Последовательности не были сопоставлены с геномом Salmo trutta , если они были успешно сопоставлены с геномом Salmo salar . Структурная классификация, указывающая, что EC-HQ относится к любой другой категории, кроме FSM в 9Таким образом, 0496 Salmo salar не исключает, что в Salmo trutta было бы нанесено другое изображение (например, FSM).

SQANTI также предоставляет дополнительную полезную информацию, такую ​​как количество экзонов, сигналы соединения сплайсинга (канонические или нет), длину CDS, полиА-сигналы выше по течению на 3′-конце и геномный процент А ниже по течению от 3′-сайта терминации (используется для оценки был ли неправильный запуск синтеза кДНК).

Функциональная аннотация

Все прочтения EC-HQ в окончательном неизбыточном наборе данных транскриптома (рис. 2) были подвергнуты функциональной аннотации с использованием программного пакета OmicsBox (рис. 3; BioBam, 2019 г.).). Кодирующие последовательности были предсказаны с помощью TransDecoder v5.5.0. (Haas et al., 2013; Haas and Papanicolaou, 2015) с использованием поиска по гомологии в отношении Pfam 32 для подтверждения ORF с минимальной длиной 150 п. н. в КДС). Поиск ОРС был задан как специфичный для цепи, и единственное наилучшее совпадение было сохранено для дальнейшего анализа.

Все полные последовательности CDS были загружены в рабочий процесс функциональных аннотаций OmicsBox (эквивалентный более старой программе Blast2GO) (Gotz et al., 2008) со следующими измененными параметрами взрыва: plastp-fast, фильтр видов 89593 Craniata <хордовые>, охват HSP-Hit 70%. По умолчанию пороговое значение e-значения для шага blastp составляло 1,0E-3. Критерии охвата HSP-Hit гарантировали, что любые совпадения были похожи в большей части последовательности, а не просто содержали очень похожую частичную последовательность. Результаты взрывов были загружены в модули картографирования и аннотации GO. В полных CDS также проводили поиск функциональных мотивов с использованием InterProscan. Результаты были объединены в окончательный файл функциональной аннотации. Этот процесс позволил нам идентифицировать изоформы транскриптов мРНК с полными кодирующими областями, идентифицировать генные коды, где они не могли быть предоставлены SQANTI, и предоставить функциональное описание белков в каркасе GO, а также коды ферментов.

Последовательности, которые были картированы на митохондриальной последовательности Salmo salar с помощью SQANTI, также были переданы в TransDecoder с использованием генетического кода митохондрий позвоночных для поиска ORF. Любые полные CDS из этих последовательностей также были функционально аннотированы, как описано выше.

Кроме того, для транскриптов в окончательном полноразмерном транскриптоме мРНК (см. раздел «Окончательная фильтрация мРНК на основе подтверждающих доказательств и представление TSA») мы определили подгруппы полноразмерных мРНК, экспрессированных по крайней мере в трех образцах из определенного тип органа, но не в любом другом типе органов в наших материалах. Для них мы создали многоуровневые диаграммы GO, показывающие наиболее конкретные термины GO, появляющиеся в наборе данных, по сравнению с пороговыми значениями численности по умолчанию, предложенными OmicsBox, без избыточности. Эти отсечки составили соответственно 144 транскрипта для жабр, 98 в голове и почках и 116 в печени.

Окончательная фильтрация мРНК, основанная на подтверждающих доказательствах и представлении TSA

Для идентификации прочтений EC-HQ, представляющих транскрипты мРНК, использовался внутренний скрипт Python (Фильтр, рис. 3). Внутренний скрипт отфильтровывал все чтения EC-HQ, и сохранялись только чтения EC-HQ, которые TransDecoder прогнозировал как содержащие полный CDS. Кроме того, они должны быть классифицированы SQANTI как полное совпадение сплайсов, новые в каталоге или новые не в каталоге с включением канонических соединений сплайсов. Если SQANTI классифицировал по-разному или только сгруппировал Cogent, минимальная поддержка по крайней мере 5 прочтений FLNC использовалась в качестве порога для включения таких структурных изоформ в наш окончательный полноразмерный транскриптом мРНК. Таким образом, для изоформ с этими структурными классификациями использовались несколько более строгие критерии поддержки FLNC, поскольку они не имели такого же уровня поддержки в существующих аннотациях генома, как описанные выше FSM, NIC и NNC (для которых требовалось только минимальное 2 Поддержка FLNC должна быть классифицирована как штаб-квартира). Сценарий также собрал всю информацию о структурных и функциональных аннотациях для отфильтрованных расшифровок в файл tsv (дополнительный файл 1).

Необработанные данные секвенирования PacBio и Illumina были отправлены в базу данных NCBI SRA, а окончательные последовательности транскриптов в нашем полноразмерном транскриптоме мРНК были отправлены в Transcriptome Shotgun Assembly под номером GIYK00000000. Версия, описанная в этом документе, является первой версией, GIYK01000000.

Сравнение транскриптомов с применением анализа BLAST и аннотаций SQANTI3

Полный набор транскриптов мРНК RefSeq Salmo salar был идентифицирован и загружен в виде файлов fasta с полными записями с использованием поиска нуклеотидов с фильтрацией в базе данных NCBI RefSeq. Их искали по нашему полноразмерному транскриптому мРНК с использованием blast 2.9.0 + с отсечкой e-value 1e-15 и outputfmt «6 std qcovhsp slen». Те же параметры поиска использовались при обратном сравнении с нашим транскриптомом в качестве запроса к последовательностям RefSeq. Для фильтрации результатов взрыва использовался внутренний скрипт Python. Фильтр классифицировал стенограммы по трем категориям. Совпадения между запросом и субъектом, отвечающие следующим критериям, были классифицированы как идентичные изоформы: Е-значение менее 10 ^–50 , процентная идентичность ≥ 99 % и либо покрытие запроса на пару сегментов с высокой оценкой > 99 %, либо длина выравнивания ^∗ 100/длина субъекта > 99. Это гарантировало, что любое совпадение соответствует пороговым значениям e-значения и идентичности. имел более чем 99%-ное покрытие запроса последовательностью субъекта или более чем 99%-ное покрытие субъекта последовательности запроса. Эти пороги гарантировали, что совпадения, классифицированные как идентичные изоформы, были последовательно совпадающими последовательностями, происходящими из одних и тех же изоформ, но позволяли одной из них отличаться по длине UTR по сравнению с другой. Совпадения в этой категории были дополнительно сгруппированы в зависимости от того, имели ли РНК RefSeq более длинный UTR (покрытие запросов на пару сегментов с высокой оценкой < 99%) или имеет ли совпадающая мРНК в нашем полноразмерном транскриптоме мРНК более длинный UTR (длина выравнивания ^* 100/длина субъекта <99). Ко второй категории, названной значительными совпадениями, относились все совпадения, не соответствующие идентичным критериям изоформы, но со значением E менее 10 ^–15 . Остальные последовательности запросов, возвращающие E-значения более 10 ^–15 , были отнесены к категории несовпадающих мРНК RefSeq (или несовпадающих полноразмерных мРНК в обратном поиске).

Перекрытие между мРНК в нашем наборе данных и мРНК на основе геномной аннотации (эталонная последовательность генома GCF_000233375.1) будет числом последовательностей, классифицированных SQANTI3 как FSM. Они были получены из файла final.tsv (дополнительный файл 1). Для создания диаграммы Венна в разделе «Кластеризация и группировка Уникальные данные EC-HQ показали, что 22% из них не могут быть сопоставлены с текущей последовательностью генома атлантического лосося».

