденции биохимических наук. 2016 23 сентября; Epub перед печатью. [PubMed] [Академия Google]

28. Chiaruttini N, et al. Расслабление нагруженных спиральных пружин ESCRT-III вызывает деформацию мембраны. Клетка. 2015;163(4):866–879. doi: 10.1016/j.cell.2015.10.017. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

29. McCullough J, et al. Структура и активность ремоделирования мембран спиральных полимеров ESCRT-III. Наука. 2015;350(6267):1548–1551. doi: 10.1126/science.aad8305. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

30. Lee IH, et al. Отрицательная кривизна мембраны катализирует зарождение эндосомального сортирующего комплекса, необходимого для сборки транспорта (ESCRT)-III. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(52):15892–15897. doi: 10.1073/pnas.1518765113. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

31. Trajkovic K, et al. Церамид запускает отпочкование везикул экзосом в мультивезикулярные эндосомы. Наука. 2008; 319:1244–1247. [PubMed] [Google Scholar]

32. Kajimoto T, et al. Продолжающаяся активация рецепторов сфингозин-1-фосфата опосредует созревание экзосомальных мультивезикулярных эндосом. Нац коммун. 2013;4:2712. doi: 10.1038/ncomms3712. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

33. Theos AC, et al. Зависимый от люменального домена путь сортировки к внутрипросветным пузырькам мультивезикулярных эндосом, участвующих в морфогенезе органелл. Ячейка Дев. 2006;10(3):343–354. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

34. van Niel G, et al. Тетраспанин CD63 регулирует ESCRT-независимую и -зависимую эндосомальную сортировку во время меланогенеза. Ячейка Дев. 2011;21(4):708–721. doi: 10.1016/j.devcel.2011.08.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

35. Colombo M, et al. Анализ функций ESCRT в биогенезе, составе и секреции экзосом подчеркивает гетерогенность внеклеточных везикул. Дж. Клеточные науки. 2013; 126 (часть 24): 5553–5565. doi: 10.1242/jcs.128868. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

36. Stuffers S, et al. Биогенез мультивезикулярных эндосом в отсутствие ESCRT. Движение. 2009;10(7):925–937. doi: 10.1111/j. 1600-0854.2009.00920.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

37. Babst M. Образование пузырьков MVB: ESCRT-зависимое, ESCRT-независимое и все, что между ними. Curr Opin Cell Biol. 2011;23(4):452–457. doi: 10.1016/j.ceb.2011.04.008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

38. Jimenez AJ, et al. Оборудование ESCRT требуется для восстановления плазматической мембраны. Наука. 2014;343(6147):1247136. doi: 10.1126/science.1247136. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

39. Andrews NW, et al. Контроль повреждений: клеточные механизмы восстановления плазматической мембраны. Тенденции клеточной биологии. 2014;24(1):734–742. doi: 10.1016/j.tcb.2014.07.008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

40. Clark MR. Переворачивание липидов. Нат Иммунол. 2011;12(5):373–375. doi: 10.1038/ni.2024. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

41. Hugel B, et al. Мембранные микрочастицы: две стороны медали. Физиология (Bethesda) 2005; 20:22–27. [PubMed] [Google Scholar]

42. Tuck S. Внеклеточные везикулы: почкование регулируется транслоказой фосфатидилэтаноламина. Карр Биол. 2011;21(24):R988–990. doi: 10.1016/j.cub.2011.11.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

43. Wehman AM, et al. Р4-АТФаза ТАТ-5 ингибирует отпочкование внеклеточных везикул у эмбрионов C. elegans. Карр Биол. 2011;21(23):1951–1959. doi: 10.1016/j.cub.2011.10.040. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

44. Bianco F, et al. Активность кислой сфингомиелиназы запускает высвобождение микрочастиц из глиальных клеток. EMBO J. 2009;28(8):1043–1054. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

45. Awojoodu AO, et al. Кислая сфингомиелиназа активируется в серповидноклеточных эритроцитах и ​​способствует образованию воспалительных микрочастиц при ВСС. Кровь. 2014;124(12):1941–1950. doi: 10.1182/blood-2014-01-543652. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

46. Hoehn RS, et al. Ингибирование кислой сфингомиелиназы в сохраненных эритроцитах уменьшает воспаление легких, связанное с переливанием крови. Энн Сург. 2016 27 января; Epub перед печатью. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

47. McConnell RE, et al. Микроворсинки энтероцитов представляют собой органеллы, генерирующие везикулы. Клеточная биол. 2009;185(7):1285–1298. doi: 10.1083/jcb.200

7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

48. Rilla K, et al. Продукция гиалуроновой кислоты усиливает выделение микровезикул, происходящих из плазматической мембраны. Разрешение ячейки опыта. 2013;319(13): 2006–2018 гг. doi: 10.1016/j.yexcr.2013.05.021. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

49. Wood CR, et al. Ресничка секретирует биоактивные эктосомы. Карр Биол. 2013;23(10):906–911. doi: 10.1016/j.cub.2013.04.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

50. Colombo M, et al. Биогенез, секреция и межклеточные взаимодействия экзосом и других внеклеточных везикул. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014; 30: 255–289. doi: 10.1146/annurev-cellbio-101512-122326. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]

51. Ostrowski M, et al. Rab27a и Rab27b контролируют разные этапы пути секреции экзосом. Nat Cell Biol. 2010;12(1):19–30. doi: 10.1038/ncb2000. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

52. Hsu C, et al. Регуляция секреции экзосом с помощью Rab35 и его белков, активирующих ГТФазу TBC1D10A-C. Джей Селл Биол. 2010; 189: 223–232. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

53. Hyenne V, et al. RAL-1 контролирует биогенез мультивезикулярных тел и секрецию экзосом. Джей Селл Биол. 2015;211(1):27–37. doi: 10.1083/jcb.201504136. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

54. Sinha S, et al. Кортактин способствует секреции экзосом, контролируя динамику разветвленного актина. Джей Селл Биол. 2016;214(2):197–213. doi: 10.1083/jcb.201601025. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

55. Hoshino D, et al. Секреция экзосом усиливается за счет инвадоподий и вызывает инвазивное поведение. Cell Rep. 2013;5(5):1159–68. doi: 10.1016/j.celrep.2013.10.050. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

56. Costa-Silva B, et al. Экзосомы рака поджелудочной железы инициируют формирование преметастатической ниши в печени. Nat Cell Biol. 2015;17(6):816–826. дои: 10.1038/ncb3169. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

57. Mulcahy LA, et al. Пути и механизмы захвата внеклеточных везикул. J Экстраселл Вес. 2014:3. doi: 10.3402/jev.v3.24641. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

58. Parolini I, et al. рН микроокружения является ключевым фактором для движения экзосом в опухолевых клетках. Дж. Биол. Хим. 2009; 284:34211–34222. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

59. Heusermann W, et al. Экзосомы путешествуют по филоподиям, чтобы проникнуть в клетки в эндоцитарных горячих точках, перемещаться внутри эндосом и нацеливаются на ER. Джей Селл Биол. 2016;213(2):173–184. doi: 10.1083/jcb.201506084. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

60. Stalder L, et al. Грубый эндоплазматический ретикулум является центральным местом зародышеобразования siRNA-опосредованного сайленсинга РНК. EMBO J. 2013;32(8):1115–1127. doi: 10.1038/emboj.2013.52. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

61. Li S, et al. МикроРНК ингибируют трансляцию мРНК-мишеней в эндоплазматическом ретикулуме арабидопсиса. Клетка. 2013;153(3):562–574. doi: 10.1016/j.cell.2013.04.005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

62. Барман Б., Бхаттачария С.Н. Нацеливание мРНК на эндоплазматический ретикулум предшествует взаимодействию с белками назад и опосредованной микроРНК (миРНК) репрессии трансляции в клетках млекопитающих. Дж. Биол. Хим. 2015;290(41):24650–24656. doi: 10.1074/jbc.C115.661868. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

63. Sung BH, et al. Направленное движение клеток через ткани контролируется секрецией экзосом. Нац коммун. 2015;6:7164. doi: 10.1038/ncomms8164. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

64. Zomer A, et al. Визуализация in vivo показывает опосредованное внеклеточными везикулами фенокопирование метастатического поведения. Клетка. 2015;161(5):1046–1057. doi: 10.1016/j.cell.2015.04.042. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

65. Маджумдар R1, TTA, родитель CA. Экзосомы опосредуют высвобождение LTB4 во время хемотаксиса нейтрофилов. PLoS биол. 2016;14(1):e1002336. doi: 10.1371/journal.pbio.1002336. [Статья PMC бесплатно] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]Retracted

66. Luga V, et al. Экзосомы опосредуют стромальную мобилизацию аутокринной передачи сигналов Wnt-PCP при миграции клеток рака молочной железы. Клетка. 2012;151(7):1542–1556. doi: 10.1016/j.cell.2012.11.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

67. Mu W, et al. Модуляция матрицы хозяина опухолевыми экзосомами способствует подвижности и инвазивности. Неоплазия. 2013;15(8):875–887. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

68. Sedgwick AE, et al. Внеклеточные микровезикулы и инвадоподии опосредуют неперекрывающиеся способы инвазии опухолевых клеток. Научный доклад 2015; 5:14748. doi: 10.1038/srep14748. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

69. Clancy JW, et al. Регулируемая доставка молекулярного груза в инвазивные микровезикулы опухолевого происхождения. Нац коммун. 2015;6:6919. doi: 10.1038/ncomms7919. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

70. Roche PA, Furuta K. Все тонкости процессинга и презентации антигена, опосредованного MHC класса II. Нат Рев Иммунол. 2015;15(4):203–216. doi: 10.1038/nri3818. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

71. Buschow SI, et al. MHC II в дендритных клетках нацелен на лизосомы или индуцированные Т-клетками экзосомы через различные пути мультивезикулярного тела. Движение. 2009;10(10):1528–1542. doi: 10.1111/j.1600-0854.2009.00963.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

72. Thery C, et al. Непрямая активация наивных CD4+ Т-клеток экзосомами, происходящими из дендритных клеток. Нат Иммунол. 2002;3:1145–1162. [PubMed] [Google Scholar]

73. Segura E, et al. ICAM-1 на экзосомах из зрелых дендритных клеток имеет решающее значение для эффективного праймирования наивных Т-клеток. Кровь. 2005;106(1):216–223. [PubMed] [Академия Google]

74. Кази К.Р. и др. Нагруженные антигеном экзосомы сами по себе индуцируют память Th2-типа через механизм, зависящий от В-клеток. Кровь. 2009;113(12):2673–2683. doi: 10.1182/blod-2008-04-153536. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

75. Mittelbrunn M, et al. Однонаправленный перенос экзосом, нагруженных микроРНК, от Т-клеток к антигенпрезентирующим клеткам. Нац коммун. 2011;2:282. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

76. Choudhuri K, et al. Поляризованное высвобождение микровезикул, обогащенных Т-клеточными рецепторами, в иммунологическом синапсе. Природа. 2014;507(7490): 118–123. doi: 10.1038/nature12951. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

77. Montecalvo A, et al. Механизм переноса функциональных микроРНК между дендритными клетками мыши через экзосомы. Кровь. 2012; 119: 756–766. [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

78. Okoye IS, et al. Экзосомы, полученные из Т-регуляторных клеток, содержащие микроРНК, подавляют патогенные Т-хелперные клетки 1. Иммунитет. 2014;41(1):89–103. doi: 10.1016/j.immuni.2014.05.019. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

79. Fabbri M, et al. МикроРНК связываются с Toll-подобными рецепторами, вызывая прометастатическую воспалительную реакцию. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2110–2116. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

80. Phinney DG, et al. Мезенхимальные стволовые клетки используют внеклеточные везикулы для аутсорсинга митофагии и челночных микроРНК. Нац коммун. 2015;6:8472. doi: 10.1038/ncomms9472. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

81. Yáñez-Mó M, et al. Биологические свойства внеклеточных везикул и их физиологические функции. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:27066. doi: 10.3402/jev.v4.27066. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

82. Greco V, et al. Аргосомы: потенциальное средство распространения морфогенов через эпителий. Клетка. 2001;106(5):633–45. [PubMed] [Google Scholar]

83. Gross JC, et al. Активные белки Wnt секретируются экзосомами. Nat Cell Biol. 2012;14(10):1036–1045. [PubMed] [Google Scholar]

84. Beckett K, et al. Клетки Drosophila S2 секретируют wingless на экзосомоподобных везикулах, но градиент wingless формируется независимо от экзосом. Движение. 2013;14(1):82–96. doi: 10.1111/tra.12016. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

85. Vyas N, et al. Hedgehog позвоночных секретируется на двух типах внеклеточных везикул с разными сигнальными свойствами. Научный доклад 2014; 4: 7357. doi: 10.1038/srep07357. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

86. Stoffel W, et al. Нейтральная сфингомиелиназа 2 (smpd3) в контроле постнатального роста и развития. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(12):4554–4559. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

87. Aubin I, et al. Делеция в гене, кодирующем сфингомиелинфосфодиэстеразу 3 (Smpd3), приводит к несовершенному остеогенезу и дентиногенезу у мышей. Нат Жене. 2005;37(8):803–805. [PubMed] [Академия Google]

88. Singh RK, et al. Роль Rab27 в хемотаксисе нейтрофилов и рекрутировании легких. BMC клеточная биология. 2014;15:39. doi: 10.1186/s12860-014-0039-z. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

89. Wilson SM, et al. Мутация в Rab27a вызывает дефекты транспорта везикул, наблюдаемые у пепельных мышей. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(14):7933–7938. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

90. Tolmachova T, et al. Общая роль Rab27a в секреторных клетках. Мол Биол Селл. 2004;15(1):332–344. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

91. Толмачева Т. и соавт. Rab27b регулирует количество и секрецию плотных гранул тромбоцитов. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(14):5872–5877. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]

92. Komada M, Soriano P. Hrs, FYVE finger белок, локализованный в ранних эндосомах, вовлечен в везикулярный трафик и необходим для морфогенеза вентральной укладки. Гены Дев. 1999;13(11):1475–1485. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

93. Wagner KU, et al. Tsg101 необходим для роста, пролиферации и выживания клеток эмбриональных и взрослых тканей. Мол Селл Биол. 2003;23(1):150–162. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

94. Satir P, et al. Первичная ресничка с первого взгляда. Дж. Клеточные науки. 2010; 123 (часть 4): 499–503. doi: 10.1242/jcs.050377. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

95. Nozawa YI, et al. Передача сигналов Hedgehog от первичной реснички к ядру: возникающая картина локализации ресничек, транспорта и трансдукции. Curr Opin Genet Dev. 2013;23(4):429–437. doi: 10.1016/j.gde.2013.04.008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

96. Cao M, et al. Однонаправленный транспорт белков цилиарной мембраны с помощью цитоплазматического ретроградного мотора IFT и отщепление цилиарной эктосомы. Элиф. 2015:4. doi: 10.7554/eLife.05242. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

97. Wang J, et al. Ресничные сенсорные нейроны C. elegans высвобождают внеклеточные везикулы, которые функционируют при общении с животными. Карр Биол. 2014;24(5):519–525. doi: 10.1016/j.cub.2014.01.002. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

98. Maguire JE, et al. Миристоилированный CIL-7 регулирует биогенез цилиарных внеклеточных везикул. Мол Биол Селл. 2015;26(15):2823–2832. doi: 10.1091/mbc.E15-01-0009. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

99. Ван Дж., Барр М.М. Ресничные внеклеточные везикулы: органеллы Txt msg. Селл Мол Нейробиол. 2016;36(3):449–457. doi: 10.1007/s10571-016-0345-4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

100. Wood CR, Rosenbaum JL. Ресничные эктосомы: передачи от клеточной антенны. Тенденции клеточной биологии. 2015;25(5):276–285. doi: 10.1016/j.tcb.2014.12.008. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

101. Dubreuil V, et al. Срединное тело и первичная ресничка нервных предшественников высвобождают внеклеточные мембранные частицы, обогащенные маркером стволовых клеток prominin-1. Джей Селл Биол. 2007; 176(4):483–49.5. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

