РНК — PacBio

Соглашение об использовании изображения

Загружая, копируя или используя изображения, размещенные на этом веб-сайте («Сайт»), вы подтверждаете, что прочитали, поняли и согласны с условиями настоящего Соглашения об использовании изображений, а также с условиями, приведенными на веб-страницу Юридические уведомления, которые вместе регулируют использование вами изображений, как указано ниже.Если вы не согласны с такими условиями, не загружайте, не копируйте и не используйте изображения каким-либо образом, если у вас нет письменного разрешения, подписанного уполномоченным представителем Pacific Biosciences.

В соответствии с условиями настоящего Соглашения и условиями, приведенными на веб-странице Юридических уведомлений (в той степени, в которой они не противоречат условиям настоящего Соглашения), вы можете использовать изображения на Сайте исключительно для (а) редакционного использования в прессе. и / или отраслевых аналитиков, (б) в связи с обычной, рецензируемой, научной публикацией, книгой или презентацией и т.п.Вы не можете изменять или модифицировать любое изображение, полностью или частично, по любой причине. Вы не можете использовать какое-либо изображение таким образом, чтобы искажать представление о связанных продуктах, услугах или технологиях Pacific Biosciences или о любых связанных с ними характеристиках, данных или свойствах. Вы также не можете использовать любое изображение способом, который обозначает какое-либо представление или гарантию (явную, подразумеваемую или установленную законом) от Pacific Biosciences в отношении продукта, услуги или технологии. Права, предоставляемые настоящим Соглашением, являются личными для вас и не могут быть переданы вами другой стороне.

Вы, а не Pacific Biosciences, несете ответственность за использование изображений. Вы признаете и соглашаетесь с тем, что любое неправильное использование изображений или нарушение настоящего Соглашения нанесет компании Pacific Biosciences непоправимый вред. Pacific Biosciences является владельцем или лицензиатом изображения, но не агентом владельца. Вы соглашаетесь предоставить Pacific Biosciences следующую кредитную линию: «Предоставлено Pacific Biosciences of California, Inc., Menlo Park, CA, USA», а также включаете любые другие кредиты или благодарности, отмеченные Pacific Biosciences.Вы должны включить любое уведомление об авторских правах, изначально включенное в изображения, на всех копиях.

ИЗОБРАЖЕНИЙ ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ Pacific Biosciences «КАК ЕСТЬ». Pacific Biosciences ОТКАЗЫВАЕТСЯ ОТ ВСЕХ ЗАЯВЛЕНИЙ И ГАРАНТИЙ, ЯВНЫХ, ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ ИЛИ ЗАКОНОДАТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЙ, ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЬ ​​НАРУШЕНИЕМ, СОБСТВЕННОСТЬЮ, КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТЬЮ И ПРИГОДНОСТЬЮ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ ЦЕЛИ. НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ Pacific Biosciences НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБЫЕ ПРЯМЫЕ, КОСВЕННЫЕ, СЛУЧАЙНЫЕ, КАЧЕСТВЕННЫЕ ИЛИ КОСВЕННЫЕ УБЫТКИ ЛЮБОГО ТИПА, КАСАЮЩИЕСЯ ИЗОБРАЖЕНИЙ.

Вы соглашаетесь с тем, что Pacific Biosciences может прекратить ваш доступ и использование изображений, размещенных на веб-сайте PacificBiosciences.com, в любое время и без предварительного уведомления, если компания сочтет, что вы нарушили какое-либо из условий настоящего Соглашения об использовании изображений. Вы соглашаетесь возмещать, защищать и оградить Pacific Biosciences, ее должностных лиц, директоров, сотрудников, агентов, лицензиаров, поставщиков и любых сторонних поставщиков информации на Сайт от всех убытков, расходов, убытков и издержек, включая разумные гонорары адвокатам. в результате любого нарушения вами условий настоящего Соглашения об использовании изображений или прекращения Pacific Biosciences вашего доступа к Сайту или его использования.Прекращение действия не повлияет на права Pacific Biosciences или ваши обязательства, возникшие до прекращения.

Освещая темную сторону человеческого транскриптома с помощью секвенирования транскриптов с длинным считыванием | BMC Genomics

TAMA — аннотация транскриптомов с помощью модульных алгоритмов

TAMA состоит из модульных инструментов с прозрачными алгоритмами, точным контролем параметров и отслеживаемыми выходными данными, позволяющими пользователям анализировать, интерпретировать и диагностировать полученные модели расшифровки.Основные функции анализа состоят из двух модулей: TAMA Collapse и TAMA Merge.

TAMA Collapse использует сопоставленные чтения и сборку эталонного генома для создания аннотации транскриптома. TAMA Collapse использует четыре основных метода определения истинных стыков: фильтрация качества выравнивания, фильтрация ошибок локальной плотности (LDE), ранжирование стыков и покрытие стыков. Все эти методы могут быть настроены пользователем. Во-первых, применяется фильтрация качества выравнивания путем оценки охвата длины выравнивания и идентичности выравнивания каждого отображенного считывания относительно эталонного генома.Чтения ниже пороговых значений, определенных пользователем, отбрасываются. Чтения, прошедшие этот первый шаг, затем проверяются с помощью алгоритма LDE на количество несовпадений, фланкирующих каждое предсказанное стыковочное соединение. Ошибки вокруг стыков усугубляют неправильное сопоставление и вызывают предсказание ложных стыков. Эта оценка удаляет считывания с высокой плотностью ошибок в пределах указанного расстояния пары оснований от каждого стыка. Остальные считывания затем группируются на основе структуры экзон-интрон с учетом определяемых пользователем различий (называемых колебанием в номенклатуре ТАМА) в начале и концах экзонов, измеренных в парах оснований (рис.1в). Прогнозируемые стыковые соединения для сгруппированных считываний затем ранжируются на основе профилей несоответствия флангов и покрытия. Затем в окончательной модели транскрипции используются стыки с наивысшим рейтингом. Большой порог колебания может помочь устранить ложные положительные прогнозы для соединений сращивания, но может удалить реальные соединения сращивания в пределах длины колебания. Таким образом, алгоритм LDE и ранжирование сращивания стыков позволяют уменьшить длину колебания, а также уменьшить количество ложных предсказаний сращивания стыков.

В дополнение к строгой идентификации стыковых соединений, TAMA Collapse также позволяет учитывать достоверность начальных сайтов транскрипции, выполняя программу в ограниченном или не закрытом режиме. Например, для 5′-захваченных РНК режим кэпа позволит сохранить транскрипты с альтернативными стартовыми сайтами транскриптов; в то время как для не 5′-захваченных РНК режим без кэпинга удаляет модели транскриптов, которые кажутся 5′-деградированными. Режим кэпа требует, чтобы сгруппированные отображенные чтения имели одинаковое количество экзонов и одинаковую структуру экзон-интрон.Режим без кэпа аналогичен режиму с кэпом, но позволяет сгруппированным считываниям иметь различия в количестве экзонов на 5′-конце, отражая считывания, полученные из РНК с деградацией с 5′-конца. Таким образом, все предсказанные сплайсинговые соединения для более короткой отображенной модели считывания и 3′-конца должны совпадать с таковыми для более длинной модели. Эти два метода группировки описаны в предыдущем исследовании, в котором они были названы коллапсом сайта начала транскрипции (эквивалентно закрытому режиму) и каскадному коллапсу экзонов (эквивалентному не закрытому режиму) [4].