мРНК RefSeq с несовпадающими последовательностями по сравнению с коррелированными мРНК (экзонами) в сборке генома атлантического лосося идентифицировали путем добавления термина «И «разрыв сборки:» [Все поля]» к поиску в базе данных RefSeq. Они представляли РНК RefSeq, которые не поддерживаются текущей последовательностью генома. Кроме того, количество таких мРНК RefSeq, которые поддерживаются нашими полноразмерными мРНК, было получено путем поиска их инвентарных номеров среди тех, которые отнесены к идентичной категории изоформ, описанной выше.

Результаты

Гибридная коррекция ошибок повысила точность последовательности и позволила удалить артефакты секвенирования

Результаты секвенирования Pacbio и Illumina обобщены в дополнительном файле 2. Как и ожидалось, одна клетка Sequel II генерировала примерно 4–7 раз больше чтений HQ, чем две ячейки Sequel I, но процент чтений HQ, сгенерированных из чтений CCS, был одинаковым. Кроме того, распределение чтений по размерам с двух платформ показало очень похожее распределение (дополнительный файл 3), что указывает на то, что считывания, созданные двумя платформами, были одинакового качества. После фильтрации HQ было в общей сложности 2 080 166 чтений HQ, распределенных по 11 образцам (дополнительный файл 2). Количество прочтений Illumina во всех образцах, примененных для исправления ошибок, было более 9.00 миллионов со средним качеством phred 36. Это привело к 1 596 834 чтениям EC-HQ.

Распределение покрытия считываниями Illumina на считываниях HQ показано на рисунке 4, а точное количество чтений HQ, покрываемых определенным процентом чтений Illumina, указано в дополнительном файле 4. На рисунке показано, что большинство чтений HQ были сохранены (и исправлены ошибки) этим процессом фильтрации. Более 81% прочтений HQ имели охват 99% или более, что свидетельствует о том, что большинство прочтений HQ были с исправлением ошибок во всей их последовательности. Основной причиной удаления было не общее плохое освещение. Вместо этого последовательности, которые были удалены (23,3%), были сильно взвешены в сторону прочтений HQ с высоким покрытием (9охват 5–99%), но с небольшими внутренними пробелами в покрытии чтения Illumina. При 99% охвате было, например, приблизительно 100 000 прочтений HQ с внутренними пробелами, не охваченными графиком де Брюжина (DBG). Это может указывать на то, что эти чтения HQ были артефактами, созданными в конвейере PacBio, представляющими загрязняющие геномные последовательности или продукты слияния (разные транскрипты, слитые вместе и секвенированные SMRT). Это наиболее вероятное объяснение, поскольку только меньшие части последовательностей EC-HQ не были покрыты независимыми и гораздо более «глубокими» последовательностями транскриптома с платформы Illumina. Хотя степень коррекции одной п.н. не могла быть измерена напрямую, мы сравнили длины CDS до и после исправления ошибок. Это сравнение показало, что 118 199 (7%) прочтений увеличили размер ORF после коррекции, 1 455 732 (91%) имели ту же длину ORF, а 22 903 (2%) имели более короткую ORF. Таким образом, значительная часть прочтений была исправлена, и 75% из них увеличили длину своих CDS. Количество коротких чтений, примененных для исправления ошибок, составило более 927 миллионов (дополнительный файл 1). Это равно 20% всех коротких прочтений, используемых для аннотирования последовательностей экзома в текущей сборке генома.

Рис. 4. Распределение покрытия по LoRDEC для последовательностей с (оранжевые столбцы) и без (оранжевые столбцы) внутренними пропусками в интервале покрытия 75–100%.

Одна треть транскриптов представляла собой вкрапленные повторы

Набор данных чтения EC-HQ был проанализирован с помощью Repeatmasker для идентификации транскриптов, происходящих из вкрапленных повторов (Repeatmasker, рис. 2). После фильтрации любых прочтений EC-HQ, совпадающих с вкрапленными повторами, набор данных был сокращен до 1 090 532 прочтений EC-HQ. Это показало, что около трети (32%) всех транскриптов атлантического лосося представляют собой просто экспрессированные вкрапленные повторы.

Кластеризация и группировка уникальных прочтений EC-HQ показали, что 22% из них не могут быть сопоставлены с текущей последовательностью генома атлантического лосося

Картирование прочтений EC-HQ с геномом Salmo salar с помощью cDNA_cupcake (рис. 2) показало 89% успеха при картировании 972 904 прочтений EC-HQ. Они были сокращены до 87 315 ​​уникальных чтений после кластеризации CD-Hit. Однако примерно половина (59 913 из 117 628) оставшихся прочтений EC-HQ может быть кДНК_капкейком, сгруппированным с геномом Salmo trutta . CD-Hit сократил их до 8721 уникального чтения. Остальные 57 715 чтений EC-HQ были сгруппированы с помощью Cogent, которые были сокращены до 16 367 уникальных чтений с помощью CD-Hit. cDNA_Cupcake и Cogent также присвоили каждой последовательности номер локуса. Таким образом, если они картировались в одном и том же месте генома или псевдогенома Cogent перекрывающимся образом, они были сгруппированы вместе как последовательности, которые, вероятно, были изоформами одного и того же транскрипта. В целом кластеризация cDNA_cupcake, Cogent и final CD-Hit сократила полный набор данных до 112 404 уникальных транскриптов EC-HQ (окончательный неизбыточный транскриптом EC-HQ, рисунок 2). Таким образом, 78% уникальных транскриптов EC-HQ были сопоставлены с Salmo salar геном, в то время как примерно 8% было сопоставлено с геномом Salmo trutta . Остальные 14% уникальных прочтений EC-HQ (кластеризованные Cogent) не могут быть сопоставлены ни с одним из двух геномов лососевых. Очень маловероятно, что восемь процентов транскриптов будут хорошо отображены в геноме Salmo trutta, если причиной несоответствия геному Salmo salar будет низкое качество или ошибка в считываниях EC-HQ. Напротив, это указывало на то, что в текущей последовательности генома атлантического лосося отсутствуют или неправильно собраны последовательности, которые препятствуют успешному картированию удивительно большой доли (22%) уникальных прочтений EC-HQ атлантического лосося. Исходя из этого, ошибки в последовательности генома могут быть вероятным объяснением того, почему 14% транскриптов, сгруппированных Cogent, не могут быть сопоставлены с 9Последовательность генома 0496 Salmo salar (или генома Salmo trutta ). Тот факт, что наш окончательный полноразмерный транскриптом намного лучше соответствует текущим мРНК RefSeq, чем транскрипты (аннотированные экзоны) в последовательности генома (идентичные изоформы против FSM, раздел «Сравнение полноразмерного транскриптома с аннотацией транскрипта генома с применением SQANTI3»). ») также указывает на неправильную аннотацию продуктов сращивания. Таким образом, полноразмерный транскриптом de novo из этого исследования может помочь улучшить текущую аннотацию транскрипта в последовательности генома. В свете этого 22% транскриптов, которые в настоящее время не сопоставлены с последовательностью генома атлантического лосося, представляют собой очень полезный источник информации о долгосрочных связях, которую можно использовать для улучшения сборки последовательности генома.

Транскриптом

сопоставленные с геномом Salmo trutta , были структурно аннотированы с использованием SQANTI3 (рис. 3). Остальные последовательности, которые были сгруппированы Cogent, не могли быть осмысленно аннотированы таким образом, а скорее полагались на функциональные аннотации (OmicsBox, рис. 3) для классификации категорий РНК. Полное распределение структурных классификаций для всех неизбыточных чтений EC-HQ показано в таблице 2.

Таблица 2. Распределение SQANTI-классификаций и группировка Cogent для неизбыточного транскриптома высокого качества с исправлением ошибок (рис. 2) и отфильтрованного транскриптома мРНК (рис. 3).