102. Miyado K, et al. Способность к слиянию сперматозоидов обеспечивается CD9-содержащими везикулами, высвобождаемыми из яйцеклеток у мышей. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(35):12921–12926. doi: 10.1073/pnas.0710608105. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

103. Bianchi E, et al. Juno является рецептором Izumo яйца и необходим для оплодотворения млекопитающих. Природа. 2014;508(7497):483–487. doi: 10.1038/nature13203. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

104. Desrochers LM, et al. Микровезикулы обеспечивают механизм межклеточной коммуникации эмбриональных стволовых клеток во время имплантации эмбриона. Нац коммун. 2016;7:11958. doi: 10.1038/ncomms11958. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

105. Corrigan L, et al. BMP-регулируемые экзосомы из мужских половых желез дрозофилы перепрограммируют поведение самок. Джей Селл Биол. 2014;206(5):671–688. doi: 10.1083/jcb.201401072. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

106. Korkut C, et al. Регуляция постсинаптической ретроградной передачи сигналов путем высвобождения пресинаптической экзосомы. Нейрон. 2013;77(6):1039–1046. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

107. Korkut C, et al. Транссинаптическая передача везикулярных сигналов Wnt через Evi/Wntless. Клетка. 2009;139(2):393–404. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

108. Koles K, et al. Механизм равномерности прерванного (Evi)-экзосомного высвобождения в синаптических бутонах. Дж. Биол. Хим. 2012;287(20):16820–16834. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

109. Lopez-Verrilli MA, et al. Экзосомы, полученные из шванновских клеток, усиливают регенерацию аксонов в периферической нервной системе. Глия. 2013;61(11):1795–1806. [PubMed] [Google Scholar]

110. Lopez-Leal R, Court FA. Экзосомы шванновских клеток опосредуют связь между нейронами и глией и усиливают регенерацию аксонов. Селл Мол Нейробиол. 2016;36(3):429–436. doi: 10.1007/s10571-015-0314-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

111. Frühbeis C, et al. Запускаемый нейротрансмиттерами перенос экзосом опосредует связь олигодендроцитов с нейронами. PLoS биол. 2013;11(7):e1001604. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

112. Fröhlich D, et al. Многогранные эффекты олигодендроглиальных экзосом на нейроны: влияние на скорость возбуждения нейронов, передачу сигнала и регуляцию генов. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2014;369(1652) [бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

113. Gong J, et al. Экзосомы опосредуют независимую от клеточного контакта передачу сигналов ephrin-Eph во время ведения аксонов. Джей Селл Биол. 2016;214(1):35–44. doi: 10.1083/jcb.201601085. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

114. Ханахан Д., Вайнберг Р.А. Отличительные признаки рака: следующее поколение. Клетка. 2011;144(5):646–647. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

115. Zomer A, van Rheenen J. Влияние переноса внеклеточных везикул на клеточную гетерогенность при раке: каковы потенциальные клинические последствия? Рак Рез. 2016;76(8):2071–2075. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-15-2804. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

116. Al-Nedawi K, et al. Эндотелиальная экспрессия аутокринного VEGF при поглощении микровезикул опухолевого происхождения, содержащих онкогенный EGFR. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:3794–3799. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

117. Kucharzewska P, et al. Экзосомы отражают гипоксический статус клеток глиомы и опосредуют зависимую от гипоксии активацию сосудистых клеток во время развития опухоли. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(18):7312–7317. doi: 10.1073/pnas.1220998110. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

118. Webber JP, et al. Дифференцировка опухоль-стимулирующих стромальных миофибробластов раковыми экзосомами. Онкоген. 2015;34(3):290–302. doi: 10.1038/onc.2013.560. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

119. Zou W, et al. Блокада пути PD-L1 (B7-h2) и PD-1 для лечения рака: механизмы, биомаркеры ответа и комбинации. Sci Transl Med. 2016;8(328):328rv4. doi: 10.1126/scitranslmed.aad7118. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

120. Noy ​​R, Pollard JW. Опухолеассоциированные макрофаги: от механизмов к терапии. Иммунитет. 2014;41(1):49–61. doi: 10.1016/j.immuni. 2014.06.010. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

121. de Vrij J, et al. Внеклеточные везикулы, происходящие из глиобластомы, модифицируют фенотип моноцитарных клеток. Инт Джей Рак. 2015;137(7):1630–1642. doi: 10.1002/ijc.29521. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

122. van der Vos KE, et al. Непосредственно визуализированные внеклеточные везикулы, полученные из глиобластомы, переносят РНК в микроглию / макрофаги в головном мозге. Нейро Онкол. 2016;18(1):58–69. doi: 10.1093/neuonc/nov244. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

123. Pucci F, et al. Макрофаги SCS подавляют меланому, ограничивая взаимодействие везикул-В-клеток, происходящих из опухоли. Наука. 2016;352(6282):242–246. doi: 10.1126/science.aaf1328. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

124. Wieckowski EU, et al. Опухолевые микровезикулы способствуют экспансии регуляторных Т-клеток и индуцируют апоптоз в опухолереактивных активированных CD8+ Т-лимфоцитах. Дж Иммунол. 2009;183(6):3720–3730. doi: 10.4049/jиммунол.0

125. Kelleher RJ, et al. Внеклеточные везикулы, присутствующие в микроокружении опухоли яичников человека, вызывают фосфатидилсерин-зависимую остановку Т-клеточного сигнального каскада. Рак Иммунол Рез. 2015;3(11):1269–1278. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-15-0086. [Статья PMC бесплатно] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

126. Kaplan RN, et al. VEGFR1-положительные гемопоэтические предшественники костного мозга инициируют преметастатическую нишу. Природа. 2005; 438 (7069): 820–827. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

127. Peinado H, et al. Экзосомы меланомы обучают клетки-предшественники костного мозга прометастатическому фенотипу посредством MET. Нат Мед. 2012;18(6):883–891. doi: 10.1038/nm.2753. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

128. Zhang L, et al. Индуцированная микросредой потеря PTEN экзосомальной микроРНК стимулирует рост метастазов в головной мозг. Природа. 2015; 527(7576):100–104. doi: 10.1038/nature15376. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

129. Vella LJ, et al. Сосредоточьтесь на внеклеточных везикулах: экзосомы и их роль в транспортировке белков и потенциал биомаркеров при болезни Альцгеймера и Паркинсона. Int J Mol Sci. 2016; 17(2) doi: 10.3390/ijms17020173. пий: E173. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

130. Квек С., Хилл А.Ф. Роль внеклеточных везикул при нейродегенеративных заболеваниях. Biochem Biophys Res Commun. 2016 19 сентября; Epub перед печатью. [Google Scholar]

131. Mays CE, Soto C. Стресс прионной болезни. Мозг Res. 2016; 1648 (часть Б): 553–560. doi: 10.1016/j.brainres.2016.04.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

132. Vella LJ, et al. Упаковка прионов в экзосомы связана с новым путем процессинга PrP. Джей Патол. 2007; 211: 582–59.0. [PubMed] [Google Scholar]

133. Dinkins MB, et al. Уменьшение количества экзосом in vivo связано с более низкой нагрузкой амилоидными бляшками в мышиной модели болезни Альцгеймера 5XFAD. Нейробиол Старение. 2014;35(8):1792–1800. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.02.012. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

134. Laurén J, et al. Клеточный прионный белок опосредует нарушение синаптической пластичности бета-амилоидными олигомерами. Природа. 2009;457(7233):1128–1132. doi: 10.1038/nature07761. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

135. An K, et al. Экзосомы нейтрализуют разрушающую синаптическую пластичность активность сборок Aβ in vivo. Мол Мозг. 2013;6:47. дои: 10.1186/1756-6606-6-47. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

136. Ramirez A, et al. Наследственный паркинсонизм с деменцией вызывается мутациями в АТФ13А2, кодирующем лизосомальную АТФазу Р-типа 5 типа. Нат Жене. 2006;38(10):1184–1191. [PubMed] [Google Scholar]

137. Kong SM, et al. PARK9 человека, связанный с болезнью Паркинсона/ATP13A2 поддерживает гомеостаз цинка и способствует экстернализации α-синуклеина через экзосомы. Хум Мол Жене. 2014;23(11):2816–2833. doi: 10.1093/hmg/ddu099. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

138. Tsunemi T, et al. ATP13A2/PARK9 регулирует секрецию экзосом и α-синуклеина. Дж. Нейроски. 2014;34(46):15281–15287. doi: 10.1523/JNEUROSCI.1629-14.2014. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

139. Danzer KM, et al. Экзосомальная передача олигомеров альфа-синуклеина от клетки к клетке. Мол Нейродегенер. 2012;7:42. дои: 10.1186/1750-1326-7-42. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

140. Mao X, et al. Патологическая передача α-синуклеина, инициируемая связыванием гена активации лимфоцитов 3. Наука. 2016;353(6307) pii: aah4374. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

Внеклеточные везикулы в клеточной биологии и медицине

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют новую парадигму как в клеточной биологии, так и в медицине; в частности, идея о том, что сам функциональный контент может быть доставлен непосредственно в клетки. ЭВ представляют собой клеточные мембранные структуры, которые работают как межклеточные коммуникаторы, выполняя свою функцию путем транспортировки своего груза, который включает нуклеиновые кислоты, белки и липиды. ЭВ играют важную роль в нормальной физиологии, а также в патологической коммуникации, например, при раке. Считается, что ЭВ доставляют онкогенные молекулы (такие как белки, пептиды, РНК…) в соседние клетки, усиливая размножение неопластических клеток. Неудивительно, что исследования EV стали обычным явлением во всех областях биомедицины, исследуясь как диагностика и терапия.

В этом сборнике собраны оригинальные статьи, посвященные изучению применения внеклеточных везикул в диагностике и терапии, а также сообщающие о достижениях в области биологии ЭВ и методологических инструментах для их изучения.

Внеклеточные везикулы при заболеваниях

В статьях, собранных в этом сборнике, раскрывается ряд способов, с помощью которых ВВ могут служить для идентификации заболеваний, например: ассоциированная с ВВ миРНК плевральной жидкости и лаважей обеспечивает неиспользованный источник биомаркеров рака легких диагноз ¹ ; химиорезистентность при колоректальном раке можно предсказать посредством оценки экзосомальной circRNA ² , или экзосомальные микроРНК могут служить для идентификации и прогнозирования метастатического колоректального рака ³ ; и снижение содержания Gelsolin в плазменных EV действует как биомаркер деменции с тельцами Леви, отличая этих пациентов от пациентов с болезнью Альцгеймера ⁴ .

Другие статьи, включенные в сборник, посвящены изучению использования электромобилей в терапии. Показано, что для лечения заболеваний, связанных с иммунитетом, применение воспалительного стимула улучшает противовоспалительный и/или иммунодепрессивный потенциал EV, секретируемых жировыми мезенхимальными стволовыми клетками ⁵ . Цитопротекция подвергнутых стрессу кардиомиоцитов за счет использования EVs, полученных из мезенхимальных стромальных клеток ⁶ , и профилактика глюкокортикоид-индуцированного остеопороза посредством подавления ферроптического пути остеобластов с помощью EVs, извлеченных из костномозгового эндотелиального предшественника ⁷ , также были продемонстрированы. Помимо применения встречающихся в природе электромобилей, в одной из опубликованных оригинальных статей продемонстрированы искусственные электромобили как возможный терапевтический инструмент. Сделай и др. . разработали химерный белок путем слияния лизосомальной β-глюкоцереброзидазы человека (GBA) с белком, закрепляющим экзосомы; этот химерный белок был успешно секретирован в EV и доставлен в клетки-реципиенты, обеспечивая потенциальную стратегию лечения лизосомных болезней накопления ⁸ .

Биология внеклеточных везикул и эндогенная функция

Коллекция также расширяет наши знания о биологии и функции ВВ. Например, в двух статьях изучались липидом и гликаны EV, подчеркивая профиль липидома как возможный маркер, позволяющий отличить экзосомы от микровезикул ⁹ , и идентификация гликанов как ключевых игроков в настройке поглощения EV посредством эффектов на основе заряда, прямого распознавания гликанов или того и другого ¹⁰ . Также были изучены другие роли EVs, такие как oviductal EVs, модулирующие функцию сперматозоидов и оплодотворение ^-11, или EVs из старых астроцитов, ингибирующие созревание клеток-предшественников олигодендроцитов в олигодендроциты ¹². Кроме того, участие ЭВ в формировании преметастатической ниши ¹³ , или нейропротекторную роль ЭВ, содержащих цистатин С ¹⁴ , также исследовали.

Инструменты и методы исследования внеклеточных везикул

Учитывая размер и гетерогенность ВВ, их изоляция, обнаружение и характеристика по-прежнему остаются сложной задачей, хотя предпринимаются большие усилия для улучшения методологических инструментов для изучения ВВ. Сообщалось о новом водном двухфазном системном протоколе выделения ЭВ с высокой эффективностью и чистотой ¹⁵ . В другой статье сообщается о новом методе иммуномаркировки EV, который может быть включен в существующие протоколы NTA для определения концентрации частиц, распределения по размерам и поверхностного фенотипа образцов EV ¹⁶ . Кроме того, был разработан основанный на люминесценции анализ поглощения EV, четко различающий поглощение EV и связывание EV с клеткой-мишенью ¹⁷ . Наконец, была создана индуцируемая мышь CD9-GFP, обеспечивающая инструмент, который позволяет маркировать EV специфичным для типа клеток способом, одновременно позволяя in vivo эксперименты ¹⁸ .

Большое спасибо всем участникам (авторам и рецензентам) этого сборника.

Ссылки

1. Роман-Канал, Б. и др. . Связанные с EV миРНК из плеврального лаважа как потенциальные диагностические биомаркеры при раке легкого. Науч. 9 , 1–9 (2019).

   КАС Статья Google ученый

2. Хон, К. В., Аб-Муталиб, Н. С., Абдулла, Н. М. А., Джамал, Р. и Абу, Н. Циркулярные РНК, полученные из внеклеточных везикул, обеспечивают химиорезистентность при колоректальном раке. Науч. 9 , 1–13 (2019).

   Артикул Google ученый

3. де Мигель Перес, Д. и др. . Внеклеточные везикулы-миРНК как биомаркеры жидкой биопсии для выявления заболевания и прогноза у пациентов с метастатическим колоректальным раком. Науч. 10 , 1–13 (2020).

   Артикул Google ученый

4. Гамес-Валеро, А., Кампделакреу, Дж., Ренье, Р., Бейер, К. и Боррас, Ф.Э. Комплексное протеомное профилирование полученных из плазмы внеклеточных везикул у пациентов с деменцией с тельцами Леви. Науч. 9 , 1–13 (2019).

   Артикул Google ученый

5. An, J. H., Li, Q., Bhang, D. H., Song, W. J. & Youn, H. Y. Примированные TNF-α и INF-γ внеклеточные везикулы, полученные из стволовых клеток собак, облегчают экспериментальный колит у мышей. Науч. Реп 10 , 1–14 (2020).

   Артикул Google ученый

6. Коре, Р. А. и др. . Молекулярные события в цитопротекции, опосредованной экзосомами МСК, в кардиомиоцитах. Науч. 9 , 1–12 (2019).

   Артикул Google ученый

7. Lu, J., Yang, J., Zheng, Y., Chen, X. & Fang, S. Внеклеточные везикулы из эндотелиальных клеток-предшественников предотвращают вызванный стероидами остеопороз путем подавления ферроптотического пути в остеобластах мыши на основе биоинформатики. доказательство. науч. 9 , 1–18 (2019).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

8. До, М. А., Леви, Д., Браун, А., Марриотт, Г. и Лу, Б. Направленная доставка лизосомальных ферментов в эндоцитарное отделение клеток человека с использованием сконструированных внеклеточных везикул. Науч. 9 , 1–11 (2019).

   Артикул Google ученый

9. Singhto, N., Vinaiphat, A. & Thongboonkerd, V. Дискриминация мочевых экзосом из микровезикул с помощью липидомики с использованием тонкослойной жидкостной хроматографии (ТСХ) в сочетании с масс-спектрометрией MALDI-TOF. Науч. 9 , 1–11 (2019).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

10. Уильямс, К. и др. . Оценка роли поверхностных гликанов внеклеточных везикул в клеточном поглощении. Науч. 9 , 1–14 (2019).