В дополнение к сборке транскриптома, TAMA Collapse также выводит подробную информацию, показывающую качество отображения считывания, свернутые группы считывания, предсказанные вариации последовательности и модели транскриптов с 3′-геномным поли-А (геномное загрязнение или усеченный транскрипт). Эти выходные данные предназначены для того, чтобы предоставить пользователям полное представление о поведении TAMA Collapse и, таким образом, позволить пользователям отслеживать, диагностировать и улучшать свои сборки транскриптомов.

TAMA Merge объединяет модели транскриптов путем изучения экзон-интронных структур моделей транскриптов для создания неизбыточного набора генов и транскриптов.TAMA Merge можно использовать для аннотации одного входного транскриптома, чтобы удалить избыточность, или можно использовать для аннотации нескольких транскриптомов для создания единой аннотации. TAMA Merge также создает выходные файлы, которые можно использовать для понимания различий между входными аннотациями. TAMA Merge использует те же алгоритмы режима сворачивания, что и TAMA Collapse. Одной из уникальных особенностей TAMA Merge является возможность объединять сборки транскриптов путем назначения различных режимов сворачивания и приоритетов функций модели транскрипции между разными аннотациями.Например, при использовании TAMA Merge для комбинирования аннотации, полученной при последовательном считывании, со справочной аннотацией, справочной аннотации можно дать приоритет для сайтов начала / конца транскрипции и стыков сплайсинга. Аннотации, созданные пользователем, также можно установить в режим без ограничения, чтобы модели, созданные пользователем, свернулись с опорными моделями длиной 5 футов. Выходные файлы TAMA Merge включают подробные отчеты о том, как было выполнено слияние. Эти файлы отчетов показывают, какие входные аннотации поддерживали каждую из окончательных моделей транскриптов и генов, а также количество колебаний, которые произошли в начале и конце каждого экзона между объединенными моделями.

Наряду с TAMA Collapse и TAMA Merge, набор инструментов TAMA содержит множество других инструментов, которые либо применяют дополнительные фильтры, либо добавляют информацию. Другие инструменты TAMA, используемые в этом исследовании, более подробно описаны в разделе «Методы». Более подробное описание того, как работает TAMA, можно найти здесь: github.com/GenomeRIK/tama/wiki/.

Бенчмаркинг TAMA и связанного программного обеспечения

Мы протестировали сборку транскриптомов на основе длинного чтения TAMA, Stringtie2 [9], TALON [10] и Cupcake [7], используя три различных набора данных: смоделированные данные PacBio, смоделированные данные Nanopore и PacBio. Sequel II Iso-Seq данные из контрольной смеси Lexogen’s Spike-in RNA Variant (SIRV).Смоделированные считывания PacBio и Nanopore были получены в предыдущем исследовании [11] с использованием PBSIM [12], а также использовались для сравнительного анализа в исследовании Stringtie2 [9]. Моделируемые наборы данных были основаны на аннотациях хромосомы 19 справочной аннотации человека. Подробности смоделированных и человеческих наборов данных можно найти в дополнительных файлах (Таблица S1). Используя эти смоделированные наборы данных, исследование Stringtie2 показало, что Stringtie2 превзошел FLAIR [13] и Traphlor [14]. Мы использовали тот же метод оценки, что и в исследовании Stringtie2.Хотя эти смоделированные наборы данных полезны из-за наличия достоверной информации, они не совсем точны в своем представлении длинных считываемых данных секвенирования. В частности, моделируемые чтения были созданы путем случайной фрагментации моделей транскриптов, что нереально, поскольку фрагментация транскриптов не является случайной и зависит от характеристик последовательности и методов обработки выборки. Смоделированный набор данных PacBio представляет считывания, эквивалентные считываниям полной длины нехимерного пакета PacBio (FLNC).Это означает, что они предполагают, что внутренняя коррекция циклической согласованной последовательности (CCS) была выполнена, и что адаптеры и хвосты поли-A были удалены. Смоделированный набор данных Nanopore эквивалентен чтению Nanopore после удаления поли-A-хвоста и последовательностей адаптеров. Поскольку программное обеспечение PacBio Iso-Seq (Cupcake) требует определенных сгенерированных PacBio метаданных, которые не содержатся в этих смоделированных наборах данных, мы не могли протестировать программное обеспечение PacBio Cupcake на этих наборах данных. Это означает, что мы не могли использовать исправление ошибок перечитывания PacBio Cluster / Polish для этих наборов данных.Таким образом, эти смоделированные наборы данных можно использовать только для оценки влияния случайных ошибок при длительном чтении на производительность инструментов сопоставления и сборок транскриптомов.

Для решения проблем с смоделированными наборами данных мы также использовали чтение из набора данных Lexogen SIRV из набора данных PacBio UHRR Sequel II Iso-Seq. Контрольная смесь Lexogen SIRV содержит синтезированные молекулы РНК, представляющие 7 экспрессируемых локусов (18 генов с учетом цепи) с 69 уникальными транскриптами. Истина в этом наборе данных предоставлена ​​Lexogen в виде ожидаемых генных моделей, основанных на их синтетическом геноме.Однако возможно, что не все РНК из набора данных SIRV были секвенированы и / или в образце SIRV есть другие РНК, которые не представлены в файле аннотации, представленном на веб-сайте Lexogen. Это может объяснить более низкую точность всех неуправляемых трубопроводов для набора данных SIRV (точность <68% для всех неуправляемых заходов на посадку).

Мы использовали GffCompare [15] для расчета чувствительности и точности для каждого конвейера. Чувствительность определяется как количество правильных моделей транскрипции в прогнозируемой аннотации, деленное на все модели транскрипции, используемые для моделирования.Точность определяется как количество правильных моделей транскрипции в предсказанной аннотации, деленное на количество всех предсказанных моделей транскрипции. Эти оценки могут быть рассчитаны либо на уровне транскрипта, либо на уровне локусов гена. Эти определения взяты из программы GffCompare. Этот метод расчета идентичен методу, использованному в исследовании Stringtie2 [9]. Поскольку TAMA, Stringtie2 и TALON могут работать как с неуправляемым подходом, так и с использованием подхода, основанного на аннотациях, мы протестировали оба метода для каждого из этих инструментов.Поскольку TAMA предназначена для настройки параметров, мы применили два набора параметров для неуправляемых конвейеров TAMA, которые мы называем TAMA Low и TAMA High. TAMA Low использует параметры, чтобы максимизировать чувствительность генных локусов за счет точности модели транскрипции, в то время как TAMA High использует более строгие параметры для удаления ошибочных моделей транскриптов. Выбор параметров для TAMA High и TAMA Low отличается для синтетических наборов данных и данных PacBio Sequel II Iso-Seq (SIRV и UHRR), поскольку синтетические наборы данных имеют более высокий уровень ошибок.Выбор параметров TAMA High и TAMA Low более подробно описан в разделе «Методы». Вкратце, конвейер TAMA High использует более строгие настройки LDE (меньшее количество несоответствий, окружающих стыковые соединения) и требует поддержки чтения из обеих ячеек SMRT (в данных Iso-Seq PacBio Sequel II), в то время как TAMA Low имеет более низкие настройки строгости для LDE и требует поддержка только с одного чтения. Требование TAMA High для поддержки чтения из обеих ячеек SMRT можно рассматривать как модифицированную форму метода, который используется на этапе Cluster / Polish для фильтрации ошибочных моделей транскрипции (удаление всех операций чтения, которые не объединяются в кластеры).Однако подход TAMA High может обеспечить большую чувствительность, поскольку он допускает большую дисперсию на 5′-конце моделей транскриптов для учета низкоэкспрессированных генов, которые могут быть представлены только усеченной 5′-моделью в одной из клеток SMRT (где предсказанная 5 ‘полная модель была подобрана в другой ячейке SMRT). Этот метод фильтрации также может обеспечить более высокую точность, поскольку требование поддержки чтения во время выполнения секвенирования может помочь уменьшить артефакты, вызванные техническими эффектами пакетной обработки.Этот алгоритм можно настроить, если выполнялась только одна ячейка SMRT или прогон секвенирования, требуя только поддержки множественного чтения для каждой модели транскрипции. Это все равно обеспечит более высокую чувствительность, чем метод кластера / полировки, из-за большего допуска 5 ‘изменчивости. Управляемый конвейер TAMA сопоставляет модели транскриптов из длинных считываемых данных с аннотацией входной ссылки и принимает прогнозы стыковочных соединений из аннотации ссылки. Он отбрасывает любые модели, не соответствующие справочной аннотации, с использованием алгоритма слияния TAMA.См. Раздел «Методы» для описания слияния TAMA и выбора параметров конвейера.