Все 112 404 уникальных последовательности, независимо от метода кластеризации, также использовались для предсказания ORF с помощью Transdecoder и дальнейшей функциональной аннотации с помощью OmicsBox, если было предсказано, что они будут иметь полную CDS. После последнего этапа фильтрации (Фильтр, рис. 3) наш окончательный набор данных мРНК состоял из 71 461 неизбыточного чтения EC-HQ, которые с использованием SQANTI3 и наших критериев OmicsBox были аннотированы как транскрипты, кодирующие белок, с полной CDS. Было предсказано, что эти транскрипты происходят из 23 071 локуса или вероятных локусов в случае транскриптов Cogent, в среднем по три транскрипта на локус. Список прочтений EC-HQ, а также результаты анализа SQANTI, происхождение образца, поддержка FLNC, описания генов, коды GO, коды ферментов и идентификаторы контигов TSA представлены в дополнительном файле 1. Несмотря на то, что они классифицируются как антисмысловые, генные, межгенные или слияние SQANTI, эти категории содержали 2591, классифицированные TransDecoder как имеющие полную CDS и с поддержкой Pfam в качестве полноразмерных кодирующих белок мРНК. Дополнительные 4803 транскрипта, аналогичным образом классифицированные TransDecoder как мРНК, кодирующие полноразмерный белок, не были картированы ни с одним из геномов лососевых (кластеризовано Cogent). Шестьдесят семь процентов транскриптов, не сопоставленных или сопоставленных с категорией небелкового кодирования SQANTI3, также были подтверждены как транскрипты, кодирующие белок, с помощью следующей аннотации GO (раздел «Более 80% транскриптов были присвоены терминам и подмножествам GO»). Выявленные органоспецифические паттерны экспрессии») Таким образом, в общей сложности 71 461 уникальных транскриптов (63%) были классифицированы как мРНК, в то время как остальные транскрипты (37%), вероятно, представляли собой некодирующие РНК какого-то другого типа. Распределение мРНК по длине показано на рисунке 5. Длина транскриптов мРНК варьировалась от 319оснований до 13 331 основания в длину, со средней длиной 1402 п.н. и средней длиной 3209 п.н.

Рисунок 5. Окончательный полноразмерный транскриптом мРНК, распределенный по длине транскрипта. В каждом столбце показано количество транскриптов, попадающих в заданный интервал длины 500 п.н.

Чтения EC-HQ в окончательном наборе данных мРНК, отнесенном к категории Full Splice Match (FSM) (финал в таблице 2), представляют собой совпадение, идентичное известной изоформе в текущих аннотациях генома ( Salmo salar или Salmo trutta ) с точки зрения схемы сплайсинга и идентичности последовательности (SQANTI3 по умолчанию 95% отсечки). Большинство таких совпадающих транскриптов в текущей аннотации атлантического лосося были созданы на основе предсказаний, основанных на последовательности генома с переменной поддержкой коротких прочтений HTS или EST (96% мРНК Salmo salar RefSeq являются записями XM). Таким образом, FSM в нашем наборе данных представляют собой экспериментальную проверку 17 787 изоформ транскриптов с помощью полноразмерных мРНК, секвенированных одной молекулой. Удивительно, но их было 9.60 прочтений EC-HQ, картированных как FSM в геноме Salmo trutta. Очевидно, это также настоящие полноразмерные мРНК атлантического лосося, но несоответствия в текущей сборке генома Salmo salar помешали картированию этих транскриптов с последовательностью генома Salmo salar .

Транскрипты, обозначенные как «новый в каталоге» (NIC) или «новый не в каталоге» (NNC) с экзонами, определяемыми каноническими соединениями сплайсинга, представляют собой новые изоформы, которые в настоящее время не аннотированы в последовательностях генома. NIC имеют комбинации известных сайтов сплайсинга, что делает их изоформами с новыми комбинациями аннотированных экзонов. было 17 039таких новых транскриптов в окончательном наборе данных примерно столько же, сколько и во всех FSM. Было еще большее количество NNC, всего 25 581 транскрипт, что иллюстрирует способность методов, основанных на длинных чтениях, идентифицировать новые изоформы, которые невозможно надежно предсказать с использованием только коротких чтений и последовательности генома. Опять же, значительная часть (8,5%) транскриптов в этих категориях может быть картирована и классифицирована SQANTI3 только с использованием генома Salmo trutta .

Остальные категории SQANTI3 (ISM, антисмысловые, генные, межгенные и слитые) составляли меньшую часть конечного транскриптома мРНК (всего 5291 транскриптов). Несмотря на то, что их структурная классификация SQANTI3 ставит под сомнение, были ли это настоящие мРНК, все они были поддержаны OmicsBox как полноразмерные мРНК. Кроме того, поскольку для фильтрации возможных артефактов из этих категорий использовался порог не менее 5 поддерживающих FLNC, они, вероятно, представляют собой настоящие транскрипты, кодирующие белок атлантического лосося. Хотя считывания ISM подтверждались аннотацией генома как совпадающие с известным транскриптом, но с отсутствующей экзонной последовательностью на 5′- или 3′-конце (или на обоих), все они имели полную CDS. Мы использовали более консервативные критерии поддержки FLNC (не менее 5 FLNC) для ISM, и, учитывая этот порог, менее вероятно, что они являются неполными, а скорее представляют собой полноразмерные мРНК. Небольшое количество последовательностей ISM (3,7%) имело 80% или более содержания А в 20 основаниях непосредственно ниже того места, где они были нанесены на карту в последовательности генома. Это могло привести к неправильному праймированию во время синтеза кДНК, что привело к неправильной длине 3’UTR в этих транскриптах. Доля транскриптов, сгруппированных Cogent с не менее чем 5 поддерживающими FLNC, примерно такая же большая (4803 транскрипта), как и те, которые сопоставлены с Салмо трутта . Опять же, это иллюстрирует способность секвенирования транскриптома на основе длительного считывания идентифицировать транскрипты, не обнаруженные предсказаниями генома, поддерживаемыми коротким считыванием.

Обзор количества FLNC, поддерживающих каждую мРНК EC-HQ в окончательном полноразмерном транскриптоме мРНК, представлен на рисунке 6. На рисунке показано, что более 74% поддерживают более пяти FLNC независимо от категории. Это означает, что примерно 70% категорий FSM, NIC и NNC были поддержаны пятью или более FLNC, даже если критерием включения для этих категорий было два или более FLNC.

Рис. 6. Распределение полноразмерной неконкатемерной поддержки в окончательном наборе данных мРНК. В каждом столбце показано количество транскриптов в конечном транскриптоме мРНК с количеством полноразмерных неконкатемерных ридов, поддерживающих длинные риды.

Сценарий Python использовался для оценки количества случаев, когда транскрипты, аннотированные как кодирующие один и тот же ген SQANTI или OmicsBox, были назначены разным локусам cdna_Cupcake или разным семействам генов Cogent. В целом 12% генов имели по крайней мере два транскрипта мРНК EC-HQ, которые были картированы в разных локусах. Это указывает на то, что по крайней мере 12% экспрессированных генов, вероятно, были представлены несколькими паралогами в нашем наборе данных.