    Артикул Google ученый

11. Ferraz, M., de, A.M.M., Carothers, A., Dahal, R., Noonan, M.J. & Songsasen, N. Внеклеточные везикулы яйцевода взаимодействуют с головкой и средней частью сперматозоида и улучшают его подвижность и способность к оплодотворению у домашней кошки. Науч. 9 , 1–12 (2019).

    Артикул Google ученый

12. Уиллис, К. М. и др. . Поддержка астроцитов для дифференцировки олигодендроцитов может передаваться через внеклеточные везикулы, но уменьшается с их помощью. Возраст. науч. 10 , 1–14 (2020).

    Артикул Google ученый

13. Тубита, В. и др. 906:20 . Эффект иммуносупрессии в миРНК из внеклеточных везикул колоректального рака и их влияние на преметастатическую нишу. Науч. 9 , 1–11 (2019).

    КАС Статья Google ученый

14. Перес-Гонсалес, Р. и др. . Нейропротекция, опосредованная внеклеточными везикулами, нагруженными цистатином С. Науч. Респ. 9 , 11104 (2019).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

15. Кирбаш, О.К. и др. . Оптимизированное выделение внеклеточных везикул из различных органических источников с использованием водной двухфазной системы. Науч. 9 , 1–11 (2019).

    Артикул Google ученый

16. Тейн, К. Э., Дэвис, А. М. и Хоффман, А. М. Усовершенствованные методы флуоресцентной маркировки и обнаружения одиночных внеклеточных везикул с использованием анализа отслеживания наночастиц. Науч. 9 , 1–13 (2019).

    КАС Статья Google ученый

17. «>

    Торибио, В. и др. . Разработка количественного метода измерения потребления ЭВ. Науч. 9 , 1–14 (2019).

    Артикул Google ученый

18. Неклс, В. Н. и др. . Трансгенная индуцируемая GFP внеклеточная везикулярная репортерная мышь (TIGER) освещает неонатальные кортикальные астроциты как источник иммуномодулирующих внеклеточных везикул. Науч. 9 , 1–11 (2019).

    КАС Статья Google ученый

Скачать ссылки

Благодарности

Эта работа была поддержана Институтом Салуда Карлоса III, Министром экономики и конкурентоспособности, при софинансировании Европейского социального фонда ESF (MS16/00124).

Информация об авторе

Авторы и организации

1. Группа клеточной терапии и тканевой инженерии, Научно-исследовательский институт наук о здоровье (IUNICS), Университет Балеарских островов (UIB), Ctra. Valldemossa km 7.5, 07122, Пальма, Испания

   Joana Maria Ramis

2. Научно-исследовательский институт здоровья Балеарских островов (IdISBa), Пальма, Испания

   Joana Maria Ramis

3. Отделение фундаментальной биологии и наук, Испания 3, Joana 900 900 ла Салют, Joana 900 900, Пальма, 900 Мария Рамис

Авторы

1. Джоана Мария Рамис

   Посмотреть публикации автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

Автор, ответственный за переписку

Джоана Мария Рамис.

Заявление об этике

Конкурирующие интересы

Авторы не заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Примечание издателя Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License, которая разрешает использование, совместное использование, адаптацию, распространение и воспроизведение на любом носителе или в любом формате при условии, что вы укажете соответствующую ссылку на оригинальный автор(ы) и источник, предоставьте ссылку на лицензию Creative Commons и укажите, были ли внесены изменения. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке материала. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи, а ваше предполагаемое использование не разрешено законом или выходит за рамки разрешенного использования, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатка и разрешения

Об этой статье

Эту статью цитирует

• Микро- и наносенсоры для выявления гематологических возбудителей и биомаркеров на различных этапах оказания помощи при сепсисе

  • Алехандра Альба-Патиньо
  • Андреу Вакер
  • Роберто де ла Рика

  Microchimica Acta (2022)

• Последние достижения в использовании наночастиц на липидной основе против мультиформной глиобластомы

  • Бенита Ортега-Берланга
  • Кармен Гонсалес
  • Габриэла Наварро-Товар

  Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis (2021)

Визуализация внеклеточных везикул: современные и новые методы | Журнал биомедицинских наук

• Обзор
• Открытый доступ
• Опубликовано: 24 декабря 2018 г.

• Стивен Тин-Ю Чуо ^{1 na1} ,
• Джаспер Че-Юнг Чиен ^{1 na1} и
• Чарльз Ла Пин-Куанги ORCID: orcid.org/0000-0001-8050-7060 ^1,2,3  

Журнал биомедицинских наук том 25 , Номер статьи: 91 (2018) Процитировать эту статью

• 24 тыс. обращений

• 147 цитирований

• 8 Альтметрический

• Детали показателей

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой наночастицы, заключенные в липидный бислой, высвобождаемые клетками. Они имеют диаметр от 30 нм до нескольких микрометров и переносят биологические грузы, такие как белки, липиды, РНК и ДНК, для локальных и отдаленных межклеточных коммуникаций. С тех пор было обнаружено, что электромобили играют роль в развитии, а также в заболеваниях, включая рак. Чтобы выяснить роль электромобилей, исследователи разработали различные методы визуализации и изучения их пространственно-временных свойств. Однако, поскольку ЭВ имеют нанометровый размер, их визуализация требует полного понимания каждой стратегии маркировки для обеспечения точного мониторинга. В этом обзоре рассматриваются текущие и новые стратегии визуализации ЭВ для проспективных исследований.

История вопроса

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенные наночастицы, выделяемые клетками. Когда-то их считали клеточными отходами, пока исследования не показали, что ЭВ служит средством межклеточной коммуникации, перемещая ДНК, РНК, белки и липиды в соседние и отдаленные места [1, 2]. С тех пор ЭВ активно исследуются в (пато)физиологических условиях, а также для терапевтических разработок. Чтобы помочь в этих исследованиях, было разработано множество методов для обозначения и характеристики пространственно-временных свойств электромобилей. Поскольку каждая стратегия визуализации имеет свои преимущества и недостатки, этот обзор направлен на то, чтобы охватить текущие и новые методы, тем самым облегчив выбор визуализации EV в проспективных исследованиях.

Внеклеточные везикулы

Valadi et al. определили, что ЭВ из тучных клеток человека и мыши несут мРНК и микроРНК (миРНК), называемые «экзосомальными челночными РНК», которые могут быть доставлены в клетки-реципиенты посредством захвата ЭВ для трансляции [3]. Вскоре после этого Аль-Недави и соавт. обнаружили, что EV, полученные из глиом, могут доставлять онкогенную форму EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), EGFRvIII [4], а также показали, что EV, высвобождаемые линиями раковых клеток A431, A549 и DLD1, могут переносить EGFR, чтобы индуцировать ангиогенез в эндотелии пупочной вены человека. клетки (HUVEC) [5]. Более того, Ratajczak et al. обнаружили, что EV из эмбриональных стволовых клеток (ES) могут доставлять мРНК, связанные с плюрипотентными транскрипционными факторами и белком Wnt-3, в мышиные гемопоэтические клетки-предшественники (HPC) для повышения выживаемости и размножения [6]. Поскольку ЭВ могут транспортировать биологически активные грузы между клетками, ЭВ признаны важными переносчиками для модуляции фенотипа и функции клеток-реципиентов ЭВ [7]. Несмотря на то, что существуют разные подтипы ЭВ в зависимости от их размера, биогенеза и формы (рис. 1), в текущем обзоре используется собирательный термин «ЭВ», если не указано иное.

Чжан и др. идентифицировали два типа субпопуляций экзосом: больших экзосом (Exo-L, 90–120 нм) и малых экзосом (Exo-S, 60–80 нм) по асимметричной фракции потока поля-потока (AF4) [16] . С помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и масс-спектрометрии (МС) было подтверждено, что Exo-S/L являются инкапсулированными частицами [15]. В то время как оба Exo-S/L демонстрировали сходные биомаркеры с экзосомами, включая тетраспанины (CD9, CD63, CD81), Exo-S содержал канонические экзосомальные белки, относящиеся к ILV, фагоцитарным везикулам, MVB и вакуолям, такие как флотиллин 1, флотиллин 2, член семейства твитов 3, тетраспанин 14 и субъединица ESCRT-I VPS37B. Напротив, Exo-L нес неканонические белки, связанные с отпочкованием мембраны, поздней эндосомой и сетью транс-Гольджи, такие как аннексин A1/A4/A5, заряженный белок мультивезикулярного тела 1A/2A/4B/5, гомолог сортировки вакуолярных белков 4 B, член A1 семейства белков теплового шока (Hsp40) и миозин IC. Кроме того, Zhang et al. идентифицировали немембранную наночастицу меньшего размера, названную «9».0619 экзомер ” (< 50 нм), в котором отсутствует липидный бислой других подтипов EV [15]. Экзомеры обогащены белками, участвующими в метаболизме, включая гликолиз и метаболический путь mTORC1 [15], и его биологическая роль еще предстоит выяснить в предстоящих исследованиях.

Микровезикулы (100–1000 нм) сбрасываются с поверхности клеток, которые обычно крупнее экзосом. Отпочкование наружу связано с взаимодействием TSG101 с белком 1, содержащим домен аррестина (ARRDC1). После связывания с ARRDC1 TSG101 перемещается из эндосом на плазматическую мембрану и способствует высвобождению MV посредством Gag-опосредованного почкования [17, 18]. MV имеют общие биомаркеры с экзосомами, такими как CD63 [19].], и известно, что как МВ, так и экзосомы транспортируют биологически активные грузы между клетками [6].

Онкосомы или большие онкосомы представляют собой крупные ВВ, высвобождаемые раковыми клетками (1000–10 000 нм). Они могут высвобождаться как микровезикулы путем отпочкования пузырьков и разрыва мембраны [20, 21]. Онкосомы часто обнаруживаются в высокоагрессивных раковых клетках в виде неапоптотических пузырьков плазматической мембраны во время амебоидного типа инвазии рака [22]. Вольф и др. обнаружили, что амебоидные опухолевые клетки непрерывно расширяются и втягивают онкосомы вокруг клеточной поверхности, когда опухолевые клетки проходят через трехмерный коллагеновый матрикс [22]. Клэнси и др. обнаружили высвобождение онкосом из амебоидоподобной инвазивной опухолевой клетки, чему способствуют растворимый белок рецептора белка прикрепления, чувствительного к N-этилмалеимиду (SNARE) и ассоциированный с везикулами мембранный белок (VAMP) с доставкой груза мембранного матрикса 1 типа. металлопротеаза (МТ1-ММП) [21, 23, 24]. Поскольку MT1-MMP способствует инвазии опухолевых клеток и протеолизу внеклеточного матрикса (ECM) [25, 26], предполагается, что онкосомы играют важную роль в инвазии опухолевых клеток.

Миграсомы (до 3000 нм) представляют собой микровезикулы овальной формы, содержащие мелкие пузырьки, образующиеся в процессе миграции клеток. Лян и др. обнаружили, что клетки секретируют миграсомы из кончиков своих ретракционных волокон, которые авторы описали как гранатоподобные структуры (PLS) [27]. Было обнаружено, что PLS экспрессирует тетраспанин-4 (TSPAN4) в качестве маркера PLS [27]. С помощью покадровой флуоресцентной визуализации клеток нормальной крысиной почки (NRK), экспрессирующих TSPAN4-зеленый флуоресцентный белок (GFP), авт. обнаружили, что высвобождение миграсом зависит от миграции [27]. Тем не менее, функция миграсомы еще предстоит выяснить.

Хотя подтипы EV имеют разные пути биогенеза, биомаркеры и размеры, их соответствующие биологические роли еще предстоит полностью охарактеризовать. Благодаря недавним достижениям в технологиях маркировки и визуализации EV стало возможным более полное понимание свойств подтипов EV.

Визуализация EV

Визуализация EV играет важную роль в выявлении пространственно-временных свойств EV для дальнейшего понимания молекулярной биологии, а также терапевтического потенциала EV. Визуализация ЭВ in vitro помогает исследователям понять физические свойства ЭВ, такие как механизм высвобождения ЭВ [28] и поглощения [1, 29].], или биомаркеры, экспрессированные на поверхности ЭВ [30, 31]. Визуализация EV in vivo помогает выявить биораспределение EV, что может быть использовано для характеристики фармакокинетических свойств EV в качестве лекарственного средства и/или тераностического носителя. Однако визуализация и отслеживание ЭВ могут быть затруднены из-за их небольших размеров, часто требующих маркировки перед их последующей визуализацией (рис. 2). С тех пор было разработано множество инструментов визуализации и методов маркировки, чтобы помочь исследователям в мониторинге EV как in vitro, так и in vivo (рис. 3). В этом обзоре мы сосредоточимся на преимуществах и недостатках широко используемых методов визуализации ЭВ для базовых и доклинических исследований.

Различные пределы микроскопического разрешения и размеры субпопуляций ЭВ. У каждого метода визуализации есть предел разрешающей способности. Для визуализации ЭВ могут применяться различные стратегии, основанные на подтипах ЭВ и представляющих интерес мишенях (например, клетках, тканях, органах)

Изображение в натуральную величину

Рис. Мечение EV флуоресцентным красителем или флуоресцентным белком можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Электромобили, экспрессирующие белки биолюминесценции, могут быть отображены с помощью сверхчувствительной ПЗС. Электромобили, объединенные с USPIO, можно использовать для МРТ. Метка электромобилей изотопами может использоваться для ядерной визуализации. CFDA-SE: сукцинимидиловый эфир диацетата карбоксифлуоресцеина; кальцеин AM: кальцеин ацетоксиметил; USPIO: сверхмалый суперпарамагнитный оксид железа; 99mTc-HMPAO: 99mTc-гексаметилпропиленаминооксим; ПЗС: устройство с зарядовой связью

Полноразмерное изображение

EV-визуализация с помощью электронной микроскопии

Электронная микроскопия считается стандартным методом визуализации для наблюдения наноразмерных образцов, включая EV [32,33,34]. Поскольку электронная микроскопия обычно имеет разрешение около 0,5 нм, что меньше, чем у экзосом, она может предоставить подробную структурную информацию о EV. Важно отметить, что электронная микроскопия не может отображать ЭВ в их естественном состоянии, потому что образцы необходимо зафиксировать и обработать перед визуализацией. Здесь мы обсудим общие методы электронной микроскопии, используемые для визуализации EV:

Трансмиссионная электронная микроскопия

Трансмиссионная электронная микроскопия (ПЭМ) является наиболее распространенным типом электронной микроскопии для визуализации ЭМ, таких как экзосомы [35], микровезикулы [36], онкосомы [37] и миграсомы [27]. Образцы, подготовленные для визуализации ПЭМ, сначала фиксируют, а затем обезвоживают. После обезвоживания образцы необходимо поместить, нарезать на нанометровые тонкие срезы и поместить на сетку с углеродным покрытием для визуализации. TEM использует электронные лучи для освещения подготовленных образцов, и электрон может либо проходить, либо дифрагировать на образцах. Флуоресцентный экран или устройство с зарядовой парой (ПЗС) будут собирать прошедшие электроны для получения изображений в светлом поле, которые обычно используются для проверки структуры. Тем временем рассеянные электроны собираются для создания изображений в темном поле, выявляющих структуру с более высоким контрастом. Примечательно, что ЭВ, наблюдаемые с помощью ПЭМ, часто имеют чашеобразную форму в результате обезвоживания во время подготовки образца [38], но могут эффективно выявить внутреннюю структуру ЭВ.

Используя маркировку иммунозолотом, ПЭМ может дополнительно выявить белки EV. Диккенс и др. использовали корреляционную световую электронную микроскопию (CLEM) для визуализации EV, высвобождаемых из астроцитов, экспрессирующих GFP, тем самым демонстрируя, что меченые EV могут поглощаться эндотелиальными клетками микрососудов головного мозга, легкими, печенью и селезенкой и впоследствии вызывать миграцию лейкоцитов в очаг поражения головного мозга. тканей [39]. Метод, меченный иммунозолотом, также можно использовать для количественного определения маркера, ассоциированного с раком, в плазме ЭВ [40], а также для изучения механизма заболевания с участием ЭВ. Например, Szempruch et al. недавно обнаружены ЭВ, выделяемые паразитом, Trypanosoma brucei вызывает ремоделирование эритроцитов хозяина и последующую анемию [41].