Для наборов данных, смоделированных как PacBio, так и Nanopore, управляемые подходы достигли большей чувствительности и точности по сравнению с неуправляемыми подходами (рис. 2). Подход TAMA Guided имел наивысшую точность для всех наборов данных при немного меньшей чувствительности по сравнению с подходом Stringtie2 Guided для смоделированных наборов данных. В наборе данных SIRV метод TALON Guided показал немного более высокую оценку чувствительности по сравнению с TAMA Guided.Более высокий показатель чувствительности для TALON Guided был обусловлен включением еще одной модели транскрипции по сравнению с TAMA Guided. Когда мы проверили эту модель транскрипции, найденную только в сборке TALON Guided, мы обнаружили, что она не соответствует поддерживающим чтениям (рис. 2f). Считывания, используемые для поддержки предсказания TALON Guided этой конкретной модели транскрипции, имеют длинное 3′-расширение по сравнению с предсказанной моделью транскрипта. Это расширение присутствует в других моделях транскриптов в аннотации SIRV, и кажется, что эти чтения, вероятно, происходят из 5′-усеченной / деградированной РНК из этих транскриптов.Это поднимает вопрос, почему эти чтения были отнесены к модели транскрипции и как это может повлиять на неуправляемый TALON.

Бенчмаркинг сборки с длинной стенограммой. Чувствительность и точность управляемых и неуправляемых методов сборки длинных транскриптомов. — уровень локусов гена для имитированных считываний PacBio. b Уровень локусов генов для имитированных считываний нанопор. c Уровень транскрипции для моделирования чтения PacBio. d Уровень транскрипции для моделирования чтения нанопор. e Уровень транскрипции для PacBio Sequel II Iso-Seq SIRV читает. f Пример ошибочного предсказания транскрипции управляемым Talon, где вспомогательные чтения взяты из другой модели транскрипции. Эти поддерживающие считывания исходят от 5′-деградированной РНК, что приводит к путанице.

В целом следует ожидать лучшей производительности управляемых подходов, поскольку управляемые подходы по существу соответствуют моделям транскрипции для аннотации, которая имеет большое сходство с аннотацией оценки.Однако управляемые подходы не так полезны для открытия транскриптомов, поскольку они только подтверждают уже известные модели генов / транскриптов. Среди всех неуправляемых методов TAMA Low обеспечивает лучшую чувствительность на уровне локусов гена, в то время как TAMA High обеспечивает наивысшую точность и чувствительность на уровне транскриптов по сравнению с подходами без TAMA. Сравнение локусов генов SIRV не было включено, поскольку транскриптом SIRV состоит только из 18 локусов генов на 7 каркасах. Все методы имели идеальную чувствительность и точность на уровне локусов генов для набора данных SIRV.

Влияние исправления ошибок между считыванием на открытие модели гена

Мы обработали данные UHRR Iso-Seq, используя четыре различных конвейера, чтобы понять влияние исправления ошибок между считыванием перед картированием на открытие гена и точность предсказания модели (рис. 3а). Набор данных UHRR Iso-Seq состоял из двух отдельных прогонов Sequel II с использованием 8 M ячеек SMRT. Было 4 461 529 и 4 473 633 чтения CCS, сгенерированных двумя ячейками SMRT, что привело к 3 504 905 и 3 447 471 чтению FLNC, соответственно.График длин чтения FLNC можно найти в дополнительных файлах (Рисунок S1). Все четыре конвейера используют инструменты TAMA, поскольку конвейер TAMA High имеет наивысшее сочетание чувствительности и точности по сравнению со всеми другими неуправляемыми методами в тестовых тестах, а конвейер TAMA Low имеет самую высокую чувствительность. Мы сравнили два конвейера без исправления ошибок между считыванием (конвейеры TAMA Low и TAMA High), один конвейер, использующий исправление ошибок между считыванием при длительном считывании (Polish Pipeline), и один конвейер, использующий гибридное исправление ошибок между считыванием (Lordec Pipeline).Польский конвейер использует исправление ошибок между считыванием (в форме кластеризации длинных считываний и использования выравнивания для полировки последовательностей перед отображением) вместе с TAMA Collapse с использованием тех же параметров, что и конвейер TAMA Low. Конвейер Lordec использует коррекцию ошибок между чтениями LoRDEC [16] (выравнивание данных короткого чтения RNA-seq с длинными чтениями до сопоставления) с TAMA Collapse (те же настройки, что и TAMA Low). Для конвейера Lordec мы использовали данные короткого чтения RNA-seq из UHRR, но из другого исследования [17].

Сравнение различных конвейеров в наборе данных UHRR Iso-Seq. a Схема рабочего процесса для четырех конвейеров, используемых для анализа набора данных UHRR Iso-Seq. b Пример польского конвейера, в котором отсутствует полная модель транскрипции из-за низкого покрытия чтения для 5 ‘полного чтения. Поскольку Cluster / Polish отфильтровывает любые чтения, которые не объединяются хотя бы с одним другим чтением, поддержка одного чтения для более длинной модели была отфильтрована в польском конвейере, но захвачена TAMA.В этом случае усеченная модель на польском языке совпадает с моделью транскрипта в аннотации Ensembl

Пайплайны TAMA Low и Lordec дали наиболее предсказуемые модели генов и транскриптов с более чем 160 K генами и 750 K транскриптами (Таблица 1). Эти чрезвычайно высокие числа, вероятно, связаны с проблемами, связанными с использованием операций чтения с высоким коэффициентом ошибок, а также операций чтения, вызванных шумом транскрипции. Польский конвейер произвел наименьшее количество генов и моделей транскриптов (Таблица 1), тогда как конвейер TAMA High — более 1.В 5 раз больше предсказанных генов, но с таким же количеством предсказанных транскриптов.