Стенограммы депонированы в DDBJ/EMBL/GenBank в качестве проекта Transcriptome Shotgun Assembly под регистрационным номером GIYK00000000. Версия, описанная в этом документе, является первой версией, GIYK01000000. Идентификатор TSA Contig ID для каждой последовательности указан в дополнительном файле 1. Сравнение

показало, что транскриптом

Текущая информация о транскриптах последовательностей мРНК атлантического лосося предоставлена ​​из два источника NCBI. Одним из них является информация о транскриптах (варианты транскриптов и изоформ, определяемые их экзонами), приведенная в аннотации к текущим 9Эталонная последовательность генома 0496 Salmo salar . Другим источником является текущая коллекция транскриптов мРНК Salmo salar в базе данных RefSeq. Хотя можно было бы ожидать, что они хорошо соответствуют друг другу, они различаются информацией о последовательностях, приведенной для тысяч транскриптов. Существует 4475 мРНК RefSeq, которые аннотированы как имеющие пробел или дополнительную последовательность, которой нет в текущей эталонной последовательности генома. Транскриптом мРНК de novo , основанный на длительном прочтении, из настоящего исследования, возможно, может помочь решить, какие последовательности транскриптов являются правильными. Ожидается, что применяемый здесь метод на основе одной молекулы будет лучшим для идентификации изоформ. Этот потенциал для повышения качества аннотированных изоформ транскриптов с помощью нашего набора данных был исследован путем сравнения нашего транскриптома длительного чтения с каждым из доступных источников (последовательности мРНК RefSeq и аннотация транскриптов в последовательности генома RefSeq).

Сравнение полноразмерного транскриптома и транскриптома RefSeq с применением BLASTN

мРНК Salmo salar в RefSeq состоят в основном из транскриптов, которые предсказаны с использованием последовательности генома, но поддерживаются и исправляются ошибки на основе EST и последовательностей с коротким считыванием, как часть конвейера аннотации генома эукариот NCBI ¹ . Все 97 604 последовательностей мРНК Salmo salar в базе данных RefSeq были сопоставлены с нашим набором данных, классифицируя совпадения по трем категориям (рис. 7). Идентичные изоформы [99% идентичность и покрытие более короткой совпадающей последовательности более длинной совпадающей последовательностью (см. раздел «Сравнения транскриптомов с применением анализа BLAST и аннотаций SQANTI3» для более подробной информации)]. Второй категорией были значительные совпадения (все транскрипты со значениями e меньше 1e-15, но не отвечающие очень строгим критериям идентичности изоформ), а третьей категорией были названы несоответствующие мРНК RefSeq (все транскрипты со значениями e больше, чем 1e-15). чем Е-15 или без попаданий). При фильтрации в соответствии с этими критериями 24 415 (25%) транскриптов RefSeq относились к категории идентичных изоформ, что обеспечивает экспериментальную проверку четверти изоформ в базе данных RefSeq с помощью полноразмерных мРНК из нашего транскриптома с длительным чтением. Кроме того, было примерно в два раза больше мРНК со значительными совпадениями (49).785) против нашего транскриптома, что указывает на то, что дополнительная половина всех транскриптов RefSeq присутствовала в нашем наборе данных в виде сплайс-вариантов или паралогов. Учитывая, что части последовательностей мРНК RefSeq предсказаны из последовательности генома (96% составляют записи XM), существует также вероятность того, что некоторые совпадения в категории значимых совпадений на самом деле являются идентичными изоформами, но не соответствуют самому строгие критерии, которые мы применили для этой категории из-за ошибок последовательности. 23 404 мРНК в категории несовпадающих RefSeq-мРНК, вероятно, представляют собой транскрипты генов, не экспрессирующихся в органах, включенных в это исследование. мРНК в категории идентичных изоформ показали распределение различий в длине, при этом более длинный транскрипт был взят из набора данных RefSeq в 42% случаев, в то время как два совпадающих транскрипта отклонялись менее чем на одну сотую своей длины в 28% случаев, а в остальные 30% более длинных расшифровок были из наших de novo транскриптом. Эти различия в размерах в большинстве случаев были небольшими и затрагивали только UTR, а не CDS.

Рисунок 7. Круговая диаграмма , показывающая распределение результатов blast при поиске всех мРНК Salmo salar RefSeq по сравнению с окончательным набором данных мРНК полной длины. Синие — идентичные изоформы, оранжевые — значимые совпадения, серые — несовпадающие мРНК RefSeq.

Мы также провели обратное сравнение с новым поиском blastn, где нашим набором данных были последовательности запросов против Salmo salar RefSeq мРНК (рис. 8). Это показало, насколько хорошо наш транскриптом представлен в текущем транскриптоме RefSeq. Примечательно, что количество последовательностей, по крайней мере с одним бластным попаданием, отвечающим идентичным критериям изоформ, было ниже при использовании полноразмерного транскриптома в качестве запроса, чем при использовании мРНК RefSeq в качестве запроса (20 582, рис. 8 против 24 415, рис. 7). Это указывает на то, что некоторые из наших транскриптов были классифицированы как идентичные изоформам нескольких последовательностей, которые в настоящее время перечислены отдельно в RefSeq (рис. 7). Некоторые возможные объяснения этого открытия заключаются в том, что некоторые последовательности в RefSeq являются избыточными и/или что некоторые из наших расшифровок имеют неполные UTR, из-за чего они не могут различать некоторые записи RefSeq. Сравнение также показало, что только 566 наших последовательностей не имели значительного попадания взрыва (<1e-15). Таким образом, результат обратного бластн-анализа показал, что наш транскриптом, имеющий 99% поддержки в RefSeq состояли почти исключительно из вариантов транскриптов известных генов, а не из транскриптов новых генов (рис. 8). Взятые вместе, два бластных анализа показали, что наш полноразмерный транскриптом de novo подтвердил 25% известных в настоящее время транскриптов атлантического лосося в RefSeq, предоставил большое количество новых изоформ, значительно совпадающих с 50% известных транскриптов в RefSeq, но не обнаружили много транскриптов новых генов (1%, рис. 8).

Рис. 8. Круговая диаграмма , показывающая распределение результатов бластов при поиске в окончательном наборе данных полной длины мРНК по всем мРНК Salmo salar RefSeq. Синие — идентичные изоформы, оранжевые — значительные совпадения, серые — несовпадающие новые мРНК.

Сравнение полноразмерного транскриптома с аннотацией транскрипта генома с применением SQANTI3

На рис. 9 показано распределение транскриптов общих изоформ при сравнении нашего полноразмерного транскриптома с мРНК в Salmo salar аннотация генома. На рисунке показано, что 17 782 транскрипта мРНК EC-HQ полностью соответствовали (идентичны) сплайсингу уже аннотированным транскриптам в версии RefSeq сборки генома Salmo salar . Большинство изоформ мРНК, предсказанных в аннотации генома Salmo salar (81%, мРНК Salmo salar без FSM на рисунке 9), не могут быть подтверждены нашими транскриптами мРНК с длительным чтением. Кроме того, в нашем окончательном наборе данных было 53 674 мРНК (75%, новые мРНК на рис. 9).), которые представляли собой новые изоформы, картированные в геноме (61%, категории, не относящиеся к FSM, в Salmo salar в таблице 2), или мРНК, которые вообще не картировались (14%, категории Salmo trutta или Cogent в таблице 2). ) из-за несоответствия на уровне последовательности генома.

Рисунок 9. Диаграмма Венна, иллюстрирующая количество идентичных изоформ (Full Slice-Match), общих для мРНК в аннотации генома и конечного полноразмерного транскриптома мРНК. Ни один FSM не представляет изоформы в аннотации генома без идентичного совпадения в конечном полноразмерном транскриптоме мРНК. Новые мРНК относятся к изоформам транскриптов в окончательном наборе данных мРНК без идентичного совпадения с последовательностями, аннотированными в 9Сборка генома 0496 Salmo Salar .