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) использует электронный луч для сканирования поверхности образца для получения топографической информации. Для СЭМ образцы сначала химически или криогенно фиксируют, а затем обезвоживают. Затем иммобилизованные образцы покрывают напылением тонким слоем проводящего материала, такого как золото или углерод, для визуализации. В то время как в некоторых отчетах предполагается, что ЭВ в SEM имеют круглую форму [42,43,44], другие сообщают, что они имеют форму блюдца [45]. Последнее наблюдение может отражать коллапс ВВ в результате процесса дегидратации во время пробоподготовки [45].

Хотя подготовка образцов для СЭМ относительно проста по сравнению с ПЭМ, которая требует заделки и разделения образцов, необходимо учитывать несколько предостережений. Во время подготовки образца для СЭМ на поверхность образца напыляется тонкий проводящий слой толщиной от 2 до 10 нм, чтобы избежать накопления электронов и увеличить генерацию вторичных электронов. Этот тонкий слой золота обычно не влияет на результат визуализации. Однако из-за небольшого размера электромобилей тонкий слой золота может повлиять на структуру поверхности электромобилей. Низковольтный РЭМ может избежать накопления заряда и уменьшить радиационное повреждение образцов, тем самым минуя процесс покрытия напылением [44]. Чернышев и др. также сообщили, что «эффект кофейного кольца» может возникать в результате капиллярного потока во время дегидратации образца, что создает погрешность в результате размера и количества ЭВ [46]. Чтобы предотвратить такое смещение, необходимо визуализировать и исследовать всю поверхность образца [46].

Криоэлектронная микроскопия

При криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) образцы будут фиксироваться путем криоиммобилизации, при которой вода витрифицируется вместо образования кристаллов льда в образце путем охлаждения жидким этаном. Криоиммобилизация позволяет сохранить образцы в их естественном гидратированном состоянии, что позволяет избежать артефактов, обычно вызываемых обычными методами фиксации, такими как ЭВ чашеобразной формы [46, 47]. В сочетании с мечением иммунозолотом крио-ПЭМ может отображать ЭВ, содержащие белки, и отслеживать поглощение ЭВ клетками-реципиентами [48], а также различать подгруппы ЭВ по их размеру [49]., 50]. При крио-ЭМ образцы визуализируются при чрезвычайно низкой температуре (ниже - 175 °C), поскольку ЭВ сохраняет свою первоначальную сферическую форму [51]. Поэтому средний размер электромобилей будет казаться больше по сравнению с другими методами ЭМ [46]. После криоиммобилизации образцы также могут подвергаться замене замораживанием с помощью фиксирующих и заливающих реагентов для образцов, которые будут визуализированы с помощью традиционной ПЭМ при комнатной температуре. Поскольку крио-ЭМ обеспечивает превосходное качество образцов и сохранение морфологии по сравнению с традиционными методами ЭМ [47], она все чаще применяется для изучения электромобилей.

Электронная визуализация с помощью атомно-силовой микроскопии

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) использует зонд, часто изготовленный из кремния или нитрида кремния, для сканирования поверхности образцов. При контакте зонда с поверхностью образцов положение зонда изменяется и измеряется лазерным лучом. Записывая положение зонда во время сканирования, АСМ генерирует топографические изображения образцов. АСМ имеет предел разрешения около 1 нм [52], что позволяет проводить количественную оценку и визуализацию большинства электромобилей [53, 54]. В воздушном режиме подготовка образцов для визуализации ЭВ требует только иммобилизации ЭВ на свежесколотой слюде для последующего сканирования зондом. В жидкостном режиме образцы ЭВ могут быть измерены напрямую, что приведет к обнаружению ЭВ большего размера, чем в воздушном режиме, поскольку ЭВ остаются гидратированными и сохраняют свою морфологию [55]. Слюда также может быть покрыта антителами, чтобы можно было захватить EV со специфическим антигеном для визуализации [54]. Режим визуализации можно разделить на контактный и постукивающий. В контактном режиме зонд сканирует поверхность образца, что может привести к повреждению как зонда, так и образца. В то время как в режиме постукивания зонд колеблется по поверхности образца и касается образца только в самом нижнем положении колебаний. Осцилляции сокращают время контакта между образцом и зондом, тем самым защищая структуру образца. При сочетании кремниевых зондов с антителами АСМ можно использовать для количественной оценки и визуализации ЭВ со специфическим белком на его поверхности с разрешением одного ЭВ [56].

Отслеживание ЭВ с помощью оптической микроскопии

Биолюминесцентная визуализация (БЛИ) и флуоресцентная визуализация (ФЛИ) — два основных метода, используемых для обнаружения ЭВ в спектре видимого света (390–700 нм). Биолюминесценция — это тип хемилюминесценции, возникающий в результате окисления субстратов соответствующими люциферазами. Для обнаружения биолюминесцентного сигнала требуется сверхчувствительная ПЗС-камера [57]. Преимущество BLI заключается в высоком отношении сигнал/шум (SNR), поскольку сигналы генерируются без какого-либо источника света. FLI использует флуоресцентные белки или органические красители для излучения сигналов при возбуждении внешним источником света. По сравнению с BLI сигнал FLI может быть легче обнаружен ПЗС-камерой. И BLI, и FLI могут применяться для наблюдения за электромобилями в режиме реального времени [58, 59].].

Биолюминесцентная маркировка EV

BLI-маркировка EV представляет собой маркировку на основе белков. Люциферазы-репортеры EV обычно экспрессируются в клетках посредством плазмидной трансфекции или трансдукции лентивируса, и затем их EV можно визуализировать с помощью BLI.

Такахаши и др. продемонстрировали, что люцифераза Gaussia (Gluc), слитая между сигнальным пептидом секреции и доменом C1C2 лактадгерина, может быть помечена на мембране EV [59]. Клетки мышиной меланомы B16-BL6 трансфицировали плазмидой Gluc-лактадгерин в течение 24 ч, и ЭВ собирали с помощью дифференциальной ультрацентрифугации (UC). После внутривенной (IV) болюсной инъекции меченых ВВ сигнал показал, что ВВ быстро распределялись по различным органам в течение пяти часов [59]. ].

Мы объединили Gluc, белок-акцептор биотина и трансмембранный домен рецептора тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) для создания мультимодального репортера визуализации EV (GlucB) [60]. Т-клетки эмбриональной почки человека 293  стабильно трансдуцировали лентивирусным вектором, содержащим GlucB, для последующего сбора EV с помощью дифференциального ЯК. Болюсное внутривенное введение меченых EV бестимусным голым мышам с последующей системой визуализации in vivo (IVIS) и флуоресцентной томографией продемонстрировало, что EV в основном обрабатываются печенью и легкими в течение шести часов в две фазы: распределение фаза, когда ВВ быстро распределяются по различным органам, а затем следует фаза элиминации, когда ВВ перерабатываются органами [60].

Гангадаран и др. использовали люциферазу Renilla (Rluc) в качестве репортера BLI для визуализации EV. Лентивирус, кодирующий Rluc, трансдуцировали в клетки анапластического рака щитовидной железы человека (клетки CAL-62) и рака молочной железы человека (MDA-MB-231) для выделения ЭВ [61]. Меченые ЭВ показали биораспределение EV-CAL-62/Rluc в легких, затем в печени, селезенке и почках. С другой стороны, EV-MDA-231/Rluc показал сильный сигнал в печени, затем в легких, селезенке и почках [61].

9Таким образом, 0002 Gluc и Rluc могут служить мощными репортерами для биораспределения EV in vivo и анализа изображений. Тем не менее, токсичность субстратов (например, коэлентеразин) и период полураспада биолюминесценции также следует принимать во внимание при отслеживании электромобилей на основе BLI в реальном времени [62, 63, 64].

Флуоресцентная маркировка EV

Флуоресцентная маркировка на основе белков и органических красителей используется для обеспечения визуализации FLI EV с превосходным пространственным разрешением при оптической микроскопии и IVIS.

Мечение рекомбинантных белков

Флуоресцентные белки, такие как GFP и RFP, сливаются с белками EV в качестве репортеров для визуализации EV. Миттельбрунн и др. впервые слили CD63 с GFP для анализа клеточного поглощения EV [31]. Они генерировали стабильные CD63-GFP-экспрессирующие В-клетки Raji и J77 T-клетки для сбора флуоресцентно меченных EV. После 16-часовой обработки EV CD63-GFP EV на J77-T-клетках дикого типа или В-клетках Raji на поверхности клеток-реципиентов был обнаружен флуоресцентный сигнал, что указывает на то, что EV прикрепляются к клеточной мембране [31]. Суэцугу и др. использовали аналогичную стратегию и показали, что клетки рака молочной железы секретируют EV в легкие и индуцируют миграцию раковых клеток [65]. В другом исследовании RFP-меченый CD63 использовался для визуализации переноса EV между тройным негативным раком молочной железы (TNBC) и макрофагами RAW264.7 [66]. Связь между TNBC и макрофагами через EVs вызывает поляризацию M2-макрофагов и усиливает рост опухоли и метастазирование в подмышечные лимфатические узлы в моделях ортотопических опухолей [66]. Тем не менее, мечение EV специфическими белками EV может ограничить отслеживание только несколькими подтипами EV, экспрессирующими соответствующие маркеры.

Чтобы создать общую стратегию маркировки EV с помощью флуоресцентных белков, мы объединили сигнал пальмитоилирования с усиленным зеленым флуоресцентным белком (PalmGFP) и тандемным димером Tomato (PalmtdTomato) для маркировки листовок внутренней мембраны клеток и EV [67]. С помощью конфокальной микроскопии живых клеток клетки глиобластомы (GBM) и 293 T-клетки, экспрессирующие репортеры, показали разнонаправленный обмен EV [67]. Более того, репортеры позволили наблюдать in vivo эндогенно высвобождаемые EV имплантированной тимомы EL4 у мышей C57BL/6 с помощью многофотонной прижизненной микроскопии (MP-IVM) [58].

Хотя методы мечения флуоресцентных белков могут служить универсальными репортерами EV, интенсивность флуоресценции зависит от уровня экспрессии белка, эффективности мечения мембранных доменов EV и мощности источника возбуждающего света. Экспрессия флуоресцентных белков на мембране EV может также влиять на содержание груза EV и его поглощение из-за стерических затруднений, которые требуют дальнейших исследований и рассмотрения перед их использованием.

Органические флуоресцентные красители

Существует множество органических флуоресцентных красителей, используемых для маркировки ЭВ. Большинство красителей изначально использовались для маркировки клеточных мембран для визуализации клеток. Органические красители обычно объединяют флуорофоры с различными функциональными группами для маркировки липидного бислоя или представляющих интерес белков на EV.

DiR и DiD являются липофильными красителями и проявляют сильный флуоресцентный сигнал при включении в цитозоль [68]. Викландер и др. использовали DiR для изучения EV путем маркировки кондиционированных сред из разных типов клеток с последующим дифференциальным ЯК и сообщили о различных моделях биораспределения EV, основанных на клетках и путях введения у мышей через IVIS [69]. Гранж и др. также продемонстрировали, что распределение EV, полученных из мезенхимальных стволовых клеток (MSC), можно было обнаружить с помощью DiD-мечения через 24 часа после инъекции у мышей [70]. ПКХ67 и ПКХ36 также являются флуорофорами с липофильным карбоцианином. Эти красители используют алифатические хвосты для закрепления в липидном бислое для флуоресцентной визуализации [71, 72]. Липофильные красители PKH также использовались для маркировки EV для изучения свойств in vivo [73, 74].

Октадецил родамин B хлорид (R18) представляет собой краситель для маркировки липидов, который встраивается в бислой липидов своими алкильными хвостами [75]. При первом включении в плазматическую мембрану в гашенной форме интенсивность сигнала флуоресценции R18 увеличивается по мере слияния меченой мембраны с немеченой мембраной для дегашения R18 [76]. Следовательно, процент дегашения может указывать на слияние EV с клетками [76]. Тиан и др. использовали R18 для изучения фузогенных свойств EV в клетках PC12 и обнаружили события слияния через 24 часа после обработки EV. Монтекальво и др. также использовали тот же краситель для обнаружения EV, полученных из дендритных клеток костного мозга (BMDC), сливающихся с BMDC в течение восьми минут после обработки [76].

Другие водорастворимые флуорофоры в сочетании с различными функциональными группами также применяются для маркировки ЭВ. Alexa Fluor NHS, флуоресцентный краситель, связанный с N-гидроксисукцинимидиловым (NHS) эфиром, может образовывать ковалентную связь с аминогруппами в белках [77]. Белки, присутствующие на липидной мембране EV, могут быть помечены эфиром Alexa Fluor NHS и обнаружены с помощью флуоресцентной визуализации [78]. Коойманс и др. использовали Alexa Fluor 488 для обнаружения поглощения ЭВ, полученных из эритроцитов, клетками эпидермоидной карциномы человека, и обнаружили, что ЭВ, украшенные чувствительными к EGFR нанотелами (EGa1-C1C2), могут увеличить его поглощение с помощью анализа проточной цитометрии [79].]. Мы показали, что акцепторный белок биотина в репортере GlucB может быть дополнительно помечен Alexa680, конъюгированным со стрептавидином, что позволяет проводить флуоресцентно-опосредованную томографию (FMT) у мышей для изучения биораспределения 293 T-производных EV [60].

Сукцинимидиловый эфир диацетата карбоксифлуоресцеина (CFDA-SE; Ex/Em 492/517) является проницаемым для клеток и связывается с внутриклеточной аминогруппой, поскольку он сохраняется в клетках после удаления ацетатных групп внутриклеточными эстеразами [80]. Эскревенте и др. использовали CFDA-SE для наблюдения энергозависимого эндоцитоза поглощения EV клетками SKOV3 (клетки рака яичников) с помощью проточной цитометрии [81]. Глубокий красный цвет CellTracker (CTDR) имеет ту же функцию, что и CFDA-SE, но с возбуждением красным светом (макс. 630 нм) и излучением дальнего красного света (макс. 650 нм). При изучении механизма захвата клетками CTDR, меченый 239Т-производные EV могут быть обнаружены в клетках, меченных зеленым флуоресцентным красителем, с помощью флуоресцентного микроскопического анализа и анализа проточной цитометрии [82]. Кальцеин ацетоксиметил (АМ) состоит из флуоресцентного кальцеина в сочетании с ацетоксиметильной группой. Calcein AM сначала проникает в EV с помощью AM и расщепляется цитозольной эстеразой, оставляя кальцеин в качестве водорастворимого флуорофора для FLI. Мантель и др. обнаружили, что кальцеин-АМ может высвобождать кальцеин в ЭВ, происходящие из эритроцитов, для наблюдения с использованием флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии [83].

Флуоресцентные красители могут обеспечивать стабильный и сильный сигнал для визуализации ЭВ. Однако сообщалось, что популярные красители для маркировки EV, такие как красители PKH, имеют период полураспада in vivo в диапазоне от 5 до> 100 дней [84,85,86], а диалкилкарбоцианиновые красители, такие как DiR, могут сохраняться в течение 4 недель [87]. Стойкость красителей может ввести в заблуждение при распределении in vivo в лонгитюдных исследованиях ЭВ, где красители переживают ЭВ от деградации. Кроме того, агрегация и мицеллообразование липофильных красителей может давать ложный сигнал о ВВ [67]. Тем не менее, красители могут быть полезны в качестве индикатора, показывающего, где прошли электромобили.

Инструменты клинической визуализации для визуализации EV

Поскольку исследователи все больше внимания уделяют EV как эндогенному терапевтическому средству доставки для клинических применений, необходимо иметь возможность отслеживать и понимать фармакокинетику EV. Двумя широко используемыми инструментами клинической визуализации являются однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ОФЭКТ создает изображения путем измерения гамма-лучей, генерируемых гамма-излучающими радиоизотопами. Напротив, ПЭТ обнаруживает пары гамма-лучей в противоположном направлении, когда они косвенно генерируются радионуклидом, испускающим позитроны, когда он подвергается аннигиляции с электронами в тканях. Основное преимущество радиоактивных зондов заключается в их большей глубине проникновения в ткани по сравнению с репортерами видимого света.