Оценка точности обнаружения модели гена

Хотя достоверной информации о человеческом транскриптоме нет, мы использовали справочную аннотацию генома человека Ensembl v94 (выпуск 94, октябрь 2018 г.) [18] в качестве справочного материала для понимания как наши результаты сравниваются с текущими аннотациями. Мы определили количество локусов генов и моделей транскриптов из аннотации Ensembl с представлением из каждого конвейера.У конвейеров TAMA Low и Lordec было наибольшее количество совпадений как для локусов генов, так и для моделей транскриптов, что указывает на высокую чувствительность. Однако, учитывая большое общее количество генов и транскриптов, аннотации этих конвейеров, вероятно, содержат много ошибочных моделей генов и транскриптов. В конвейере TAMA High было больше совпадений локусов генов, но немного меньше совпадений транскриптов по сравнению с польским конвейером. Это означает, что в аннотации к польскому конвейеру (4.9: 1) по сравнению с аннотацией TAMA High (3,5: 1). Более высокое соотношение транскриптов к генам в польском конвейере по сравнению с конвейером TAMA High предполагает, что либо TAMA High отфильтровывает множество реальных альтернативных транскриптов, либо Cluster / Polish каким-то образом предсказывает более ошибочные альтернативные модели транскриптов.

Когда мы исследовали причину большего количества совпадений моделей транскрипции в польской аннотации, мы обнаружили, что в некоторых случаях польские модели транскриптов совпадали с моделями в аннотации Ensembl из-за удаления чтений (с помощью этапа кластера / польского языка) которые поддерживали 5′-длинные модели транскриптов (рис.3б). В этих случаях картированные чтения показали модели 5′-расширенного транскрипта с дополнительными 5′-экзонами вместе с 5′-более короткими моделями, которые могли происходить из 5′-деградированных молекул РНК. Однако, поскольку более длинные модели имели меньшее покрытие для чтения, польский конвейер удалил их из сборки транскриптома, оставив только более короткие модели, которые иногда совпадали с моделями в аннотации Ensembl. Эта тенденция к созданию усеченных моделей транскрипции может объяснить расширение альтернативных предсказаний транскрипции в польском конвейере.Хотя можно утверждать, что эти более короткие модели реальны, поскольку они представлены в аннотации Ensembl, также возможно, что эти РНК обычно быстро деградируют, и поэтому полноразмерные представления не были идентифицированы в аннотации Ensembl из-за недостаточного охвата. из вспомогательных данных, используемых конвейерами Ensembl.

Оценка деградации РНК по данным Iso-Seq

Чтобы лучше понять влияние, которое деградация РНК может иметь на аннотации, основанные на длинном чтении, мы проанализировали модели транскриптов, которые имели соответствующую структуру 3′-экзон-интрон между TAMA High ( 135 218 транскриптов), польских (126 288 транскриптов) и Ensembl v94 (206 601 транскриптов), чтобы увидеть, какая аннотация имеет более длинное 5′-представление (таблица 2).При сравнении аннотации TAMA High с аннотацией на польском языке было обнаружено 67 480 моделей транскриптов с соответствующей 3′-экзон-интронной структурой. Из этих 3′-совпадающих моделей транскриптов 56 198 (83,2%) показали, что модели TAMA High имеют более длинное 5′-представление с 3357 моделями (5%), имеющими дополнительные 5′-экзоны. Это указывает на то, что польский трубопровод может производить большое количество моделей неполной расшифровки 5 ‘. В то время как аннотации TAMA High и Polish имели одинаковое количество моделей транскрипции, примерно половина этих моделей в каждой аннотации не имела совпадений между аннотациями.Это может быть связано с различиями в вызовах стыковочных соединений между двумя конвейерами, которые в этом тексте называются колебаниями стыковочных узлов.

Когда мы сравнили аннотацию TAMA High с аннотацией Ensembl с использованием того же метода, мы обнаружили 23 542 модели транскриптов, совпадающих с 3′-экзон-интронной структурой. Из этих совпадающих моделей 15230 (64,7%) показали, что модели TAMA High имеют более длинное 5′-представление, а 3521 модель (15%) имеет дополнительные 5′-экзоны.Сравнивая аннотацию польского конвейера с аннотацией Ensembl с использованием того же метода, мы обнаружили 26 186 моделей транскрипта соответствия 3′-экзон-интронной структуры. Из этих подходящих моделей 15496 (59,2%) показали, что польские модели имеют более длинное 5′-представление. Это может указывать на то, что более трех тысяч моделей транскриптов Ensembl имеют неполные 5′-концы с отсутствующими 5′-экзонами или что, по крайней мере, они представляют новые альтернативные транскрипты для этих генов. Несмотря на то, что примерно половина моделей расшифровки (67 480) из конвейеров TAMA High и Polish имели совпадения между двумя конвейерами, менее половины (23 542 для TAMA High и 26 186 для польского) этих моделей расшифровки также соответствовали аннотации Ensembl.Это предполагает, что модели, совпадающие между конвейерами TAMA High и Polish, но не найденные в аннотации Ensembl, могут представлять новые альтернативные модели транскрипции. В качестве альтернативы они могут указывать на тип системной ошибки в конвейерах прогнозирования модели транскрипции.

Затем мы сравнили пересечение между всеми тремя аннотациями и идентифицировали 19 413 транскриптов с общими 3′-областями. Из этих расшифровок стенограммы TAMA High были самыми длинными в 65,3% матчей, Ensembl — в 22.4%, польский — 12,3% (рис. 4а). Хотя в аннотации польского трубопровода было больше 3 ‘совпадающих моделей транскриптов с аннотацией Ensembl при двухстороннем сравнении, количество 5′ более длинных транскриптов было аналогично аннотации TAMA High, предполагая, что увеличение совпадений произошло из польских моделей трубопроводов, которые были короче. на 5’-конце по сравнению с соответствующими моделями транскриптов Ensembl. Хотя 5-дюймовые более короткие модели расшифровки из польского конвейера могут быть точными, эти результаты демонстрируют, что использование сопоставления расшифрованных моделей для оценки производительности конвейера (как используется в GffCompare) может зависеть от ложных срабатываний от 5-дюймовых неполных моделей, где эти модели совпадают с аннотацией ссылки.Таким образом, мы предлагаем углубленную оценку моделей транскрипции для более точного понимания производительности конвейера.

Анализ сигнатуры деградации. — круговая диаграмма пересечения 3 ‘уровня транскрипции между аннотациями TAMA High, Ensembl и Polish с секциями, представляющими количество 5’ расширенных моделей транскрипции из каждой аннотации. b Диаграмма представления деградированной РНК по отношению к сборке генома. Уменьшение 5 ‘покрытия приводит к 5’ изменчивости отображаемых считываний. c Сигнатура деградации по хромосомам в каждом прогоне клетки SMRT

Метод оценки деградации РНК по данным Iso-Seq

Для измерения относительного количества чтений, происходящих от 5′-деградированной РНК, мы разработали метрику, называемую «Сигнатура деградации» (DegSig), который оценивает степень вариабельности 5′-экзона в моделях транскриптов (рис. 4b). Метрика DegSig рассчитывается с использованием выходных данных прогонов TAMA Collapse и ввода их в инструмент TAMA Degradation Signature.Значение DegSig дано в процентах, которое представляет собой долю считываний, полученных из 5′-деградированной РНК (см. Методы для формулы). Важно отметить, что DegSig обеспечивает только оценку 5′-деградации с оговоркой, что истинные альтернативные стартовые сайты транскрипции и неполный синтез первой цепи при получении библиотеки кДНК также могут вызывать вариабельность 5′-экзона, которая может имитировать 5′-деградацию. . Чтобы проверить нашу метрику DegSig, мы применили ее к двум наборам данных Iso-Seq из РНК мозга курицы.Один набор данных был получен из РНК, выбранной по 5′-кэпу TeloPrime [19], а другой был получен без отбора по 5′-кэпу. Библиотека TeloPrime должна содержать меньший процент деградированных последовательностей транскриптов, поскольку она выбирает полные кэпированные РНК. Отобранные данные без кэпа имели DegSig 56,3%, в то время как DegSig для данных библиотеки TeloPrime составляло 23,6%, что свидетельствует о большой разнице в доле деградированных последовательностей РНК, захваченных в виде кДНК двумя разными методами. Однако ни у одного вида нет достоверной информации о фактическом количестве 5′-более коротких моделей с той же 3′-экзон-интронной структурой, что и у более длинных моделей, поэтому DegSig является лишь приблизительной оценкой доли моделей, которые могут быть из деградированной РНК .