Тот факт, что FSM было значительно меньше (19%, рис. 9), чем количество идентичных изоформ (25%, рис. 7), может указывать на то, что последовательность генома является менее надежным источником последовательностей транскриптов. Это также подтверждается тем фактом, что 14% транскриптов мРНК вообще не картировались (сопоставлены с Salmo trutta или сгруппированы Cogent). Кроме того, 1268 транскриптов, которые не картировались с геномом Salmo salar , относились к категории идентичных изоформ при сравнении бластов с мРНК RefSeq. Аналогичное сравнение, в котором транскрипты RefSeq, не соответствующие эталонной последовательности генома (4475 транскриптов, методы, «Сравнения транскриптомов с применением анализа BLAST и аннотаций SQANTI3»), сравнивались с нашими de novo транскриптом показал, что 673 из них относятся к категории идентичных изоформ. Все вместе эти сравнения показывают, что полноразмерный транскриптом de novo может внести значительный вклад в улучшение качества аннотаций текущего транскрипта и помочь в улучшении сборки эталонного генома.

Более 80% расшифровок были присвоены GO Термины и подмножества Выявленные органоспецифические паттерны экспрессии

На рис. 10 показано распределение результатов аннотации OmicsBox в окончательном наборе данных мРНК. Восемьдесят два процента транскриптов были успешно аннотированы по крайней мере одним термином GO (GOs> 0, рисунок 10). Остальные 18% транскриптов без терминов GO были распределены на транскрипты со значительными бласт-хитами, но на белки без терминов GO в базе данных Gene Ontology (9).%), в то время как у другой половины не было значительных совпадений в базе данных белков RefSeq. Вместо этого они были подтверждены как кодирующие белок их длиной CDS и поддержкой в ​​Pfam. Функциональная аннотация, включая термины GO и символы генов, включена в дополнительный файл 1. Распределение количества терминов GO, присвоенных каждой последовательности, показало, что 50% транскриптов в наборе данных были назначены между 2 и 5 терминами GO, в то время как 14% были назначены еще больше. Вместе мы получили солидный уровень функциональной аннотации примерно для двух третей нашего набора данных. Всего 46 769из них также были аннотированы конкретными генными символами на основе результатов Blastp от OmicsBox.

Рисунок 10. Распределение числа предсказанных терминов Генной онтологии. В каждом столбце показано количество расшифровок, попадающих в заданный интервал терминов онтологии генов, определенных для расшифровки.

Десять процентов всех FLNC в наборе данных были получены только из 17 мРНК (перечислены в дополнительном файле 5). Это продемонстрировало, что в конечном транскриптоме мРНК было несколько высокоэкспрессированных транскриптов, кодирующих белок. Единственная самая многочисленная стенограмма, alb1 , составляли 3,8% всех FLNC сами по себе, а первые пять наиболее распространенных транскриптов составляли 6,5% всех FLNC. Сывороточный альбумин ( alb1 ) и два других наиболее экспрессируемых гена ( fgg и itih4 ) кодировали секреторные белки из тканей печени. Другие гены с высокой экспрессией, такие как два варианта сплайсинга актина ( actb ), селенопротеин P ( SelP ) и аполипопротеин Eb ( apoeb ), экспрессировались во всех тканях. Удивительным открытием стало то, что один из высокоэкспрессированных транскриптов, аннотированный как H-подобный фактор комплемента ( cfhr5 ) не соответствовал последовательности генома атлантического лосося, но был FSM в геноме Salmo trutta . Кроме того, два других транскрипта с высокой экспрессией (протромбин-подобный и трансферрин-А-подобный) были аннотированы SQANTI как продукты слияния. Опять же, это, вероятно, связано с неправильной аннотацией генома, а не с артефактами последовательности, учитывая большое количество FLNC, поддерживающих эти транскрипты в нескольких тканях.

Окончательные транскрипты мРНК были получены из трех органов: печени, жабр и головного мозга. Некоторые из транскриптов с высокой экспрессией присутствовали только в образцах печени, что указывает на то, что конвейер транскриптома может идентифицировать транскрипты, экспрессируемые органоспецифическим образом. Применяя консервативный подход к идентификации таких органоспецифических транскриптов, мы искали в полноразмерном транскриптоме мРНК транскрипты, которые были экспрессированы по крайней мере в трех образцах из одного органа, в то время как они отсутствовали в образцах из любого из двух других органов. Это показало, что 2717 транскриптов экспрессируются только в жабрах, либо из генов, экспрессируемых только в жабрах (1811), либо сплайс-вариантов, экспрессируемых только в жабрах (9).06). В печени было 1784 транскрипта, из которых 1113 были из генов, специфичных для печени, и 671 были специфичными для печени сплайс-вариантами. В головной почке было 1757 транскриптов, 700 из генов, специфичных для головной почки, и 1057 были специфичными для головной почки сплайс-вариантами. На рисунках 11–13 показано распределение наиболее специфических общих терминов Biological Process GO (см. Материалы и методы, «Функциональная аннотация») для этих трех органоспецифических групп мРНК. Каждый термин GO указывает на биологические процессы, которые обогащены транскриптами, специфичными для органа. GO-термины в транскриптах жабр ясно указывают на специфические функции жабр, такие как транспорт ионов и сигнальный путь рецептора клеточной поверхности, гены, которые принимают участие в осморегуляции. Транскрипты, аннотированные как играющие роль в развитии системы (например, развитие конкретных типов тканей и регуляция транскрипции ДНК), также специфически экспрессировались в образцах жабр (рис. 11). Головная почка у костистых рыб состоит из нескольких тканей с различными функциями, такими как экскреция, биосинтез стероидов и иммунный ответ. Среди транскриптов, специфически экспрессируемых в головной почке, были транскрипты, участвующие в биосинтезе макромолекул, ароматических и азотистых соединений. Многие также были отмечены как участвующие в организации и транспорте органелл (рис. 12). Было 132 иммунных функции и иммунного ответа генов, экспрессируемых только в голове и почке, хотя они не были признаны единой группой иммунных генов с помощью применяемых здесь методов GO (наиболее конкретные общие термины GO). Некоторые примеры таких транскриптов включают VIG2, различные INF, хемокины и толл-подобные рецепторы. Транскрипты в печени (рис. 13) показали термины GO, связанные с такими процессами, как метаболизм, биосинтез и свертывание крови (например, высоко экспрессированный fgg и itih4 ). Опять же, транскрипты, экспрессируемые исключительно в этом органе, как и ожидалось, оказались среди транскриптов, кодирующих белки, связанные с функцией печени. Взятые вместе, результаты здесь показали потенциал нашего конвейера транскриптома для идентификации генов и вариантов сплайсинга, которые имеют определенные органоспецифические функции.

Рис. 11. Диаграмма многоуровневой онтологии генов, Джилл. На круговой диаграмме показаны наиболее специфические термины генной онтологии, встречающиеся по крайней мере в 144 транскриптах, специфичных для жабр, без избыточности (см. также раздел «Функциональная аннотация» в разделе «Материалы и методы»).

Рисунок 12. Диаграмма Multilevel Gene Ontology, голова-почка. На круговой диаграмме показаны наиболее специфические термины генной онтологии, встречающиеся по крайней мере в 98 транскриптах, специфичных для головы и почек, без избыточности (см. также «Функциональная аннотация» в разделе «Материалы и методы»).

Рис. 13. Диаграмма Multilevel Gene Ontology, печень. На круговой диаграмме показаны наиболее специфические термины генной онтологии, встречающиеся по крайней мере в 116 транскриптах, специфичных для жабр, без избыточности (см. также Материалы и методы «Функциональная аннотация»).