Хван и др. использовали липофильный ^99m Tc-гексаметилпропилен-аминооксим ( ^99m Tc-HMPAO) для маркировки EV, где контрастное вещество сначала было захвачено внутри макрофагов, поскольку глутатион превращает ^99m Tc-HMPAO в гидрофильную форму с последующим образованием ^99m Tc -HMPAO-экзосомы-миметические нановезикулы путем экструзии [88]. Нановезикулы ^99m Tc-HMPAO, меченные Tc-HMPAO, показали сходную морфологию и характер биораспределения у мышей, как и у природных EV, которые аналогичным образом маркируются и собираются с помощью дифференциального ЯК [88]. Аналогичный метод с использованием ^99m Tc-трикарбониловый комплекс, который связывается с гистидином [89], цистеином и метионином на поверхностных белках EV, позволяет визуализировать экзосомы, происходящие из эритроцитов, с помощью ОФЭКТ/КТ [90]. Другой метод радиоактивного мечения включает использование индий-111-оксина, который встраивается в мембрану экзосомы с липофильным свойством оксина [91]. Моришита и др. также разработали метод мечения внешней мембраны с использованием слитого белка стрептавидина и лактадгерина, белка, который, как известно, локализуется на внешней поверхности экзосом. Затем меченые ЭВ обрабатывают (3- ¹²⁵ I-йодобензоил) норбиотинамид ( ¹²⁵ I-IBB) для маркировки ЭВ через биотин-стрептавидиновое взаимодействие [92]. Другой распространенный радиоактивный йод, такой как ¹²⁴ I, который является обычным зондом ПЭТ [93], или ¹³¹ I, который может одновременно убивать и визуализировать раковые клетки [94], также может быть использован для радиоактивной маркировки EV в организме. будущее.

Магнитно-резонансная томография (МРТ) — еще одна важная технология молекулярной визуализации, используемая для клинической диагностики. Контрастный агент МРТ, такой как суперпарамагнитный оксид железа, который может уменьшить сигнал T2 в ткани, обычно применяется для улучшения отношения сигнал-шум и выявляемости поражения [9].5]. Фактически, Худ и др. использовали электропорацию для загрузки 5-нм суперпарамагнитных наночастиц оксида железа в EV и продемонстрировали, что маркировка не влияла на их размер и биораспределение в лимфатических узлах по сравнению с меченными Dil EV у мышей [96, 97]. Следует отметить, что поскольку метод электропорации также использовался для слияния клеток или липосом [98, 99], он также может вызывать слияние ВВ и влиять на их морфологию. Чтобы избежать этого предостережения, альтернативный метод мечения EV использует клеточный эндоцитоз контрастного вещества. Ху и др. использовали сверхмалые суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (USPIO, 4–6 нм) для маркировки жировых стволовых клеток посредством пиноцитоза [100]. Интернализированные USPIO затем накапливались в MVB и высвобождались в виде EV, меченных USPIO [101]. Таким образом, этот метод позволяет избежать слияния EV, вызванного электропорацией, и отслеживает высвобождение EV из имплантированных клеток, меченных USPIO.

Хотя использование системы визуализации SPECT, PET, MRI может обеспечить хорошую глубину изображения, важно отметить, что эти метящие соединения имеют более длительный период полувыведения, чем EV, и, таким образом, могут генерировать сигнал даже после деградации EV [88, 96].

Выводы

Визуализация ЭВ играет ключевую роль в изучении биологических явлений, таких как рак [102] и заболевания нейронов [103]. Поскольку исследователи используют различных репортеров для мониторинга EV, крайне важно учитывать свойства каждого репортера по отношению к свойствам EV. Также важно смягчить ложноположительный сигнал EV от маркировки EV, а также охарактеризовать истинные пространственно-временные свойства EV, но не агентов визуализации. С постепенно открываемой информацией о биологии и составе ЭВ могут быть разработаны новые методы визуализации, обеспечивающие точную и долгосрочную визуализацию ЭВ в доклинических и клинических условиях.

Сокращения

AF4:

фракция полевого потока асимметричного потока

АСМ:

атомно-силовая микроскопия

AM:

ацетоксиметил

ARRDC1:

белок, содержащий домен аррестина 1

БЛИ:

биолюминесцентная визуализация

BMDC:

дендритная клетка костного мозга

ПЗС:

устройство зарядной пары

CFDA-SE:

сукцинимидиловый эфир диацетата карбоксифлуоресцеина

Крио-ЭМ:

криоэлектронная микроскопия

CTDR:

CellTracker темно-красный

ЧТЗ:

коэлентеразин

ЕСМ:

внеклеточный матрикс

EGFP:

белок усиленной зеленой флуоресценции

EGFR:

Рецептор эпидермального фактора роста

ЭП:

эмбриональная стволовая клетка

ESCRT:

Эндосомальный сортировочный комплекс необходим для транспортировки

Электромобили:

Внеклеточные везикулы

Экзо-L:

большая экзосома

Экзо-S:

Малая экзосома

ФЛИ:

Флуоресцентная визуализация

FMT:

Флуоресцентная томография

GFP:

зеленый флуоресцентный белок

Глюк:

Гауссия Люцифераза

HEK293T:

клетки почки эмбриона человека 293 T

HPC:

гемопоэтическая клетка-предшественник

HUVAC:

эндотелиальные клетки пупочной вены человека

РКН:

Внутрипросветные везикулы

ИВИС:

система визуализации in vivo

МП-ИВМ:

мультифотонная прижизненная микроскопия

МРТ:

магнитно-резонансная томография

MS:

масс-спектрометр

MSC:

мезенхимальные стромальные клетки

МТ1-ММП:

грузовая доставка матриксной металлопротеазы мембранного типа 1

МВБ:

мультивезикулярное тело

ГСЗ:

N-гидроксисукцинимидил

NRK:

нормальная почка крысы

ОВА:

яичный овальбумин куриный

Ладонь:

Пальмитоилирование

ПЭТ:

позитронно-эмиссионная томография

ПОЖАЛУЙСТА:

гранатоподобные структуры

Запрос предложений:

красный флуоресцентный белок

Rluc:

Renilla люцифераза

РПЭ-1:

клетки пигментированного эпителия сетчатки

SEM:

сканирующая электронная микроскопия

Малый барабан:

растворимый рецептор белка прикрепления к N-этилмалеимиду, чувствительному к фактору

Серийный номер:

отношение сигнал/шум

ОФЕКТ:

Однофотонная эмиссионная компьютерная томография

тдПомидор:

тандемный димер Помидор

ТЕМ:

просвечивающая электронная микроскопия

ТНБК:

тройной негативный рак молочной железы

ЦГ101:

ген предрасположенности к опухолям 101

ЦПАН4:

тетраспанин-4

Единый союз:

ультрацентрифуга

USPIO:

сверхмалые суперпарамагнитные наночастицы оксида железа

ВАМП:

ассоциированный с везикулами мембранный белок

¹²⁵ И-ИББ:

(3- ¹²⁵ I-иодобензоил) норбиотинамид

^99m Tc-HMPAO:

^99m Tc-гексаметилпропилен-аминооксим

Ссылки

1. «>

   Harding C. Опосредованный рецептором эндоцитоз трансферрина и рециркуляция рецептора трансферрина в ретикулоцитах крысы. Джей Селл Биол. 1983;97(2):329–39.

   КАС пабмед Статья Google ученый

2. Пан Б.Т., Тенг К., Ву С., Адам М., Джонстон Р.М. Электронно-микроскопические доказательства экстернализации рецептора трансферрина в везикулярной форме в ретикулоцитах овцы. Джей Селл Биол. 1985;101(3):942–8.

   КАС пабмед Статья Google ученый

3. Валади Х., Экстрем К., Боссиос А., Шёстранд М., Ли Дж. Дж., Лётвалл Дж. О. Опосредованный экзосомами перенос мРНК и микроРНК представляет собой новый механизм генетического обмена между клетками. Nat Cell Biol. 2007;9(6): 654–9.

   КАС пабмед Статья Google ученый

4. Аль-Недави К. , Михан Б., Микаллеф Дж., Лхотак В., Мэй Л., Гуха А. и др. Межклеточный перенос онкогенного рецептора EGFRvIII микровезикулами, происходящими из опухолевых клеток. Nat Cell Biol. 2008;10(5):619–24.

   КАС пабмед Статья Google ученый

5. Al-Nedawi K, Meehan B, Kerbel RS, Allison AC, Rak J. Эндотелиальная экспрессия аутокринного VEGF при поглощении микровезикул опухолевого происхождения, содержащих онкогенный EGFR. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(10):3794–9.

   ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

6. Ratajczak J, Miekus K, Kucia M, Zhang J, Reca R, Dvorak P, et al. Эмбриональные микровезикулы, происходящие из стволовых клеток, перепрограммируют гемопоэтические предшественники: доказательства горизонтального переноса мРНК и доставки белка. Лейкемия. 2006;20(5):847–56.

   КАС пабмед Статья Google ученый

7. «>

   Raposo G. В-лимфоциты секретируют антигенпрезентирующие везикулы. J Эксперт Мед. 1996;183(3):1161–72.

   КАС пабмед Статья Google ученый

8. Сторфогель В., Строус Г.Дж., Гёз Х.Дж., Уршот В., Шварц А.Л. Поздние эндосомы происходят из ранних эндосом путем созревания. Клетка. 1991;65(3):417–27.

   КАС пабмед Статья Google ученый

9. Гриффитс Г., Хофлак Б., Саймонс К., Меллман И., Корнфельд С. Маннозо-6-фосфатный рецептор и биогенез лизосом. Клетка. 1988;52(3):329–41.

   КАС пабмед Статья Google ученый

10. Grecchi S, Malatesta M. Визуализация путей эндоцитоза при просвечивающей электронной микроскопии посредством фотоокисления диаминобензидина флуоресцентным красителем клеточной мембраны. Eur J Histochem. 2014;58(4):2449.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

11. Рази М., Футтер К.Э. Различная роль Tsg101 и Hrs в формировании мультивезикулярных тел и внутренней везикуляции. Мол Биол Селл. 2006;17(8):3469–83.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

12. Хсу С., Морохаши Ю., Йошимура С., Манрике-Хойос Н., Юнг С., Лаутербах М.А. и др. Регуляция секреции экзосом с помощью Rab35 и его белков, активирующих ГТФазу TBC1D10A-C. Джей Селл Биол. 2010;189(2): 223–32.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

13. Коломбо М., Мойта С., Ван Нил Г., Коваль Дж., Виньерон Дж., Бенароч П. и другие. Анализ функций ESCRT в биогенезе, составе и секреции экзосом подчеркивает гетерогенность внеклеточных везикул. Дж. Клеточные науки. 2013; 126 (часть 24): 5553–65.

    КАС пабмед Статья Google ученый

14. Pols MS, Klumperman J. Торговля и функция тетраспанина CD63. Разрешение ячейки опыта. 2009;315(9):1584–92.

    КАС пабмед Статья Google ученый

15. Чжан Х., Фрейтас Д., Ким Х.С., Фабиджаник К., Ли З., Чен Х. и др. Идентификация отдельных наночастиц и подмножеств внеклеточных везикул с помощью фракционирования асимметричного потока в полевом потоке. Nat Cell Biol. 2018;20(3):332–43.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

16. Фраунгофер В., Винтер Г. Использование асимметричного фракционирования полевого потока в фармацевтике и биофармацевтике. Евр Джей Фарм Биофарм. 2004;58(2):369–83.

    КАС пабмед Статья Google ученый

17. «>

    Nabhan JF, Hu R, Oh RS, Cohen SN, Lu Q. Формирование и высвобождение микровезикул, опосредованных белком 1 (ARMM), содержащих домен аррестина, на плазматической мембране путем рекрутирования белка TSG101. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012.

18. Hammarstedt M, Garoff H. Пассивное и активное включение белков-хозяев в частицы gag вируса иммунодефицита человека типа 1 во время почкования на плазматической мембране. Дж Вирол. 2004;78(11):5686–97.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

19. Kowal J, Arras G, Colombo M, Jouve M, Morath JP, Primdal-Bengtson B, et al. Протеомное сравнение определяет новые маркеры для характеристики гетерогенных популяций подтипов внеклеточных везикул. Proc Natl Acad Sci. 2016;113(8):E968–77.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

20. «>

    Ли Б., Антоняк М.А., Чжан Дж., Церионе Р.А. RhoA запускает специфический сигнальный путь, который генерирует трансформирующие микровезикулы в раковых клетках. Онкоген. 2012: 1–10.

21. Sedgwick AE, Clancy JW, Olivia Balmert M, D’Souza-Schorey C. Внеклеточные микровезикулы и инвадоподии опосредуют неперекрывающиеся способы инвазии опухолевых клеток. Научный доклад 2015; 5:14748.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

22. Вольф К., Мазо И., Леунг Х., Энгельке К., фон Андриан У.Х., Дерюгина Е.И. и др. Механизм компенсации миграции опухолевых клеток: мезенхимально-амебоидный переход после блокирования перицеллюлярного протеолиза. Джей Селл Биол. 2003;160(2):267–77.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

23. Clancy JW, Sedgwick A, Rosse C, Muralidharan-Chari V, Raposo G, Method M, et al. Регулируемая доставка молекулярного груза в инвазивные микровезикулы опухолевого происхождения. Нац коммун. 2015;6:6919.

    КАС пабмед Статья Google ученый

24. Weigelin B, Bakker GJ, Friedl P. Прижизненная микроскопия генерации третьей гармоники коллективной инвазии клеток меланомы: принципы управления интерфейсом и динамика микровезикул. Прижизненный. 2012;1(1):32–43.

    ПабМед Статья Google ученый

25. Муралидхаран-Чари В., Клэнси Дж., Плоу С., Ромао М., Чаврие П., Рапозо Г. и др. Регулируемое ARF6 выделение микровезикул плазматической мембраны, происходящих из опухолевых клеток. Карр Биол. 2009;19(22):1875–85.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

26. Сабех Ф., Ота И., Холмбек К., Биркедал-Хансен Х., Соловей П. , Балбин М. и др. Движение опухолевых клеток через внеклеточный матрикс контролируется прикрепленной к мембране коллагеназой MT1-MMP. Джей Селл Биол. 2004;167(4):769–81.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

27. Ma L, Li Y, Peng J, Wu D, Zhao X, Cui Y и др. Открытие миграсомы, органеллы, опосредующей высвобождение цитоплазматического содержимого во время миграции клеток. Сотовый рез. 2015;25(1):24–38.

    КАС пабмед Статья Google ученый

28. Feng D, Zhao WL, Ye YY, Bai XC, Liu RQ, Chang LF и др. Клеточная интернализация экзосом происходит посредством фагоцитоза. Движение. 2010;11(5):675–87.

    КАС пабмед Статья Google ученый

29. Морелли А.Е., Ларрегина А.Т., Шуфески В.Дж., Салливан М.Л., Штольц Д.Б., Папворт Г. Д., и соавт. Эндоцитоз, внутриклеточная сортировка и процессинг экзосом дендритными клетками. Кровь. 2004;104(10):3257–66.

    КАС пабмед Статья Google ученый

30. Фаббри М., Паоне А., Калоре Ф., Галли Р., Гаудио Э., Сантанам Р. и др. МикроРНК связываются с толл-подобными рецепторами, вызывая прометастатическую воспалительную реакцию. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(31):E2110–6.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

31. Миттельбрунн М., Гутьеррес-Васкес С., Вильярройя-Бельтри С., Гонсалес С., Санчес-Кабо Ф., Гонсалес М.А. и др. Однонаправленный перенос экзосом, нагруженных микроРНК, от Т-клеток к антигенпрезентирующим клеткам. Нац коммун. 2011;2:282.