Мы запускали DegSig в наборе данных UHRR Iso-Seq индивидуально по SMRT-ячейке и хромосоме. Почти все хромосомы имели DegSig от 32 до 41% (рис. 4c). Однако Y-хромосома имела DegSig 26,7 и 27,2% для SMRT Cell 1 и 2 соответственно. Одно из объяснений гораздо более низкого DegSig на Y-хромосоме может быть связано с недостаточной глубиной считывания для Y-хромосомы (только 629 и 588 считываний из SMRT-клеток 1 и 2, соответственно). Более низкая глубина считывания может снизить значения DegSig из-за отсутствия покрытия для каждого гена.Диапазон DegSig для данных о человеке выше, чем для данных по выбранной 5′-крышке РНК цыпленка, что позволяет предположить, что может иметь место значительное количество считываний с деградированной РНК и, таким образом, сниженное представление полноразмерных транскриптов.

Сравнение точности идентификации сращивания стыков

Чтобы понять точность каждого конвейера для прогнозирования сращивания стыков, мы рассмотрели как частоту несоответствия отображения, так и колебание стыка сращивания. Колебание относится к неправильному картированию сплайсинговых стыков, вызывающему небольшие различия в геномных локусах картированных функций, таких как границы экзонов и донорные / акцепторные сайты сплайсинговых стыков (рис.1c) (более подробное объяснение колебания см. В разделе «Методы»). Хотя процент несоответствия отображенных чтений часто используется для оценки улучшения данных длительного чтения из различных конвейеров исправления ошибок [20], этот показатель на самом деле не так полезен для понимания общего улучшения аннотации транскриптома. В аннотациях транскриптомов на основе генома обычно наиболее важными признаками для идентификации являются сайты начала транскрипции (TSS), сайты конца транскрипции (TES), сплайсинговые соединения и сцепление экзонов.Эти особенности позволяют предсказывать кодирующие и промоторные области, которые часто имеют решающее значение для последующего анализа. Таким образом, для идентификации структуры транскрипта ошибки вблизи стыков сращивания имеют большую вероятность изменения результирующей модели транскрипта, чем ошибки, возникающие дальше от стыковочных стыков. Это означает, что процент ошибок при чтении может быть не таким значительным, как их распределение. Таким образом, еще одним показателем эффективности методов исправления ошибок является оценка величины колебания стыка сплайсинга между предсказанными транскриптами и известными транскриптами.

Чтобы продемонстрировать эту концепцию, мы рассмотрели профили несоответствия сопоставления для каждого сопоставленного чтения для конвейеров исправления ошибок между считыванием (Polish и Lordec) и конвейеров, использующих сопоставленные чтения FLNC (TAMA High и TAMA Low). Обратите внимание, что отображенные чтения FLNC одинаковы для конвейеров TAMA High и TAMA Low.

Используя выходные данные TAMA Collapse, мы рассмотрели длину отображаемого покрытия чтения, идентичность отображения, отсечение, вставки, удаления и ошибки подстановки. Эти значения представляют собой сравнение сопоставленных считываний со сборкой генома и, таким образом, служат только в качестве оценки истинного уровня ошибок, поскольку разница между считываниями и эталонной сборкой генома может быть вызвана реальным полиморфизмом.Мы рассчитали среднюю частоту несоответствия, подсчитав количество пар оснований, которые не совпадали между отображенным считыванием и последовательностью генома, и разделив это число на длину отображенного считывания. Оцениваемые несоответствия включают несоответствия мягкого отсечения, вставки, удаления и замены, но не включают жесткое отсечение.

Отображенные чтения FLNC (используемые в конвейерах TAMA High / Low) имели наивысший средний прогнозируемый уровень несоответствия (2,83%) и наибольшее количество каждого типа несоответствия, в то время как чтения кластера / польского имели самые низкие коэффициенты несоответствия (0.52%) с наименьшим количеством несовпадений каждого типа. Считывания с исправленными ошибками LoRDEC (средняя частота несоответствия 1,38%) имели такое же количество несоответствий отсечения, как и сопоставленные чтения FLNC (рис. 5a). Это указывает на то, что исправление LoRDEC может иметь некоторые проблемы с исправлением концов чтения, которые могут быть связаны с меньшим покрытием короткого чтения на концах стенограмм.

Оценка частоты ошибок и колебания трубопроводов. a Средний процент несоответствия выравнивания по типу несоответствия по трубопроводам. b Среднее колебание стыковочного соединения по всем моделям транскрипции, которые совпадают с аннотацией Ensembl во всех четырех конвейерах. Пороговое значение колебания стыка сращивания 30 п.н. на каждой стороне стыка было разрешено для сопоставления для этих графиков. Обратите внимание, что колебание более 30 п.н. возможно из-за ходьбы с колебательным движением. c Диаграммы разброса, чтобы проиллюстрировать величину колебания во всех трубопроводах, оцененных на моделях транскрипции, используемых в графике среднего колебания стыка стыков

Затем мы рассмотрели точность модели расшифровки путем измерения колебаний на стыках стыков к моделям расшифровки, аннотированным в Ансамбль человеческих аннотаций для четырех разных трубопроводов (рис.5б-в). Колебание обычно возникает из-за большого количества ошибок чтения, непосредственно фланкирующих сплайсинговые соединения, что приводит к небольшим сдвигам в картировании концов каждого экзона [21]. Общее колебание для стыка в сгруппированных считываниях может быть больше указанного порога колебания из-за явления, которое мы называем ходьбой с колебаниями. Колебание происходит, когда предсказанные начала / концы экзонов представлены в шахматном порядке, так что разница между каждой ближайшей парой все еще находится в пределах порога колебания, но разница между самой далекой парой больше порога (рис.1в). Величина колебания между моделями транскрипции каждого конвейера по сравнению с эталонной аннотацией обеспечивает показатель точности моделей транскрипции, создаваемых каждым конвейером. Например, ожидается, что если модель транскрипции из аннотации, основанной на длинном чтении, содержит идентичные стыковые соединения (нулевое колебание стыковочного соединения) по сравнению с эталонной аннотацией, то модель транскрипции, основанная на длинном чтении, имеет правильные предсказанные стыковые соединения. Мы проигнорировали колебание в стартовых и конечных сайтах транскрипта из-за высокой вариабельности этих свойств в естественной РНК [22, 23].Мы также оценивали только модели транскриптов Ensembl, которые охватывали все оцениваемые конвейеры, чтобы учесть различия в чувствительности между конвейерами.

Трубопровод TAMA High со строгой фильтрацией LDE имел самые низкие средние значения колебания на стык, в то время как трубопровод TAMA Low давал самое высокое среднее колебание (рис. 5b-c). Таким образом, несмотря на более низкую общую частоту ошибок в отображенных чтениях из польского конвейера, конвейер TAMA High имел больше стыков, соответствующих аннотации Ensembl.Это говорит о том, что LDE-фильтрация в трубопроводе TAMA High привела к более точной идентификации стыковых соединений.