Обсуждение

Преимущества применения гибридной коррекции ошибок одномолекулярных длинных чтений при секвенировании транскриптома

Наш проект был направлен на создание полноразмерного транскриптома мРНК с точностью последовательности референсного уровня из различных образцов органов путем обработки PacBio long-reads. считывания с гибридным исправлением ошибок с считываниями парных концов Illumina из тех же образцов. Подобные подходы использовались для создания транскриптомов высокого качества у других видов (Feng et al., 2019).; Puglia et al., 2020), но это первое в своем роде исследование атлантического лосося. Стратегия и основные функции конвейера показаны на рисунках 1–3. Во-первых, первоначальное создание консенсусных последовательностей из отдельных молекул, удаление артефактов и консервативная кластеризация были достигнуты с помощью пакета SMRTLink IsoSeq3 (PacBio, 2020; рисунок 1). Эта обработка исправляет большую часть высокой частоты необработанных ошибок, связанной с секвенированием PacBio [по оценкам, 11–14% (Roberts et al., 2013)]. Результатом являются последовательности (называемые считываниями HQ), которые поддерживаются как минимум двумя одиночными секвенированными молекулами с прогнозируемой точностью не менее 99%.

Первоначальная проверка прочтений HQ в материалах показала, что было много случаев ошибок сдвига рамки, приводящих к неправильным CDS или преждевременным стоп-кодонам (данные не показаны). Хотя мы не могли с уверенностью заключить, что во всех случаях это были ошибки секвенирования, такие ошибки не были неожиданными, учитывая точность последовательности 99% и тот факт, что считывания PacBio подвержены числовым ошибкам в гомополимерах (Tedersoo et al., 2018). Этой точности было бы недостаточно для нашей цели, поскольку мы стремились создать последовательности транскриптов с качеством столь же высоким (или лучше, чем) мРНК атлантического лосося в RefSeq. Применение подхода, при котором длинные чтения исправлялись с помощью данных секвенирования коротких чтений с последующей фильтрацией последовательностей, не поддерживаемых обоими наборами данных, казалось лучшим решением (Au et al., 2012). Подход с исправлением ошибок использует превосходную производительность платформы Pac Bio для идентификации структурных изоформ (и различий между очень похожими паралогами) путем секвенирования одной молекулы с длительным считыванием (Liang et al., 2016), в то время как точность, как ожидается, будет значительно выше. увеличивается из-за гораздо более высокой глубины чтения и качества phred, обеспечиваемого более короткими чтениями. Кроме того, тип ошибок, наиболее часто получаемых на двух платформах, неодинаков, и вероятность получения одной и той же загрязняющей последовательности из геномной ДНК или других артефактов слияния при обработке одного и того же образца в двух независимых методах синтеза кДНК и разных методах подготовки библиотеки маленький. Вместе последовательности транскриптов, созданные с помощью отдельных методов обработки образцов РНК, вероятно, снижали вероятность сохранения последовательностей с ошибками, генерируемыми в каждом из двух конвейеров обработки образцов, в окончательных отфильтрованных считываниях EC-HQ (рис. 2).

Предыдущее исследование (Sahraeian et al., 2017), в котором сравнивались различные инструменты для анализа последовательностей РНК, определило LoRDEC (Salmela and Rivals, 2014) как эффективный и точный инструмент для гибридной коррекции ошибок, и LoRDEC был успешно реализован в нашем трубопровод. Мы применили фильтрацию чтений EC-HQ, которая гарантировала удаление длинных чтений с внутренними пробелами, не поддерживаемыми более короткими чтениями. Вместе подход к исправлению ошибок с очень надежной поддержкой коротких чтений и дополнительным нижним порогом для поддержки FLNC гарантировал, что окончательные de novo последовательности транскриптома имели, в соответствии с результатами аналогичных исследований (Au et al., 2012), точность, сравнимую с другими справочными источниками транскриптов атлантического лосося.

Этот проект направлен на определение характеристик РНК, кодирующих белки. Поэтому в нашем конвейере был реализован программный пакет RepeatMasker, чтобы гарантировать, что окончательные последовательности не будут содержать транскрипты из длинных перемежающихся повторов. Треть последовательностей была идентифицирована как своего рода длинные вкрапленные повторяющиеся транскрипты. Это была удивительно большая доля всех расшифровок. Будущие проекты по транскриптомам атлантического лосося получат большую пользу от удаления таких транскриптов до синтеза кДНК и подготовки библиотеки (Жулидов, 2004). Кроме того, после фильтрации с помощью RepeatMasker значительная часть (37%) уникальных прочтений EC-HQ все еще не была классифицирована как транскрипты, кодирующие белок. Это показало, что наш конвейер, вероятно, идентифицировал тысячи длинных некодирующих РНК (днРНК). Характеристика днРНК с помощью подходов длительного считывания стала золотым стандартом для изучения днРНК (Wan et al., 2019).), и характеристика lncRNAs атлантического лосося из этих материалов в настоящее время продолжается в рамках параллельного проекта (рукопись готовится).

Полноразмерный транскриптом мРНК значительно увеличил количество изоформ

Независимо от того, сравниваете ли мы наши данные с аннотацией последовательности генома (SQANTI3) или анализом бластов с мРНК RefSeq атлантического лосося, около 70% окончательного транскриптома мРНК представляют собой новые изоформы. Эти новые изоформы представляют собой либо варианты сплайсинга (каждый локус имел в среднем три варианта сплайсинга), либо паралоги. Это показало, что наш подход к секвенированию длинного считывания транскриптома привел к существенному увеличению числа изоформ транскриптов атлантического лосося. Такой высокий уровень успеха в открытии новых изоформ хорошо согласуется с результатами аналогичных исследований (Zhang et al., 2019).). Для фильтрации оставшихся категорий транскриптов было реализовано отсечение из 5 поддерживающих FLNC. Хотя стандартное ограничение, рекомендованное разработчиком, составляет 10 FLNC (Tseng, 2020a), в других недавних исследованиях утверждается, что 5 FLNC достаточно для поддержки таких категорий, как транскрипты слияния (Nattestad et al., 2018). Мы пришли к выводу, что этап гибридной коррекции ошибок с минимум тремя поддерживающими чтениями Illumina по всей последовательности предоставил дополнительные подтверждающие доказательства, необходимые для принятия оставшихся категорий SQANTI и расшифровок Cogent при поддержке 5 FLNC. Хотя они были классифицированы SQANTI3 как сомнительные транскрипты мРНК или вообще не картированы, мы считаем вероятным, что это также настоящие полноразмерные мРНК, но они неправильно аннотированы в текущей последовательности генома.

Длинночитаемый транскриптом как ссылка на исследование экспрессии вариантов сплайсинга и паралогов из органов или особых условий Чтения FLNC были из 17 наиболее распространенных транскриптов). В будущих проектах, направленных на характеристику всех полноразмерных мРНК в образце материала, удаление таких транскриптов (а также всех вкрапленных повторов) значительно увеличит вероятность идентификации более редко экспрессируемых транскриптов (Жулидов, 2004).

Глубина секвенирования с использованием одной клетки Sequel II была примерно в восемь раз выше, чем с использованием одной клетки Sequel I. Это согласуется с другими исследованиями (Castaño et al., 2020; Lang et al., 2020). Сочетая высокую глубину чтения из Sequel II с методами нормализации для удаления обильных транскриптов, можно было бы ожидать, что большинство транскриптов, экспрессируемых в образце, будут обнаружены. Результаты этого исследования продемонстрировали, что наш конвейер имел возможность идентифицировать большое количество транскриптов, однозначно выраженных в каждом из трех типов органов, включенных в материалы. Следующая функциональная аннотация также показала, что наиболее распространенные термины GO, аннотированные с транскриптами, в значительной степени соответствовали функции этих органов. Кроме того, любые материалы, исследованные с помощью этого подхода с длительным чтением, могут идентифицировать не только уникально экспрессированные гены, но и уникально экспрессированные сплайс-варианты. Это также было продемонстрировано в группе транскриптов, однозначно экспрессируемых в одном органе.