    ПабМед Статья КАС Google ученый

32. Akers JC, Ramakrishnan V, Kim R, Phillips S, Kaimal V, Mao Y, et al. Содержание миРНК во внеклеточных везикулах спинномозговой жидкости у больных глиобластомой. J Нейро-онкол. 2015;123(2):205–16.

    КАС Статья Google ученый

33. Фурманн Г., Серио А, Мазо М., Наир Р., Стивенс М.М. Активная нагрузка на внеклеточные везикулы значительно улучшает клеточное поглощение и фотодинамический эффект порфиринов. J Управление выпуском. 2015;205:35–44.

    КАС пабмед Статья Google ученый

34. Hirsova P, Ibrahim SH, Krishnan A, Verma VK, Bronk SF, Werneburg NW, et al. Передача сигналов, индуцированная липидами, вызывает высвобождение воспалительных внеклеточных везикул из гепатоцитов. Гастроэнтерология. 2016;150(4):956–67.

    КАС пабмед Статья Google ученый

35. Пик Т.С., Прахарадж П.П., Паниграхи Г.К., Дойл М. , Су Ю., Шлепфер И.Р. и др. Экзосомы, секретируемые плацентарными стволовыми клетками, избирательно ингибируют рост агрессивных клеток рака предстательной железы. Biochem Biophys Res Commun. 2018;499(4):1004–10.

    КАС пабмед Статья ПабМед Центральный Google ученый

36. Поспичалова В., Свобода Дж., Дэйв З., Котрбова А., Кайзер К., Клемова Д. и другие. Упрощенный протокол для проточного цитометрического анализа флуоресцентно меченных экзосом и микровезикул с использованием специального проточного цитометра. Журнал внеклеточных везикул. 2015;4(2015):1–15.

    Google ученый

37. Minciacchi VR, You S, Spinelli C, Morley S, Zandian M, Aspuria PJ, et al. Большие онкосомы содержат особый белковый груз и представляют собой отдельный функциональный класс внеклеточных везикул опухолевого происхождения. Онкотаргет. 2015;6(13):11327–41.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

38. Lobb RJ, Becker M, Wen SW, Wong CS, Wiegmans AP, Leimgruber A, et al. Оптимизированный протокол выделения экзосом из супернатанта клеточной культуры и плазмы человека. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:27031.

    ПабМед Статья Google ученый

39. Диккенс А.М., Товар YRLB, Ю С.В., Траут А.Л., Бэ М., Канмогне М. и др. Внеклеточные везикулы, выделяемые астроцитами, регулируют реакцию периферических лейкоцитов на воспалительные поражения головного мозга. Научный сигнал. 2017;10(473):eaai7696.

40. Park YH, Shin HW, Jung AR, Kwon OS, Choi YJ, Park J и др. Простатспецифические внеклеточные везикулы как новый биомаркер рака предстательной железы человека. Научный доклад 2016; 6: 1–8.

    Артикул КАС Google ученый

41. «>

    Szempruch AJ, Sykes SE, Kieft R, Dennison L, Becker AC, Gartrell A, et al. Внеклеточные везикулы Trypanosoma brucei опосредуют перенос фактора вирулентности и вызывают анемию хозяина. Клетка. 2016;164(1–2):246–57.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

42. Нгуен Д.Б., Туй Ли Т.Б., Весселинг М.С., Хиттингер М., Торге А., Девитт А. и др. Характеристика микровезикул, высвобождаемых из эритроцитов человека. Cell Physiol Biochem. 2016;38(3):1085–9.9.

    КАС пабмед Статья Google ученый

43. У И, Дэн В, Ии ДЖК. Экзосомы: улучшенные методы характеристики их морфологии. Содержание РНК и биомаркеры поверхностных белков. 2015: 6631–42.

44. Кондратов К.А., Петрова Т.А., Михайловский Ю.В., Иванова А.Н., Костарева А.А., Федоров А.В. Исследование внеклеточных везикул, выделенных из плазмы крови, проведено методом низковольтной сканирующей электронной микроскопии. Клеточная и тканевая биология Федоров В.В. 2017;11(3):181–90.

    Артикул Google ученый

45. Шао Х., Чанг Дж., Баладж Л., Чарест А., Бигнер Д.Д., Картер Б.С. и др. Белковое типирование циркулирующих микровезикул позволяет в режиме реального времени контролировать терапию глиобластомы. Нат Мед. 2012;18(12):1835–40.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

46. Чернышев В.С., Рачамадугу Р., Ценг Ю.Х., III ЛФП, Бернард П.С. Скляр М. Характеристика размера и формы гидратированных и высушенных экзосом. 2015: 3285–301.

47. Чой Х, Мун Дж.Й. Структурный анализ экзосом с использованием различных видов электронной микроскопии. 2017;47(3):171–5.

    Google ученый

48. Дьёрдь Б., Сейдж С., Инджикулян А.А. , Шеффер Д.И., Бриссон А.Р., Тан С. и др. Спасение слуха путем доставки генов в волосковые клетки внутреннего уха с использованием экзосом-ассоциированного AAV. Мол Тер. 2017;25(2):379–91.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

49. Линарес Р., Тан С., Гуну С., Арро Н., Бриссон А.Р. Высокоскоростное центрифугирование вызывает агрегацию внеклеточных везикул. Журнал внеклеточных везикул. 2015;4(1):29509-15.

50. Höög JL. Lötvall J. Разнообразие внеклеточных везикул в эякулятах человека, выявленное с помощью криоэлектронной микроскопии. 2015;3078.

51. Na K, Biran I, Aharon A, Brenner B, Talmon Y. Исследование крио-ЭМ прямой визуализации выделения внеклеточных везикул из лейкемических моноцитов. J Struct Biol. 2017;198(3):177–85.

    Артикул КАС Google ученый

52. «>

    Клинов Д., Магонов С. Истинное молекулярное разрешение в атомно-силовой микроскопии в полуконтактном режиме с зондами высокого разрешения. Appl Phys Lett. 2004;84(14):2697–9.

    КАС Статья Google ученый

53. Afm UC, Sharma S, Rasool HI, Palanisamy V, Mathisen C, Schmidt ЌM, et al. Структурно-механическая характеристика экзосом наночастиц в слюне человека. Использование корреляционной АСМ, FESEM и силовой спектроскопии. 2010;4(4):1921–6.

    Google ученый

54. Юана Ю., Оостеркамп Т.Х., Багатырова С., Эшкрофт Б., Гарсия Родригес П., Бертина Р.М. и др. Атомно-силовая микроскопия: новый подход к обнаружению наноразмерных микрочастиц крови. Джей Тромб Хемост. 2010;8(2):315–23.

    КАС пабмед Статья Google ученый

55. Hardij J, Cecchet F, Berquand A, Gheldof D, Chatelain C, Mullier F, et al. Характеристика внеклеточных везикул, несущих тканевой фактор, с помощью АСМ: сравнение АСМ в режиме постукивания по воздуху и АСМ с пиковой силой жидкости. J Экстрацелл Везикл. 2013;2(1):21045-53.

56. Шарма С., Гиллеспи Б.М., Паланисами В., Гимзевски Дж.К. Количественный биомолекулярный анализ экзосом, полученных из человеческой слюны, с помощью наноструктурной и силовой спектроскопии одиночных молекул. Ленгмюр. 2011;27(23):14394–400.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

57. Райс Б.В., Кейбл М.Д., Нельсон М.Б. In vivo визуализация светоизлучающих зондов. J Биомед Опт. 2001;6(4):432–40.

    КАС пабмед Статья Google ученый

58. Lai CP, Kim EY, Badr CE, Weissleder R, Mempel TR, Tannous BA, et al. Визуализация и отслеживание доставки внеклеточных пузырьков опухоли и трансляции РНК с использованием мультиплексированных репортеров. Нац коммун. 2015;6:7029.

    КАС пабмед Статья Google ученый

59. Такахаси Ю., Нисикава М., Шиноцука Х., Мацуи Ю., Охара С., Имаи Т. и др. Визуализация и отслеживание in vivo экзосом клеток мышиной меланомы B16-BL6 у мышей после внутривенной инъекции. Дж Биотехнолог. 2013;165(2):77–84.

    КАС пабмед Статья Google ученый

60. Лай С.П., Мардини О., Эрикссон М., Прабхакар С., Магуайр С., Чен Дж.В. и др. Динамическое биораспределение внеклеточных везикул in Vivo с использованием мультимодального репортера изображений. АКС Нано. 2014;8(1):483-94.

61. Gangadaran P, Li XJ, Lee HW, Oh JM, Kalimuthu S, Rajendran RL, et al. Новая биолюминесцентная репортерная система для изучения биораспределения систематически введенных биолюминесцентных внеклеточных везикул, полученных из опухоли, у мышей. Онкотаргет. 2017;8(66):109894–914.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

62. Бхаумик С., Гамбхир С.С. Оптическая визуализация экспрессии репортерного гена люциферазы Renilla у живых мышей. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(1):377–82.

    КАС пабмед Статья Google ученый

63. Морс Д., Таннус Б.А. Водорастворимый коэлентеразин для чувствительной визуализации кишечнополостных люцифераз in vivo. Мол Тер. 2012;20(4):692–3.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

64. Ву Дж, фон Арним АГ. Мутационная оптимизация коэлентеразин-зависимой люциферазы Renilla. Растительные методы. 2008; 4:23.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

65. «>

    Ацуши Суэцугу К.Х., Саджи С., Мориваки Х., Очия Т., Хоффман Р.М. Визуализация переноса экзосом из клеток рака молочной железы в строму в местах метастазирования в ортотопических моделях голых мышей. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65: 383–90.

    ПабМед Статья КАС Google ученый

66. Пяо Й.Дж., Ким Х.С., Хван Э.Х., Ву Дж., Чжан М., Мун В.К. Экзосомы, происходящие из клеток рака молочной железы, и поляризация макрофагов связаны с метастазированием в лимфатические узлы. Онкотаргет. 2018;9(7):7398–410.

    ПабМед Статья Google ученый

67. Уоллес П.К., Тарио Дж.Д. младший, Фишер Дж.Л., Уоллес С.С., Эрнстофф М.С., Мюрхед К.А. Отслеживание ответов, вызванных антигеном, с помощью проточной цитометрии: мониторинг пролиферации путем разбавления красителя. Цитометрия А. 2008;73(11):1019–34.

    ПабМед Статья Google ученый

68. «>

    Heinrich L, Freyria AM, Melin M, Tourneur Y, Maksoud R, Bernengo JC, et al. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с использованием диалкилкарбоцианиновых красителей для отслеживания клеток в твердых и мягких биоматериалах. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2007;81(1):153–61.

    ПабМед Статья КАС Google ученый

69. Wiklander OP, Nordin JZ, O’Loughlin A, Gustafsson Y, Corso G, Mager I, et al. Биораспределение внеклеточных везикул in vivo определяется клеточным источником, путем введения и нацеливанием. J Внеклеточные везикулы. 2015;4:26316.

    ПабМед Статья Google ученый

70. Grange C, Tapparo M, Bruno S, Chatterjee D, Quesenberry P, Tetta C, et al. Биораспределение внеклеточных везикул, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, в модели острой почечной недостаточности под наблюдением с помощью оптической визуализации. Int J Mol Med. 2014;33(5):1055-63.

71. Фик Дж., Баркер Ф.Г. 2-й, Дазин П., Вестфале Э.М., Бейер Э.К., Израиль, Массачусетс. Степень гетероклеточной связи, опосредованной щелевыми контактами, является предиктором цитотоксичности опухоли-свидетеля in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(24):11071–5.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

72. Аскенасы Н, Фаркас ДЛ. Оптическая визуализация меченых PKH гемопоэтических клеток в костном мозге реципиента in vivo. Стволовые клетки. 2002;20(6):501–13.

    ПабМед Статья Google ученый

73. Тамура Р., Уэмото С., Табата Ю. Иммуносупрессивный эффект экзосом, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, на модели повреждения печени, вызванного конканавалином А. Регенерация воспаления. 2016;36:26.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

74. «>

    Дедденс Дж. К., Врейсен К. Р., Колейн Дж. М., Эрлеманс М. И., Мец К. Х., ван дер Влист Э. Дж. и другие. Циркулирующие внеклеточные везикулы содержат микроРНК и высвобождаются в качестве ранних биомаркеров повреждения сердца. J Cardiovasc Transl Res. 2016;9(4):291–301.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья Google ученый

75. Hoekstra D, de Boer T, Klappe K, Wilschut J. Метод флуоресценции для измерения кинетики слияния биологических мембран. Биохимия. 1984;23(24):5675–81.

    КАС пабмед Статья Google ученый

76. Монтекальво А., Ларрегина А.Т., Шуфески В.Дж., Беэр Штольц Д., Салливан М.Л.Г., Карлссон Дж.М. и др. Механизм переноса функциональных микроРНК между дендритными клетками мыши через экзосомы. Кровь. 2012;119(3):756–66.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

77. «>

    Berlier JE, Rothe A, Buller G, Bradford J, Gray DR, Filanoski BJ, et al. Количественное сравнение длинноволновых красителей Alexa Fluor с красителями cy: флуоресценция красителей и их биоконъюгатов. J Гистохим Цитохим. 2003;51(12):1699–712.

    КАС пабмед Статья Google ученый

78. Hughes LD, Rawle RJ, Boxer SG. Выбирайте этикетку с умом: водорастворимые флуорофоры часто взаимодействуют с липидными бислоями. ПЛОС Один. 2014;9(2):e87649.

    ПабМед ПабМед Центральный Статья КАС Google ученый

79. Kooijmans SAA, Gitz-Francois J, Schiffelers RM, Vader P. Рекомбинантные нанотела, связывающие фосфатидилсерин, для нацеливания внеклеточных везикул на опухолевые клетки: подход plug-and-play. Наномасштаб. 2018;10(5):2413–26.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

80. «>

    Приход ЧР. Флуоресцентные красители для изучения миграции и пролиферации лимфоцитов. Иммунол Селл Биол. 1999;77(6):499–508.

    КАС пабмед Статья Google ученый

81. Эскревенте С., Келлер С., Альтевогт П., Коста Дж. Взаимодействие и поглощение экзосом клетками рака яичников. БМК Рак. 2011;11:108.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

82. Чо Э., Нам Г.Х., Хонг И., Ким Ю.К., Ким Д.Х., Ян И и др. Сравнение экзосом и наноклеток с ферритиновым белком для доставки терапевтических мембранных белков. J Управление выпуском. 2018; 279: 326–35.

    КАС пабмед Статья Google ученый

83. Мантел П.Ю., Хоанг А.Н., Голдовиц И., Поташникова Д., Хамза Б., Воробьев И. и др. Микровезикулы, полученные из эритроцитов, инфицированных малярией, опосредуют клеточную связь внутри популяции паразита и с иммунной системой хозяина. Клеточный микроб-хозяин. 2013;13(5):521–34.

    КАС пабмед ПабМед Центральный Статья Google ученый

84. Тире Г.Ф., Хоран П.К., Слезак С.Е., Смит С., Хэй Д.Б. Долгосрочное отслеживание лимфоцитов in vivo: миграция PKH-меченых лимфоцитов. Клеточный Иммунол. 1991;134(1):157–70.

    КАС пабмед Статья Google ученый

85. Nowacki M, Nazarewski L, Pokrywczynska M, Kloskowski T, Tyloch D, Pietkun K, et al. Долгосрочное влияние мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга, на ишемически-реперфузионное повреждение печени на модели крыс. Энн Трансплант. 2015;20:132–40.

    КАС пабмед Статья Google ученый

86. Скарделли М., Габер К., Бурдак С., Шейдт Ф., Хилбиг Х., Больце Дж. и др. Долгосрочная польза трансплантации клеток-предшественников нейронов плода человека в клинически адаптированной модели после черепно-мозговой травмы. J Нейротравма. 2011;28(3):401–14.

    ПабМед Статья Google ученый

87. Куффлер ДП. Долговременное выживание и размножение в культуре мотонейронов, выделенных из спинного мозга взрослых лягушек. J Комп Нейрол. 1990;302(4):729–38.

    КАС пабмед Статья Google ученый

88. Hwang DW, Choi H, Jang SC, Yoo MY, Park JY, Choi NE и др. Неинвазивная визуализация меченых экзосомами миметических нановезикул с использованием 99mTc-HMPAO. Научный доклад 2015: 1–10.