Ошибочная кластеризация с исправлением ошибок между считыванием может приводить к ошибочным моделям генов

Одной из основных проблем при использовании методов исправления ошибок между считыванием, таких как Cluster / Polish и LoRDEC, является возможность объединения последовательностей считывания из разных транскриптов, что может привести к в ошибочных моделях расшифровки. Различные транскрипты могут происходить из разных генов (путаница на уровне генов) или из комбинации альтернативных транскриптов в пределах одного и того же гена (мешанина на уровне транскриптов).Путаница на уровне генов обычно возникает из-за сходства последовательностей паралогов внутри семейств генов [23]. Как на уровне генов, так и на уровне транскриптов, более вероятно, что наиболее экспрессируемый ген или транскрипт в кластерах считывания будет маскировать менее экспрессированные гены. Это связано с тем, что конечная последовательность кластера определяется охватом последовательности. Однако в случаях, когда охват чтения в кластере беспорядка одинаков для уникальных транскриптов, более вероятно, что результирующее чтение кластера будет иметь смесь последовательностей из каждого уникального транскрипта в кластере.

Чтобы выяснить, как часто возникают эти беспорядочные события, мы сравнили сопоставления чтения из сопоставленных считываний FLNC (TAMA Low) с считываниями с исправленными ошибками чтения (Polish и Lordec), чтобы найти чтения, которые сопоставлены с разными генами и транскриптами в каждом из них. сравнение. Хотя возможно, что сопоставления чтения FLNC ошибочны, они представляют последовательности чтения без какой-либо чрезмерной коррекции. Также считывание этой карты в разные локусы после исправления ошибок между считыванием указывает на то, что существует достаточно неоднозначности последовательности, чтобы поставить под сомнение эффект исправления ошибок между считыванием.

Сравнивая картированные чтения FLNC с картированными чтениями кластера / поляка, мы обнаружили 34 637 прочтений (0,6% картированных чтений), которые переключились с одного локуса гена на другой после кластерной / польской коррекции (рис. 6a). В этом переключении локусов гена участвовало 6774 гена, 3230 из которых были обнаружены только с конвейером TAMA Low, а 104 гена были обнаружены только с польским конвейером. Асимметрия количества уникальных генов между конвейерами предполагает, что Cluster / Polish может уменьшить обнаружение генов путем комбинирования считываний генов с низкой экспрессией с генами с высокой экспрессией.

Обмен считывания генов и транскриптов при исправлении ошибок. — график Circos, показывающий сопоставление считываний с разными локусами после использования Cluster / Polish для долгого исправления ошибок между считыванием. Каждая линия представляет одно считывание, а ширина каждой ячейки хромосомы представляет количество считываний (общая толщина каждой линии). Концы строки с отступом показывают местоположение чтения FLNC, а концы без отступа показывают распределение чтения после исправления ошибок между считыванием. Этот график показывает 34 637 чтений из 4799 генов, перемещающихся в 2793 гена после кластера / полировки.Считывания организованы по хромосомам, однако обмен происходит внутри хромосомы и между хромосомами. b Схема Circos, как указано выше, но после гибридной коррекции между считыванием с помощью LoRDEC. Каждая линия представляет собой одно считывание, перемещающееся от одного гена к другому, при этом 19 064 считывания из 2292 генов перемещаются в 2319 генов после исправления ошибок LoRDEC. c Ген PRAMEF8 покрывается 9 картированными считываниями FLNC (TAMA Low). Пять из этих чтений были сгруппированы и объединены с другими чтениями в один кластер, прочитанный Cluster / Polish, в результате чего получилось беспорядочное сопоставление чтения кластера с геном PRAMEF15 (польский конвейер).Это предполагает ложноотрицательный результат для PRAMEF8 и ложноположительный результат для PRAMEF15 в польском конвейере из-за использования Cluster / Polish

. Чтобы оценить влияние гибридной коррекции ошибок между считыванием на перемешивание чтения на уровне гена, мы сравнили сопоставленные чтения FLNC с отображенные исправленные чтения LoRDEC. Было 19 064 чтения (0,3% картированных считываний), которые переключались с одного генного локуса на другой (рис. 6b), с участием в общей сложности 3476 генов, 775 из которых были обнаружены только с конвейером TAMA Low, в то время как 675 генов были обнаружены только с трубопровод Lordec.

Чтобы получить более подробное представление о том, что происходит во время события чтения беспорядочно, мы исследовали предварительно экспрессируемый антиген семейства генов MElanoma (PRAME). Семейство генов PRAME тесно связано с развитием рака [24] и используется в качестве биомаркера для идентификации различных форм рака. В семействе генов PRAME 24 аннотированных паралога [25]. В этом примере польский конвейер не может обнаружить один из паралогов PRAME (PRAMEF8), ошибочно прогнозируя выражение другого паралога (PRAMEF15), у которого нет поддержки чтения с отображением FLNC.Конвейер TAMA Low (использующий сопоставленные чтения FLNC) обнаруживает, что 9 операций чтения отображаются в PRAMEF8 (рис. 6c), в то время как польский конвейер (с использованием сопоставленных считываний кластера / поляка) не показывает сопоставления считываний с PRAMEF8. Из 9 чтений PRAMEF8 из конвейера TAMA Low, 5 из этих чтений были кластеризованы и объединены с другими чтениями (3 из PRAMEF11, 4 из PRAMEF4, 2 из PRAMEF7 и 3 из PRAMEF27 в соответствии с сопоставлением FLNC) в 1 кластер, прочитанный кластером / Польский, в результате чего получено беспорядочное сопоставление чтения кластера с геном PRAMEF15 (польский конвейер).Мы проанализировали сходство последовательностей между двумя паралогами путем выравнивания последовательностей транскриптов PRAMEF8 и PRAMEF15 с Muscle [26] и обнаружили, что они имеют 76% идентичности. Хотя эти два гена имеют сходные экзонные последовательности, идентичность картирования генома для считываний была выше, чем сходство последовательностей между двумя паралогами. Считывание FLNC PRAMEF8 с самым низким показателем идентичности картирования генома имело идентичность картирования 89%, а 6 считываний FLNC PRAMEF8 имели идентичность картирования более 98%. Таким образом, есть веские доказательства того, что чтения правильно отображены в конвейере TAMA Low и были изменены до точки неправильного отображения в польском конвейере.Этот конкретный тип ошибки может иметь серьезные последствия для исследований, направленных на определение экспрессии генных биомаркеров.

Мы также исследовали, как ошибочное исправление ошибок между считыванием может привести к путанице на уровне расшифровки. В этом случае, когда считывания из разных транскриптов одного и того же гена сгруппированы для исправления ошибок, результирующая последовательность в лучшем случае будет представлять только транскрипт с более высокой степенью экспрессии и, в худшем случае, представляет собой ошибочно перемешанную последовательность. Сравнивая конвейер TAMA Low с польским конвейером, мы обнаружили 477 351 считывание, отображаемое в разных моделях транскриптов в одном и том же гене.Было обнаружено 112 891 транскрипт, затронутый путаницей на уровне транскриптов, 44 852 из которых были обнаружены только в аннотации TAMA Low, а 1372 транскрипта были найдены только в аннотации на польском языке. Сравнивая конвейер TAMA Low с конвейером Lordec, мы обнаружили 187 829 операций чтения, сопоставленных с различными моделями расшифровки. Это включало 142704 транскрипта, из которых 7117 транскриптов были обнаружены только в аннотации TAMA Low, и 11732 транскрипта были найдены только в аннотации Lordec. Важно отметить, что эта оценка расшифровки стенограмм является лишь приблизительным признаком, поскольку без достоверной информации о реальных стенограммах невозможно узнать, какая модель стенограммы является точной.