Полноразмерные транскриптомы имеют ряд полезных применений (Oikonomopoulos et al., 2020). Среди упомянутых мы предполагаем, что наши высококачественные полноразмерные транскриптомы могут служить ссылками в анализе экспрессии. Последовательность генома атлантического лосося может быть менее подходящей в качестве такого эталона, поскольку очень большая часть транскриптов в этом исследовании не выровнена должным образом. Различие между вариантами сплайсинга или паралогами путем сопоставления коротких прочтений с последовательностью генома было бы подвержено ошибкам (если не невозможно). Вместо этого транскриптом длительного считывания с исправлением ошибок, представляющий уникальные хорошо охарактеризованные варианты транскриптов, может применяться в качестве эталона для определения того, какие последовательности транскриптов с платформ для секвенирования с коротким считыванием, обеспечивающие большую глубину считывания при доступных затратах, можно выровнять, подсчитать и проанализировать. с помощью таких инструментов, как DESeq2 (Love et al., 2014). Дополнительным преимуществом такого анализа является то, что они одновременно обнаруживают вариации SNP. UTR являются богатым источником таких вариаций (Andreassen et al., 2010), и такое картирование потенциально может выявить аллель-специфическую транскрипцию, быть примененным для обнаружения QTL и даже выявить причинную изменчивость, приводящую к фенотипическим различиям в сравниваемых группах.

В заключение следует отметить, что использованный здесь конвейер гибридного скорректированного длинного считывания успешно генерировал высококачественные полноразмерные транскрипты мРНК. Подход с длинным считыванием привел к обнаружению новых вариантов сплайсинга и подтвердил четверть всех предсказанных мРНК атлантического лосося с помощью транскриптов, происходящих из длинных чтений, секвенированных одной молекулой. Состоящие исключительно из мРНК с полными CDS, более 80% были присвоены термины GO, и были идентифицированы тысячи генов или вариантов сплайсинга генов, экспрессируемых органоспецифическим образом. Этот полноразмерный транскриптом станет важным ресурсом для функциональной геномики в исследованиях аквакультуры лосося.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Названия репозитория/репозиториев и инвентарные номера можно найти в статье/дополнительных материалах.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено Национальным исследовательским органом Норвегии (NARA).

Вклад авторов

SR, RA, BH и T-KØ внесли свой вклад в концептуализацию и окончательное редактирование рукописи. SR и RA внесли свой вклад в разработку аналитического пайплайна, формальный анализ, а также написали, рассмотрели и отредактировали рукопись. SR участвовал в реализации конвейера, дополнительном программировании и написании исходного проекта. RA, BH и T-KØ внесли свой вклад в ресурсы. RA руководил и получал финансирование. RA и BH внесли свой вклад в администрирование проекта. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование финансировалось грантом Норвежского исследовательского совета для RA (280839/E40).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Саймона Вели из Норвежского ветеринарного института за предоставление контрольной ткани SAV и контрольных тканей, использованных в этом исследовании. Мы хотели бы поблагодарить Тину Висновску из Центра биоинформатики Университета Осло за помощь в устранении неполадок, техническую помощь и советы при разработке конвейера. Мы также благодарны Элизабет Ценг из Pacific Biosciences за помощь и плодотворные обсуждения во время разработки нашего пайплайна анализа, а также за разрешение использовать рисунок 1.9. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/process/

Ссылки

Abdelrahman, H., ElHady, M., Alcivar-Warren, A., Allen, S., Al-Tobasei, R., Bao, L., et al. (2017). Геномика аквакультуры, генетика и селекция в Соединенных Штатах: текущее состояние, проблемы и приоритеты для будущих исследований. BMC Genomics 18:191. doi: 10.1186/s12864-017-3557-1

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Аджубей А. А., Власова А. В., Хаген-Ларсен Х., Руден Т. А., Лаэрдал Дж. К. и Хойхайм Б. (2007). Аннотированные теги экспрессированных последовательностей (EST) из атлантического лосося перед смолтом ( Salmo salar ) в доступном для поиска ресурсе данных. BMC Genomics 8:209. doi: 10.1186/1471-2164-8-209

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Аллендорф, Ф. В., и Торгаард, Г. Х. (1984). «Тетраплоидия и эволюция лососевых рыб», в Evolutionary Genetics of Fishes. Монографии по эволюционной биологии, изд. Би Джей Тернер (Бостон, Массачусетс: Springer), 1–53. doi: 10.1007/978-1-4684-4652-4_1

CrossRef Полный текст | Академия Google

Андреассен Р., Луннер С. и Хойхейм Б. (2009). Характеристика вставок полноразмерной секвенированной кДНК (FLIcs) из атлантического лосося ( Salmo salar ). BMC Genomics 10:502. doi: 10.1186/1471-2164-10-502

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Андреассен Р., Луннер С. и Хойхайм Б. (2010). Направленное обнаружение SNP в генах атлантического лосося ( Salmo salar ) с использованием подхода обнаружения SNP с 3’UTR-примированием. BMC Геномика 11:706. doi: 10.1186/1471-2164-11-706

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Андреассен Р. , Волдемариам Н. Т., Эгеланд И. О., Агафонов О., Синдре Х. и Хойхейм Б. (2017). Идентификация дифференциально экспрессируемых микроРНК атлантического лосося, реагирующих на инфекцию альфавирусом лосося (SAV). BMC Genomics 18:349. doi: 10.1186/s12864-017-3741-3

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Эндрюс, С. (2010). FastQC : Инструмент контроля качества для высокопроизводительных данных о последовательностях [онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (по состоянию на 2020 г.)

Google Scholar

Ау, К. Ф., Андервуд, Дж. Г., Ли, Л., и Вонг, У. Х. (2012). Улучшение точности длинных чтений PacBio за счет выравнивания коротких чтений. PLoS One 7:e46679. doi: 10.1371/journal.pone.0046679

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бернхардт, Л. В., Мирмель, М., Лиллехауг, А., Квиллер, Л., и Чиома Вели, С. (2021). Фильтрация, концентрация и обнаружение альфавируса лосося в морской воде во время совместного заражения лосося после смолта ( Salmo salar ). Дис. Аква. Орг. 144, 61–73. doi: 10.3354/dao03572

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

BioBam (2019). OmicsBox — биоинформатика стала проще [онлайн]. Валенсия: биоинформатика BioBam

Google Scholar

Бьорген Х. и Коппанг Э. О. (2021). Анатомия иммунных структур и органов костистых рыб. Иммуногенетика 73, 53–63. doi: 10.1007/s00251-020-01196-0

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Кэмпбелл, М. А., Хейл, М. К., МакКинни, Г. Дж., Николс, К. М., и Пирс, Д. Э. (2019). Долгосрочное сохранение онологов за счет частичной тетрасомии после дупликации всего генома у лососевых. G3 (Бетесда) 9, 2017–2028 гг. doi: 10.1534/g3.119.400070

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Castaño, C. , Berlin, A., Brandström Durling, M., Ihrmark, K., Lindahl, B.D., Stenlid, J., et al. (2020). Оптимизированное метабаркодирование с Pacific biosciences позволяет проводить полуколичественный анализ грибковых сообществ. Новый Фитол. 228, 1149–1158. doi: 10.1111/nph.16731 ​​

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Конеса А., Мадригал П., Тарасона С., Гомес-Кабреро Д., Сервера А., Макферсон А. и др. (2016). Обзор лучших практик анализа данных секвенирования РНК. Геном Биол. 17:13. doi: 10.1186/s13059-016-0881-8

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

ФАО (2018). Состояние мирового рыболовства и аквакультуры, 2018 г. Рим: Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций.