89. Эгли А., Альберто Р., Таннахилл Л., Шибли Р., Абрам У., Шаффланд А. и др. Металлоорганический 99mTc-aquaion маркирует пептид с беспрецедентно высокой удельной активностью. Журнал ядерной медицины: официальное издание, Общество ядерной медицины. 1999; 40 (11): 1913–197.

    КАС Google ученый

90. «>

    Варга З., Дюрко И., Палоци К., Бузас Э.И., Хорват И., Хегедуш Н. и др. Радиомечение внеклеточных везикул с помощью ^99m Tc для количественных исследований изображений in vivo. Рак Биотер Радиофарм. 2016;31(5):168–73.

    КАС пабмед Статья Google ученый

91. Смит Т., Куллберг М., Малик Н., Смит-Джонс П., Гранер М.В., Анчордокви Т.Дж. Биораспределение и эффективность доставки немодифицированных экзосом опухолевого происхождения. Журнал контролируемого выпуска: официальный журнал Общества контролируемого выпуска. 2015;199: 145–55.

    КАС Статья Google ученый

92. Морисита М., Такахаси Ю., Нисикава М., Сано К., Като К., Ямасита Т. и др. Количественный анализ распределения в тканях экзосом, полученных из B16BL6, с использованием слитого белка стрептавидин-лактадгерин и меченного йодом-125 производного биотина после внутривенной инъекции мышам. Дж. Фарм. 2015;104(2):705–13.

    КАС пабмед Статья Google ученый

93. Lee HW, Yoon SY, Singh TD, Choi YJ, Lee HJ, Park JY и др. Отслеживание миграции дендритных клеток в лимфатические узлы с использованием молекулярной визуализации с симпортером йодида натрия и усиленными генами люциферазы светлячка. Научный доклад 2015;5(1):9865-74.

94. Ан Британская Колумбия. Персонализированная медицина на основе радиойодной молекулярной визуализации Theranostic для лечения дифференцированного рака щитовидной железы. Биомед Рез Инт. 2016;2016.

95. Ван Y-XJ. Контрастные вещества для МРТ на основе суперпарамагнитного оксида железа: Текущее состояние клинического применения. Quant Imaging Med Surg. 2011;1(Дкк):35–44.

    ПабМед ПабМед Центральный Google ученый

96. Hu L, Wickline SA, Hood JL. Магнитно-резонансная томография экзосом меланомы в лимфатических узлах. 2015; 271 (июль 2014 г.): 266–71.

    Google ученый

97. Худ Дж. Л., Скотт М. Дж., Wickline SA. Максимизация коллоидной стабильности экзосом после электропорации. Анальная биохимия. 2014;448(1):41–9.

    КАС пабмед Статья Google ученый

98. Радомска Х.С., Экхардт Л.А. Слияние клеток млекопитающих в устройстве для электропорации. Дж Иммунол Методы. 1995;188(2):209–17.

    КАС пабмед Статья Google ученый

99. Наталья Г, Стойчева SWH. Электрослияние липосом размером с клетку. Биохим Биофиз Акта. 1994;1195(1):31–8.

    Артикул Google ученый

100. Кьельман П., Ин’т Зандт Р., Фредрикссон С., Странд С. Е. Оптимизация удержания мультимодальных визуализирующих наноструктур в сигнальных лимфатических узлах путем адаптации наноразмеров. Наномедицина. 2014;10(5):1089–95.

     КАС пабмед Статья Google ученый

101. Busato A, Bonafede R, Bontempi P, Benati D. Магнитно-резонансная томография сверхмалых суперпарамагнитных меченых оксидом железа экзосом из стволовых клеток: новый метод получения меченых экзосом. Int J Наномедицина. 2016: 2481–90.

102. Томинага Н., Косака Н., Оно М., Кацуда Т., Йошиока Ю., Тамура К. и др. Метастатические раковые клетки головного мозга высвобождают микроРНК-181c-содержащие внеклеточные везикулы, способные разрушать гематоэнцефалический барьер. Нац коммун. 2015;6.

103. Ван Ю., Баладжи В., Канияппан С., Крюгер Л., Ирсен С., Теппер К. и др. Высвобождение и транссинаптическая передача тау через экзосомы. Мол Нейродегенер. 2017;12(1):1–25.

     Артикул КАС Google ученый

Загрузить ссылки

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить г-жу Джейд Сьюан Ву за помощь в подготовке схем для субпопуляций EV, методов маркировки EV и сравнения размеров EV с различными разрешениями микроскопии.

Наличие данных и материалов

Неприменимо.

Финансирование

Эта работа была поддержана грантами Министерства науки и технологий (MOST) 104–2320-B-007-005-MY2 (C.P.L.), 106–2320-B-007-004-MY3 (C.P.L.) и Программа Academia Sinica по исследованию инновационных материалов и технологий анализа (i-MATE) AS-iMATE-107-33 (CPL).

Информация об авторе

Примечания автора

1. Стивен Тинг-Ю Чуо и Джаспер Че-Юнг Чиен внесли равный вклад в эту работу.

Авторы и филиалы

1. Институт атомных и молекулярных наук, Academia Sinica, No. 1, Roosevelt Rd., Sec. 4, Taipei, 10617, Taiwan

   Steven Ting-Yu Chuo, Jasper Che-Yung Chien & Charles Pin-Kuang Lai

2. Программа химической биологии и молекулярной биофизики, Тайваньская международная программа для выпускников, Academia Sinica, Тайбэй, Тайвань

   Charles Pin-Kuang Lai

3. Программа получения степени в области генома и системной биологии, Национальный Тайваньский университет и академия Sinica, Тайбэй, Тайвань

   Charles Pin-Kuang Lai

Авторы

1. Steven Ting-Yu Chuo

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

2. Jasper Che-Yung Chien

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

3. Charles Pin-Kuang Lai

   Просмотр публикаций автора

   Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

Взносы

S. T.C. составил Введение, визуализация EV с помощью биолюминесцентных и флуоресцентных репортеров. J.C.C. подготовленная визуализация ЭВ с помощью ЭМ, АСМ, ОФЭКТ, МРТ и выводы. C.P.L. задумал и скоординировал рецензию, подготовил реферат и помог отредактировать рукопись. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Автор, ответственный за переписку

Чарльз Пин-Куанг Лай.

Декларации этики

Одобрение этики и согласие на участие

Неприменимо.

Согласие на публикацию

Неприменимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья распространяется на условиях международной лицензии Creative Commons Attribution 4. 0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное использование, распространение, и воспроизведение на любом носителе, при условии, что вы укажете автора(ов) оригинала и источник, предоставите ссылку на лицензию Creative Commons и укажете, были ли внесены изменения. Отказ от права Creative Commons на общественное достояние (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) применяется к данным, представленным в этой статье, если не указано иное.

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

Экзосома и маркировка EV — Мембраны Biotium

EV Membrane Flainting

Super -Resolation Super -Resolation Microspor Мембранные красители прошли валидацию для визуализации изолированных ЭВ с высоким разрешением dSTORM

Антитела ExoBrite™ для проточной цитометрии

Валидированные антитела для обнаружения маркеров экзосом в очищенных или связанных с шариками экзосомах с помощью проточной цитометрии

Антитела ExoBrite™ для вестерн-блоттинга

Валидированные антитела для обнаружения маркеров экзосом в экстрактах EV методом вестерн-блоттинга из одной клетки в другую. Существует несколько подтипов электромобилей, которые различаются по функциям, грузу и размеру, который может варьироваться от ~ 30 до 1000 нм в диаметре. Наименьшим типом EV является экзосома размером ~ 30-150 нм. EV возникают внутри клеточного компартмента, называемого мультивезикулярным тельцем (MVB), которое само происходит от инвагинации эндосом. Везикулы высвобождаются, когда MVB ​​сливается с плазматической мембраной и высвобождает свой груз.

В биомедицинских исследованиях экзосомы и их груз используются в качестве диагностических биомаркеров рака и других заболеваний. ЭВ и экзосомы могут быть выделены из крови или других биологических жидкостей с использованием таких методов, как ультрацентрифугирование, преципитация ПЭГ и гранулы для иммунозахвата.

Мембраны экзосом содержат трансмембранные белки, происходящие из плазматической мембраны исходной клетки, которые часто включают белки семейства тетраспанинов (такие как CD9, CD63 и CD81). Внутри экзосомы содержат цитоплазматические компоненты, такие как белки и РНК. Компоненты экзосом можно анализировать с помощью таких методов, как РНКсек, вестерн-блоттинг и проточная цитометрия. Для характеристики с помощью проточной цитометрии исследователи могут использовать красители, окрашивающие компоненты экзосом, такие как мембраны и нуклеиновые кислоты, и антитела, которые связываются с тетраспанинами или другими интересующими белками.

Прочтите статью в нашем блоге, чтобы узнать больше об экзосомах и их растущем потенциале как в медицине, так и в исследованиях.

 

Анализ экзосом: маленькие цели, большая проблема

Небольшой размер экзосом усложняет работу с ними и их анализ. В проточной цитометрии экзосомы бывает трудно отличить от клеточного дебриса и других мелких частиц, поскольку их размер находится на уровне или ниже пределов чувствительности некоторых проточных цитометров. Окрашивание некоторыми красителями или антителами может помочь отличить экзосомы от других частиц. Однако важно использовать красители, которые не будут образовывать агрегаты, поскольку сами эти мелкие частицы можно спутать с окрашенными экзосомами. Такие агрегаты разочаровали исследователей экзосом.

Метод, используемый для обогащения или очистки электромобилей перед анализом, также является важным фактором. Образцы, обогащенные простой стадией осаждения ПЭГ, часто содержат большое количество липидных частиц, отличных от EV, которые также могут связываться с мембранными красителями. Эти примеси можно уменьшить, используя другие методы очистки EV, такие как эксклюзионная хроматография (SEC) или иммунопреципитация. Магнитные шарики, связанные с антителами против тетраспанина, могут давать кластеры чистых экзосом. Однако эти гранулы могут неспецифически связываться со многими гидрофобными красителями, такими как мембранные красители.

Мы провели скрининг большой коллекции наших антител и красителей, чтобы найти те из них, которые хорошо окрашивают экзосомы и демонстрируют минимальную агрегацию или отсутствие агрегации (т. е. сигнализируют об отсутствии экзосом). Продолжайте читать ниже, чтобы изучить наши проверенные антитела и красители EV.

Окрашивание экзосом, которому вы можете доверять

Наборы для окрашивания мембран ExoBrite™ EV были разработаны для решения некоторых проблем обнаружения экзосом. Красители ExoBrite™ связываются с молекулами экзосомальной мембраны, обеспечивая яркое специфическое окрашивание изолированных ЭВ с помощью проточной цитометрии. Ключевым преимуществом красителей ExoBrite™ является то, что, в отличие от многих других красителей, они практически не показывают фоновых агрегатов такого же размера, как экзосомы или EV. Кроме того, в отличие от большинства мембранных красителей, красители ExoBrite™ не связываются неспецифически с гранулами полистирола, что означает, что их можно использовать для окрашивания экзосом, связанных с гранулами.

Мембранные красители ExoBrite™ EV были проверены в проточной цитометрии на их способность окрашивать экзосомы и EV, полученные из нескольких различных культивируемых клеточных линий и выделенные несколькими различными методами, включая эксклюзионную хроматографию (SEC), преципитацию полиэтиленгликолем (PEG) и иммунопреципитация на магнитных шариках (IP).

ExoBrite™ EV Membrane Stain Преимущества:

• Предназначен для обнаружения экзосом с помощью проточной цитометрии
• Яркая флуоресценция и низкий фон для отличного отношения сигнал/шум
• Совместим с совместным окрашиванием антителами (в отличие от CellBrite® Fix или MemBrite® Fix)
• Экзосомы, очищенные красителем или связанные с гранулами
• Доступен в 4 цветах для гибкого экспериментального дизайна

SEC-очищенных экзосом, полученных из MCF-7, окрашивали мембранными красителями ExoBrite™ EV.

Меньший фон и лучшее покрытие по сравнению с другими красителями экзосом/EV Мембранные красители

ExoBrite™ EV имеют меньший фон и более полное окрашивание экзосом, чем другие классические красители или красители конкурентов. Экзосомы очищали из супернатанта клеток MCF-7 с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенные экзосомы окрашивали в PBS указанными красителями (верхний ряд). Популяция экзосом была закрыта, число показывало процент частиц, попавших в ворота экзосомы. Каждый краситель также добавляли к отфильтрованному PBS (нижний ряд) для выявления агрегации красителя и неспецифического фона. Красные стрелки указывают на эти агрегаты красителя. Липофильные красители, такие как DiO, содержат большое количество частиц, сходных по размеру с экзосомами, что делает их непригодными для окрашивания экзосом. CellMask™ также показывает неприемлемую степень агрегации красителя, попадающую в ворота экзосомы. Красители ExoFlow-ONE™ и ExoGlow™ образуют агрегаты, которые в основном можно отделить от настоящих экзосом, но они также демонстрируют менее полное покрытие экзосом, чем мембранные красители ExoBrite™ (щелкните, чтобы увеличить).

Очищенные экзосомы, окрашенные красителем для мембран ExoBrite™ EV Очищенные SEC экзосомы, полученные из MCF-7, были окрашены красителем для мембран ExoBrite™ 490/515 EV (справа). Видно специфическое окрашивание по сравнению с тем же окрашиванием в буфере (слева). Экзосомы были обнаружены на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале FITC. Очищенные SEC экзосомы, полученные из MCF-7, были окрашены мембранным красителем ExoBrite™ 560/585 EV (справа). Видно специфическое окрашивание по сравнению с тем же окрашиванием в буфере (слева). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале PE.

Связанные с шариками EV, окрашенные мембраной ExoBrite™ EV, окрашивают Проточная цитометрия связанных с шариками экзосом, полученных из клеток MCF-7. Неокрашенные экзосомы (серые) или окрашенные 10X ExoBrite™ 490/515 (зеленые). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале FITC. Проточная цитометрия экзосом, связанных с гранулами, полученных из клеток MCF-7. Неокрашенные экзосомы (серые) или окрашенные 10X ExoBrite™ 560/585 (оранжевые). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале R-PE. Проточная цитометрия экзосом, связанных с шариками, полученных из клеток MCF-7. Неокрашенные экзосомы (серые) или совместно окрашенные с 10X ExoBrite™ 490/515 и CD9(h29a)-CF®568 (розовый). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в каналах FITC и R-PE. Проточная цитометрия экзосом, связанных с шариками, полученных из клеток MCF-7. Неокрашенные экзосомы (серые) или совместно окрашенные 10X ExoBrite™ 560/585 и CD81-CF®488A (розовые). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в каналах FITC и R-PE.

Окрашивание мембран ExoBrite™ EV/совместное окрашивание антителами

Одним из преимуществ красителей ExoBrite™ EV Membrane Stains является возможность совместного окрашивания антителами для изучения профилей белков экзосом. Совместное окрашивание можно проводить одновременно или последовательно, а также на очищенных экзосомах или экзосомах, связанных с гранулами. ExoBrite™ EV Membrane Stains — это обычные красители экзосом, которые должны маркировать все экзосомы в образце*, позволяя использовать антитела для количественного определения того, сколько экзосом экспрессируют интересующий белок. Например, в протестированных нами экзосомах (производных MCF-7) тетраспанин CD9экспрессируется в высокой степени и повсеместно. ** Мы обнаружили, что при совместном окрашивании с помощью ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain и CD9(h29a)-CF®488A они показывают почти полное перекрытие их положительных популяций (см. , Правильно).

Советы по оптимальному совместному окрашиванию очищенных экзосом ExoBrite™/антител:

• Окрашивание очищенных экзосом в 1 мл с помощью 10X ExoBrite™ (окрашивание ExoBrite™ несколько снижается при одновременном совместном окрашивании, поэтому однократное окрашивание не рекомендуется)
• Попробуйте начать с не менее 0,1 мкг/мл антитела

*В экзосомах, которые мы тестировали, красители ExoBrite™ EV Membrane Stains маркируют все экзосомы. Могут быть типы экзосом с разным уровнем окрашивания.