Подводя итог, можно сказать, что как в длинных, так и в коротких конвейерах исправления ошибок между считыванием мы увидели значительное количество несовпадений при чтении на уровне генов и транскриптов, что может привести к биологически неточным предсказаниям моделей генов и транскриптов. Следовательно, чтобы избежать проблем при чтении, мы предлагаем отказаться от исправления ошибок между чтениями и вместо этого сосредоточиться на методах, таких как алгоритм TAMA Collapse LDE, для удаления чтений с профилями ошибок, которые могут привести к ошибочным предсказаниям модели транскрипции.

Анализ предсказанных экспрессированных локусов, не найденных в аннотации Ensembl для человека

Учитывая, что конвейер TAMA High имел самые высокие показатели чувствительности и точности для неуправляемой аннотации в наборах данных сравнительного анализа, мы использовали локусы генов, предсказанные конвейером TAMA High для исследования потенциально новых генов в наборе данных UHRR. Чтобы получить представление о 23302 прогнозируемых генных моделях TAMA High, не обнаруженных в Ensembl (модели специфичных генов TAMA High), мы рассмотрели несколько функций, которые обеспечивают поддержку реальных генных моделей или опровергают их: потенциал кодирования, количество экзонов, перекрытие интронов с другими генами. , перекрываются с регуляторными особенностями и присутствием непосредственно расположенных ниже геномных участков поли-А.Комбинация кодирующего потенциала и сплайсинговых соединений часто используется в качестве доказательства функционального гена. И наоборот, перекрытие с интронами (от других генов), геномный поли-А простирается непосредственно после генной модели, и отсутствие сплайсинговых соединений (одиночных экзонных транскриптов) свидетельствует о том, что источником модели может быть любой нефункциональный транскрибируемый продукты или геномное заражение.

Кодирующий потенциал оценивался с использованием трех дополнительных методов. Во-первых, мы использовали инструмент анализа последовательности открытой рамки считывания, CPAT [27], чтобы определить потенциал кодирования.Этот метод работает только в том случае, если модели транскриптов не содержат сдвигов кадра, вызванных ошибочным вызовом соединения сращивания. Во-вторых, мы использовали слияние TAMA для идентификации моделей генов, которые перекрывают геномные локусы (на одной цепи) генов, кодирующих белок, в аннотации Ensembl. В-третьих, мы использовали конвейер TAMA ORF / NMD, который представляет собой устойчивый к сдвигу рамки метод сопоставления последовательностей транскриптов с пептидными последовательностями из базы данных UniProt [28]. Мы объединили эти три метода, чтобы учесть различные ошибки, которые могут вызывать ложноотрицательные результаты при прогнозировании генов, кодирующих белок.

Лишь небольшое количество генных моделей, предсказанных TAMA High, которые не были найдены в аннотации Ensembl v94 (18 из 23 302), поддерживались всеми функциями, которые считаются свидетельством функциональности (мультиэкзонная, кодирующая, межгенная и обработанная). поли-А) (рис.7). Это ожидается, учитывая, что эти функции используются конвейерами короткого чтения аннотаций RNA-seq для проверки. Следовательно, многие модели генов с этими особенностями, вероятно, уже были идентифицированы в аннотации Ensembl.

Предполагаемый распад новых генов. Разбивка нового гена по признакам. Комбинации признаков подтверждают, что каждый ген либо реален и принадлежит к определенному биотипу, либо не является реальным, и является результатом ошибочных прогнозов модели. Фракция с наибольшим набором функций указывает на ненастоящие модели. Однако все еще существуют тысячи локусов с наборами признаков, которые совместимы с реальными генами.

Было 1059 моделей высокоспецифичных генов TAMA, которые были межгенными, единственными экзонными и имели геномный поли-А.Эти особенности обычно приписывают загрязнению геномной ДНК. Однако точный механизм того, как эти последовательности попадают в конечную библиотеку секвенирования, недостаточно хорошо изучен.

Двумя наиболее распространенными наборами характеристик для моделей специфичных генов TAMA High являются «один экзонный, некодирующий, перекрытие интронных генов и геномный поли-А» при 24% (5679) и «единственный экзонный, кодирующий, интронный ген. перекрываются, а геномный поли-А »составляет 19% (4440). Эти наборы функций обычно используются в качестве индикаторов для нереальных моделей, поскольку они могут быть получены из внутреннего прайминга необработанной РНК.Однако это потребует дальнейшего усечения матрицы, чтобы полученная модель не перекрывалась с транскриптами из гена происхождения. Теоретически подмножество локусов с первым набором признаков может состоять из днРНК, тогда как подмножество локусов со вторым набором признаков может состоять из обработанных псевдогенов. Вместе они составляют более 43% моделей специфичных генов TAMA High.

Было предсказано 2566 генных моделей (11% высокоспецифичных генных моделей ТАМА), которые не кодируют процессированные хвосты поли-А.Из них 461 были мультиэкзонными, а 2105 — одиночными экзонными генами (рис. 7). Учитывая, что эти модели не перекрывают какие-либо экзонные области моделей генов в аннотации Ensembl, это будет представлять собой значительное увеличение количества предсказанных днРНК для генома человека.

Всего было 1557 (7%) высокоспецифичных генных моделей TAMA с характеристиками (мультиэкзонными, кодирующими, перекрывающимися интронами и процессированным поли-A), которые указывают на настоящие гены, кодирующие белок, которые существуют в интронах более крупных генов.Однако возможно, что это альтернативные транскрипты из окружающих генов, но из-за недостаточной 5′-полноты перекрывающиеся 5′-экзоны не были представлены в моделях транскриптов. Если эти генные модели получены из альтернативных транскриптов окружающих их генов, эти модели будут представлять новые транскрипты.

Эти анализы были основаны на человеческой аннотации Ensembl v94, с тех пор была выпущена аннотация Ensembl v100. Эта новая версия Ensembl содержит более тысячи новых моделей генов днРНК по сравнению с v94.Мы сравнили аннотацию TAMA High с v100 и обнаружили 144 совпадающих гена lncRNA, которые не присутствовали в v94. Это вызывает вопросы относительно того, что именно присутствует в наших данных секвенирования и каков наилучший способ дальнейшего анализа этой информации для получения биологически значимых результатов.

Поскольку UHRR является одним из наиболее тщательно подготовленных образцов РНК, это может указывать на то, что исследователям потребуются более совершенные методы либо подготовки РНК, либо анализа секвенирования для уверенной идентификации новых генов.

Утилита PacBio Iso-Seq для обнаружения транскриптов и генов в латексе гевеи

MicrobioSeq представляет микробную Iso-Seq для характеристики разнообразного ландшафта изоформ транскриптов

MicrobioSeq представляет подразделение микробной геномики компании CD Genomics со штаб-квартирой в Нью-Йорке, США.CD Genomics — это компания, предоставляющая услуги в области геномики, с хорошей репутацией в предоставлении надежных услуг по секвенированию de novo, генотипированию, микрочипам и биоинформатике. Обладая многолетним опытом работы в фармацевтическом и медико-биологическом секторах, CD Genomics недавно анонсировала микробную iso-seq, чтобы предложить комплексные решения для секвенирования полноразмерных транскриптов.

Секвенирование микробных изотипов (Iso-Seq) — идеальный метод для анализа микробных транскриптомов и событий слияния генов, а также характеристики изотипов генов и альтернативных событий сплайсинга.Служба микробной iso-seq компании CD Genomics может обеспечить чтение полной длины без сборки, используя технологию одиночной молекулы PacBio и технологию реального времени (SMRT) для расширения всего подтипа транскрипции от polyA-хвоста до 5-конца.

«Наши грибковые iso-seq или бактериальные iso-seq могут предоставить полное решение для секвенирования полноразмерных транскриптов. Это мощная технология, сочетающая платформы секвенирования Illumina и PacBio SMRT для выявления высоких и низких экспрессоров в одной бактериальной или микробной популяции.Секвенирование PacBio SMRT позволяет секвенировать непрерывные полноразмерные транскрипты и фиксировать начало, сайт сплайсинга и полиаденилирование каждого транскрипта за одно считывание. Короткие чтения Illumina будут в дальнейшем сопоставляться с полноразмерной расшифровкой стенограммы PacBio SMRT для более точного количественного анализа и исправления ошибок ». сказал главный научный сотрудник CD Genomics.

Каковы преимущества услуги Microbial Iso-Seq, предоставляемой CD Genomics?

1. Эффективный стандартный рабочий процесс, быстрое выполнение работ и комплексный биоинформатический анализ с минимальными затратами.
2. Обеспечьте всесторонний анализ данных с использованием широко распространенного основного программного обеспечения и зрелых внутренних конвейеров для обнаружения новых транскриптов, функциональных аннотаций и дифференциальных выражений.
3. Мощные возможности секвенирования и эффективные методы: передовые платформы секвенирования PacBio и Illumina.
4. Не отставайте от передовых рубежей биоинформатического анализа, эволюционной геномики и молекулярной эпидемиологии.

Изосекция микробов становится все более важной в фундаментальных исследованиях.Он точно описывает разнообразие транскрипционных изоформ и дополнительно предоставляет ключевую информацию о функциональной биологии генома для разработки потенциальных применений этих многочисленных микроорганизмов в болезнях, медицине, сельском хозяйстве и окружающей среде. Например, прогнозирование устойчивости к определенным антибиотикам, количественная оценка изменений в экспрессии генов, понимание иммунного взаимодействия между хозяином и патогенами и отслеживание прогрессирования заболевания.

О MicrobioSeq Подразделение CD Genomics

MicrobioSeq — это подразделение микробной геномики компании CD Genomics, которая является сервисной компанией в области геномики с хорошей репутацией в области предоставления надежных продуктов для отбора проб, услуг по тестированию микробов, услуг по микробной геномике и т. Д. комплексные услуги биоинформатики.

GitHub — PacificBiosciences / IsoSeq: IsoSeq3 — масштабируемое обнаружение изоформ De Novo из одномолекулярного пакета PacBio читает

Масштабируемая изоформа De Novo Discovery

IsoSeq v3 содержит новейшие инструменты для идентификации транскриптов в Данные секвенирования одной молекулы PacBio. Начиная с SMRT Link v6.0.0, эти инструменты обеспечивают работу Анализ на основе графического интерфейса пользователя IsoSeq приложение. Составной рабочий процесс из существующих инструментов и алгоритмов в сочетании с новый метод кластеризации, позволяющий обрабатывать постоянно растущий урожай PacBio машины с производительностью, аналогичной IsoSeq версий 1 и 2.Начиная с версии 3.4, поддержка UMI и дедупликации на основе штрих-кода ячейки. был добавлен.

Наличие

Последнюю версию можно установить с помощью пакета bioconda isoseq3 .

Пожалуйста, посетите нашу официальную страницу pbbioconda для получения информации об установке, поддержке, лицензии, авторских правах и отказе от ответственности.

Документация рабочего процесса

История изменений

• 3.4.0
  • Версия SMRT Link 10.0.0
  • Добавьте поддержку UMI и обработки штрих-кода ячейки, добавив тег и dedup
  • Добавьте Уточнить --min-rq для поддержки фильтрации RQ для нефильтрованного <фильм>.reads.bam ввод
• 3.3.0
• 3.2.2
  • Fix polish не генерирует вывод fasta / q. Эта ошибка появилась в версии 3.2.0
  .
• 3.2.1
  • Исправить одноразовую ошибку индекса gff в коллапсе
  • Мы удалили неявные зависимости из рецепта биоконды. При необходимости установите pbccs , lima и pbcoretools .
• 3.2.0
  • polish больше не поддерживает наборы данных RS II!
  • Добавить свернуть шаг для выровненной расшифровки ввода BAM
  • Включить рабочий процесс только для CCS cluster --use-qvs
  • Добавить Уточнить --min-polya-length
  • Добавить cluster --singletons для вывода некластеризованных FLNC; возможные артефакты при подготовке образцов!
  • Исправить ошибки Minimap2.Выходы могут немного измениться.
• 3.1.2
  • Уменьшить отполировать объем памяти
• 3.1.1
  • Фиксация края корпуса, где полироль не закончился и не просох
  • Улучшение отполировать время выполнения для крупномасштабных наборов данных (> 1 млн CCS)
  • Улучшить полироль качество результата
• 3.1.0
  • Мы передали на аутсорсинг удаление хвостов поли (A) и обнаружение конкатемеров в новый инструмент. позвонил доработать .Ваши индивидуальные праймеры .fasta используется на этом этапе для обнаружения конкатемеры.

FAQ

Где рабочий процесс начинается с неполированных чтений CCS?

Чтобы упростить, унифицировать и обеспечить соответствие требованиям будущего Iso-Seq, мы решили удалить документацию. начиная с неотшлифованных прочтений CCS. С постоянно растущей полимеразой читать продолжительности и усовершенствованиях CCS, в будущем рекомендуется создать полировка CCS считывается первой, поэтому окончательная полировка стенограммы становится необязательной.

Почему IsoSeq v3, а не установленная версия 1 или 2?

Постоянно увеличивающаяся пропускная способность системы Sequel привела к необходимости масштабируемое программное решение, способное обрабатывать миллионы операций чтения CCS, в то время как сохранение чувствительности и точности. Внутренние тесты показали, что IsoSeq v3 на порядки быстрее, чем используемые в настоящее время решения и SQANTI атрибуты IsoSeq v3 и выше количество идеально аннотированных изоформ:

Дополнительное преимущество, один двоичный файл Linux, не требующий зависимостей.

Почему с IsoSeq v3 количество транскриптов намного меньше?

Несмотря на то, что мы также наблюдаем меньше полированных транскриптов с IsoSeq v3 , общее качество намного выше. Большинство стенограмм низкого качества теряются в шаг демультиплексирования. Isoseq v1 / 2 classify слишком расслаблен и не фильтрует нежелательные молекулы до удовлетворительного уровня. Фактически, лима звонков на месте и эффективно удаляет большинство молекул, которые ошибочно помечены, как в двух 5 ‘или двух 3 ‘праймеры.Только правильная пара праймеров 5 ‘и 3’ позволяет идентифицировать полноразмерный стенограмма и ее ориентация.

Я не могу найти