**Уровни экспрессии белков тетраспанина (CD9, CD61 и CD81) и других белков сильно различаются между типами клеток и источниками экзосом.

очищенных SEC экзосом, полученных из MCF-7, окрашивали одновременно 1 мл 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain и 0,1 мкг/мл CD9(h29a)-CF®488A. При гейтировании на ExoBrite™ 560/585-положительных частицах ~95% также были положительными на CD9 (верхний ряд). Аналогичным образом, при гейтировании CD9-положительных частиц около 95% также были положительными для ExoBrite™ 560/585 (нижний ряд)

CellMask — торговая марка Thermo Fisher Scientific; ExoFlow-ONE и ExoGlow являются товарными знаками компании System Biosciences.

Видеть за дифракционным пределом с помощью красителей ExoBrite

™ EV

Характеристика экзосом и EV с помощью визуализации остается сложной задачей из-за их небольшого размера и ограниченного разрешения световой микроскопии. Методы микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как микроскопия прямой стохастической оптической реконструкции (dSTORM), выходят за пределы дифракционного предела традиционной световой микроскопии, обеспечивая разрешение отдельных молекул субклеточных структур, таких как электромобили. Окрашивание мембран EV ExoBrite™ было подтверждено для dSTORM с помощью наноимаджера ONI, что позволяет изучать мелкие морфологические детали и проводить совместное окрашивание с биомаркерами EV, такими как тетраспаниновые белки CD9. , CD63 и CD81.

• Мембранные красители ExoBrite™ 560/585 и 650/665 EV одобрены для визуализации EV dSTORM
• Узнайте больше о морфологии и структуре везикул
• Позволяет проводить совместное окрашивание и локализацию антител с биомаркерами EV

Изображения dSTORM со сверхвысоким разрешением EV, полученных из клеточной линии колоректального рака человека, окрашенных на тетраспанины и с помощью красителей ExoBrite™ в концентрации 1x. ЭВ, окрашенные ExoBrite™ 560/585 (синий) и CD9, меченный CF®647, коктейль антител CD63 и CD81 (фиолетовый) (слева). ЭВ, окрашенные ExoBrite™ 650/665 (фиолетовый), антитело к CD63, меченное CF®568 (синее), и антитело к CD9, меченное CF®488A (желтое) (справа). Образцы были подготовлены с использованием анализа ONI EV Profiler и получены с использованием ONI Nanoimager. Данные обрабатывались с использованием бета-версии онлайн-платформы анализа данных микроскопии локализации ONI под названием CODI.

Валидированные антитела для обнаружения маркеров экзосом с помощью проточной цитометрии

Наиболее распространенными белками, используемыми в качестве маркеров экзосом, являются CD9, CD63 и CD81, члены семейства тетраспанинов. Хотя антитела, нацеленные на эти белки, доступны у коммерческих поставщиков, лишь немногие из них проверены или хорошо работают для обнаружения EV или экзосом. Конъюгаты ExoBrite™ Flow Antibody Conjugate были разработаны и утверждены для проточной цитометрии, чтобы обеспечить яркий сигнал и низкий фон маркеров экзосом в очищенных экзосомах, связанных с гранулами.

ExoBrite™ Isotype Control Flow Антитела, которые не реагируют ни с одной мишенью в клетках человека и имеют тот же изотип, что и антитела к тетраспанину, также доступны в качестве отрицательного контроля.

Преимущества ExoBrite™ Flow Antibody:

• Разработано для обнаружения маркеров экзосом CD9, CD63 и CD81 с помощью проточной цитометрии
• Валидировано для очищенных экзосом или связанных с гранулами экзосом
• Яркий сигнал и низкий фон
• Доступно антитело ExoBrite™ Isotype Control Flow
• Доступны цвета для каналов Pacific Blue™, FITC и PE

Очищенные экзосомы, окрашенные с помощью ExoBrite™ Flow Antibodies Очищенные SEC экзосомы, полученные из MCF-7, были окрашены с помощью ExoBrite™ CD9560/585 Flow Antibody (слева). Видно специфическое окрашивание по сравнению с тем же антителом в буфере (справа). Экзосомы были обнаружены на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале PE. Очищенные SEC экзосомы, полученные из MCF-7, были окрашены с помощью ExoBrite™ CD63 490/515 Flow Antibody (слева). Видно специфическое окрашивание по сравнению с тем же антителом в буфере (справа). Экзосомы были обнаружены на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале FITC. Очищенные SEC экзосомы, полученные из MCF-7, были окрашены ExoBrite™ CD81 49.0/515 Flow Antibody (слева). Видно специфическое окрашивание по сравнению с тем же антителом в буфере (справа). Экзосомы выявляли на проточном цитометре CytoFLEX LX в канале FITC.

Утвержденные антитела для обнаружения экзосомных маркеров с помощью вестерн-блоттинга

ExoBrite™ Western Antibody были проверены на наличие яркого сигнала и низкого фона маркеров экзосом CD9, CD63 и CD81 в экстрактах EV с помощью флуоресцентного вестерн-блоттинга в ближней ИК области спектра. Антитела доступны с двумя флуоресцентными красителями ближнего инфракрасного диапазона, ExoBrite™ 680/700 и ExoBrite™ 770/800, которые обеспечивают большее отношение сигнал-шум, чем красители с излучением видимого света для вестерн-блоттинга.

Антитело ExoBrite™ Calnexin Western обнаруживает белок эндоплазматического ретикулума, который не обнаружен в экзосомах. Он предлагается в качестве отрицательного контроля для оценки чистоты выделенных экстрактов экзосом.

Преимущества ExoBrite™ Western Antibody:

• Разработано для обнаружения маркеров экзосом CD9, CD63 и CD81 с помощью флуоресцентного вестерн-блоттинга
• Утверждено для использования с экстрактами EV
• Яркий сигнал и низкий фон
• Доступен в 2 цветах ближнего инфракрасного диапазона
• Отрицательный контроль ExoBrite™ Calnexin Western Антитело доступно

Вестерн-детекция CD9 человека в клетках MCF-7 и лизате экзосом с использованием ExoBrite™ 680/700 CD9 Western Antibody, показывающая обогащение CD9 в препарате экзосом. Вестерн-детекция CD63 человека в клетках MCF-7 и лизате экзосом с использованием ExoBrite™ 680 /700 CD63 Western Antibody, демонстрирующее обогащение CD63 в препарате экзосомы. Обнаружение по Вестерну CD81 человека в клетках MCF-7 и лизате экзосом с использованием ExoBrite™ 680/700 CD81 Western Antibody, демонстрирующее обогащение CD81 в препарате экзосом. кальнексин человека в клетках MCF-7 и лизате экзосом с использованием антител ExoBrite™ 770/800 calnexin Western, демонстрирующих отсутствие калнексина в препарате экзосом.

Вернуться к началу

Объяснение элементов аккумуляторной батареи электромобиля

Заглавное фото: Аккумулятор для электромобиля Дизайн любезно предоставлен Tech Space

Аккумуляторы для электромобилей являются одним из наиболее важных компонентов электромобилей, и они являются самыми дорогими. Заменив двигатели внутреннего сгорания, они могут резко сократить загрязнение окружающей среды во всем мире, поскольку в настоящее время на транспорт приходится 27% мировых выбросов парниковых газов.

Аккумуляторы электромобилей состоят из элементов, причем существует множество типов элементов. В этой статье мы разобьем их на категории и рассмотрим наиболее важные типы. Мы также обсудим возможные будущие типы ячеек и то, как они могут изменить автомобильную промышленность.

1. 3 формата ячеек, используемых в аккумуляторах электромобилей
2. Наиболее распространенные химические элементы, используемые в электромобилях
3. Энергетические элементы и силовые элементы: в чем разница?
4. Суперконденсаторы и ультраконденсаторы для повышения мощности
5. Будущие типы аккумуляторов для электромобилей

Три формата элементов, используемых в аккумуляторах электромобилей

В электромобилях используются три основных типа элементов аккумуляторов: цилиндрические элементы, призматические элементы и карманные элементы. Существуют также батарейки типа «таблетка», которые используются в исследованиях и разработках для целей тестирования, но на самом деле никогда не используются в электромобилях.

Количество ячеек в EV сильно различается в зависимости от формата ячеек. В среднем электромобили с цилиндрическими ячейками имеют от 5000 до 9000 ячеек. Это резко контрастирует с клетками мешочка, в которых всего несколько сотен клеток, и еще меньше в призматических клетках.

Цилиндрические элементы

Цилиндрические элементы являются наименее дорогим форматом в производстве, поскольку они уже заключены в корпус, обеспечивающий хорошую механическую прочность. Эта технология не только экономически эффективна, но и является зрелой, что делает ее формат простым в производстве.

Из-за своей формы цилиндрические ячейки имеют ограничения по мощности. По этой причине электромобили с батареями меньшего размера, такие как гибридные автомобили, используют мешочные или призматические элементы для обеспечения большей мощности при ускорении.

Цилиндрические элементы должны изготавливаться меньшего размера, чем элементы других типов, чтобы они хорошо рассеивали тепло и продлевали срок службы батарей. Вот почему наиболее распространенными форматами цилиндрических элементов являются 18650 и 21700. Более крупные форматы, такие как 4680, жизнеспособны, поскольку их новая внутренняя конструкция обеспечивает более эффективную передачу тепла термоклеям, используемым в конструкционных батареях.

Призматические ячейки

Призматические ячейки могут быть от 20 до 100 раз больше цилиндрических ячеек. Как правило, они могут обеспечивать большую мощность и хранить больше энергии при том же объеме, поскольку для корпуса используется меньше материала. Форма и толщина корпуса также обеспечивают лучший отвод тепла по сравнению с цилиндрическими элементами.

Призматические элементы популярны среди китайских производителей, потому что их предпочтительный химический состав элементов (литий-железо-фосфатный аккумулятор) в настоящее время в основном существует в призматическом формате. В последнее время в мире все большую популярность приобретают призматические элементы. В то время как цилиндрические ячейки были наиболее популярным форматом, призматические ячейки могут занять большую долю рынка в ближайшие годы.

Ячейки-мешочки

Ячейки-мешочки обеспечивают большую мощность, чем ячейки других типов. Они также очень эффективны, когда дело доходит до использования пространства. Однако их мягкий пластиковый корпус означает, что они имеют самую низкую механическую прочность среди всех типов элементов. По этой причине во время сборки ячеек мешочка необходимо добавить дополнительную структуру, чтобы защитить их от механических повреждений.

Наиболее распространенные химические элементы, используемые в электромобилях

Химический состав элемента представляет собой смесь материалов в батарее, которая делает возможным совместное использование электронов между двумя электродами (анод и катод) для получения желаемого электрического потенциала. Электроны переходят с одного электрода на другой и наоборот.

Существует множество химий, и в каждой из них используются разные материалы, которые имеют разную стоимость. Химический состав элемента оказывает огромное влияние на стоимость батареи. Поскольку аккумулятор является самой дорогой частью электромобиля, это важно учитывать, когда речь идет о минимизации производственных затрат.

Вот наиболее распространенные химические элементы, используемые в электромобилях:

• Литий-ионные (Li-Ion): Литий-ионные элементы являются наиболее популярными типами элементов из-за их экономической эффективности. Они предлагают лучший компромисс между емкостью хранения энергии и экономической эффективностью. Существует много типов литий-ионных аккумуляторов. Например, в Tesla Model 3 до 2021 года использовались элементы NCA (литий-никель-кобальт-алюминий). В Китае в некоторых автомобилях Tesla Model 3 теперь используются элементы LFP (литий-фосфат железа).
• Никель-марганцево-кобальтовые (NMC): Никель-марганцево-кобальтовые элементы обеспечивают отличный баланс между мощностью и энергией. Они были любимой химией для двух поколений Chevy Volts.
• Никель-металл-гидрид (Ni-MH): Никель-металл-гидрид использовался в самых первых гибридных автомобилях, таких как Prius, потому что в то время это была самая доступная технология. В настоящее время они в основном уступают литиевым батареям, но все еще используются в некоторых гибридных электромобилях, таких как Toyota Highlander 2020 года.
• Литий-серный (Li-S): Литий-серные элементы обладают высокой энергоемкостью, что делает их привлекательными для автобусов электромобилей. Однако их необходимо нагреть, прежде чем ими можно будет управлять, что делает их использование более сложным и менее привлекательным.
• Свинцово-кислотные: Свинцово-кислотные аккумуляторы десятилетиями использовались в самых популярных электромобилях: тележках для гольфа! Хотя их производительность низка по сравнению с другими типами ячеек, этого достаточно для удовлетворения потребностей низкопроизводительных электромобилей, таких как тележки для гольфа. Свинцово-кислотные аккумуляторы неприхотливы в обслуживании и легко заменяются. В отличие от других типов аккумуляторов, механикам не нужно обращаться к производителям аккумуляторов для обслуживания и замены. Но теперь, когда литий-ионные аккумуляторы становятся дешевле и доступнее, популярность свинцово-кислотных аккумуляторов падает, поскольку вместо них в некоторых тележках для гольфа начинают использоваться литий-ионные аккумуляторы.

Энергетические элементы и силовые элементы: в чем разница?

Изображение предоставлено   : FreeingEnergy

 

Аккумуляторы можно оптимизировать для хранения большего количества энергии (энергетические элементы) или обеспечения большей мощности (силовые элементы). Как правило, более целесообразно использовать энергетические элементы в больших батареях и силовые элементы в меньших. По мере того, как батарея становится больше, общая мощность распределяется между большим количеством ячеек, и каждая ячейка должна обеспечивать меньшую мощность.

Гибридные автомобили, например, имеют меньшую батарею и часто требуют элементов питания. Элементы питания позволяют уменьшить размер батареи при удовлетворении потребностей в электроэнергии.

Элементы питания не ограничиваются батареями меньшего размера. Они также используются в высокопроизводительных электромобилях, таких как Formula E. Фактически, они хорошо адаптированы к любому транспортному средству с низкой автономностью и высокой потребляемой мощностью.

Суперконденсаторы и ультраконденсаторы для повышения мощности

Суперконденсаторы и ультраконденсаторы похожи на батареи в том, что они являются системами накопления энергии, но это не совсем одно и то же. В то время как батареи используют химические реакции для хранения энергии, ультраконденсаторы накапливают электростатический заряд.

Ультраконденсаторы обладают высокой пропускной способностью и используются вместе с батареями для повышения мощности. Они могут отдавать большую мощность за короткое время, и они могут делать это сотни тысяч раз без существенного ухудшения.

Ультраконденсаторы имеют очень низкую плотность энергии, поэтому они не влияют на запас хода батареи. Но когда они смешаны в литий-ионном аккумуляторе, они очень хорошо справляются с потреблением мощности и энергии. Ультраконденсаторы существуют для больших скачков напряжения. Аккумуляторы там для высокой автономности.

Из-за важности ультраконденсаторов для аккумуляторов Tesla купила Maxwell Technologies в 2019 году, крупную компанию по производству ультраконденсаторов, чтобы дополнить свои исследования аккумуляторов.

Посмотрите следующее видео, чтобы получить более широкое представление о суперконденсаторах.

 

Будущие типы аккумуляторов для электромобилей

В настоящее время разрабатываются новые типы аккумуляторов для электромобилей, которые выводят электромобили на новый уровень с точки зрения мощности, запаса хода, производственных затрат и т. д.

Одной из самых многообещающих технологий является твердотельная батарея. Технология аналогична литий-ионным батареям, но вместо жидкого используется твердый электролит. Твердотельные батареи обеспечат более быструю зарядку, большую мощность и более низкие производственные затраты. Ожидается, что они будут готовы к выходу на рынок примерно к 2030 году.

Технология жидкостно-воздушных аккумуляторов, еще одна разработка, использующая воздух для хранения энергии, также очень перспективна, но еще далека от готовности из-за короткого жизненного цикла. Мохаммад Асади, доцент кафедры химического машиностроения, объясняет значение этой технологии для электромобилей:

Представьте, что сегодня у вас есть электромобиль, который может проехать всего 300 миль без подзарядки.

No related posts.