Google Scholar

Фэн С., Сюй М., Лю Ф., Цуй К. и Чжоу Б. (2019). Реконструкция полноразмерного атласа транскриптома с использованием PacBio Iso-seq дает представление об альтернативном сплайсинге в Gossypium australe . BMC Растение Биол. 19:365. doi: 10.1186/s12870-019-1968-7

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Фу Л., Ниу Б., Чжу З., Ву С. и Ли В. (2012). CD-HIT: ускорено для кластеризации данных секвенирования нового поколения. Биоинформатика 28, 3150–3152. doi: 10.1093/bioinformatics/bts565

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Джуффра Э., Таггл С.К. и Консорциум Ф. (2019 г.). Функциональная аннотация геномов животных (FAANG): текущие достижения и дорожная карта. год. Преподобный Аним. Бионауч. 7, 65–88. doi: 10.1146/annurev-animal-020518-114913

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Гордон С. П., Ценг Э., Саламов А., Чжан Дж., Мэн X., Чжао З. и др. (2015). Широко распространенные полицистронные транскрипты у грибов, обнаруженные с помощью секвенирования одиночных молекул мРНК. PLoS One 10:e0132628. doi: 10.1371/journal. pone.0132628

Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Gotz, S., Garcia-Gomez, J.M., Terol, J., Williams, T.D., Nagaraj, S.H., Nueda, M.J., et al. (2008). Высокопроизводительные функциональные аннотации и интеллектуальный анализ данных с пакетом Blast2GO. Рез. нуклеиновых кислот. 36, 3420–3435. doi: 10.1093/nar/gkn176

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хаас Б. и Папаниколау А. (2015). TransDecoder 5.5.0 [Онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki (по состоянию на 2019 г.).)

Google Scholar

Haas, B.J., Papanicolaou, A., Yassour, M., Grabherr, M., Blood, P.D., Bowden, J., et al. (2013). Реконструкция последовательности транскрипта de novo из РНК-seq с использованием платформы trinity для эталонного создания и анализа. Нац. протокол 8, 1494–1512. doi: 10.1038/nprot.2013.084

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хаген-Ларсен Х. , Лэрдал Дж. К., Паниц Ф., Аджубей А. и Хойхейм Б. (2005). Подход, основанный на EST, для идентификации генов, экспрессируемых в кишечнике и жабрах атлантического лосося перед смолтом (9).0496 Салмо Салар ). BMC Genomics 6:171. doi: 10.1186/1471-2164-6-171

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хьельтнес Б., Банг-Йенсен Б., Борнё Г., Хаукаас А. и Вальде К. С. (редакторы) (2019). Состояние здоровья в аквакультуре Норвегии, 2018 г. Осло: Норвежский ветеринарный институт.

Google Scholar

Hoar, WS (1988). 4 физиология неющих лососевых рыб. Физиол. Дев. Рыба живородящая молодь. 11, 275–343. doi: 10.1016/s1546-5098(08)60216-2

CrossRef Full Text | Google Scholar

Хьюстон, Р. Д., и Маккуин, Д. Дж. (2019). Генетика атлантического лосося ( Salmo salarL. ) в 21 веке: скачки вперед в аквакультуре и понимании биологии. Аним. Жене. 50, 3–14. doi: 10.1111/age.12748

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Хабли Р. , Финн Р. Д., Клементс Дж., Эдди С. Р., Джонс Т. А., Бао В. и др. (2016). База данных Dfam семейств повторяющихся ДНК. Рез. нуклеиновых кислот. 44, Д81–Д89. doi: 10.1093/nar/gkv1272

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Куп, Б. Ф., фон Шальбург, К. Р., Леонг, Дж., Уокер, Н., Лиеф, Р., Купер, Г. А., и др. (2008). Геномное исследование EST лососевых: гены, дупликации, филогения и микрочипы. BMC Genomics 9:545. doi: 10.1186/1471-2164-9-545

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ланг Д., Чжан С., Рен П., Лян Ф., Сунь З., Мэн Г. и др. (2020). Сравнение двух современных технологий секвенирования для сборки генома: чтения HiFi системы Pacific Biosciences Sequel II и сверхдлинные чтения Oxford Nanopore. GigaScience 9:giaa123. doi: 10.1093/gigascience/giaa123

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Леонг Дж. С., Янцен С. Г., фон Шальбург К. Р., Купер Г. А., Мессмер А. М., Ляо Н. Ю. и др. (2010). Полноразмерные последовательности кДНК Salmo salar и Esox lucius показывают изменения в эволюционном давлении на геном после тетраплоидизации. BMC Genomics 11:279. doi: 10.1186/1471-2164-11-279

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ли, Х., и Бироль, И. (2018). Minimap2: попарное выравнивание нуклеотидных последовательностей. Биоинформатика 34, 3094–3100. doi: 10.1093/bioinformatics/bty191

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ли В. и Годзик А. (2006). Cd-hit: быстрая программа для кластеризации и сравнения больших наборов последовательностей белков или нуклеотидов. Биоинформатика 22, 1658–1659. doi: 10.1093/bioinformatics/btl158

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лян, М., Рэйли, К., Чжэн, X., Катти, Г., Гогинени, Э., Шерман, Б. Т., и другие. (2016). Различение очень похожих изоформ генов с помощью кластерного биоинформатического анализа длинных чтений одиночных молекул PacBio. Биоданные мин. 9:13. doi: 10.1186/s13040-016-0090-8

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Лиен С., Куп Б. Ф., Сандве С. Р., Миллер Дж. Р., Кент М. П., Ном Т. и др. (2016). Геном атлантического лосося дает представление о редиплоидизации. Природа 533, 200–205. doi: 10.1038/nature17164

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Лю С., Чжан Ю., Чжоу З., Вальдбисер Г., Сунь Ф., Лу Дж. и др. (2012). Эффективная сборка и аннотация транскриптома сома с помощью анализа RNA-Seq удвоенной гаплоидной гомозиготы. BMC Genomics 13:595. doi: 10.1186/1471-2164-13-595

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Лав, М. И., Хубер, В., и Андерс, С. (2014). Модерированная оценка изменения кратности и дисперсии для данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном Биол. 15:550. doi: 10.1186/s13059-014-0550-8

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Маккуин, Д. Дж., и Джонстон, И. А. (2014). Хорошо ограниченная оценка времени дупликации всего генома лососевых выявляет значительное отделение от видовой диверсификации. Проц. биол. науч. 281:20132881. doi: 10.1098/rspb.2013.2881

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Мартин, М. (2011). Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из операций высокопроизводительного секвенирования. EMBnet J. 17:10. doi: 10.14806/ej.17.1.200

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маклафлин, М.Ф., и Грэм, Д.А. (2007). Альфавирусные инфекции у лососевых — обзор. Дж. Фиш Дис. 30, 511–531. doi: 10.1111/j.1365-2761.2007.00848.x

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Наттестад М., Гудвин С., Нг К., Баслан Т., Седлазек Ф.Дж., Решенедер П. и др. (2018). Сложные перестройки и амплификации онкогенов, обнаруженные с помощью секвенирования длинной ДНК и РНК клеточной линии рака молочной железы. Рез. генома. 28, 1126–1135. doi: 10.1101/gr.231100.117

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

NCBI (2015). NCBI Salmo salar Annotation Release 100 Assembly Report [Online]. Доступно в Интернете по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Salmo_salar/100/ (по состоянию на 26 июня 2020 г.)

Google Scholar

Oikonomopoulos, S., Bayega, A., Fahiminiya , С., Джамбазян, Х., Берубе, П., и Рагуссис, Дж. (2020). Методологии профилирования транскриптов с использованием давно читаемых технологий. Фронт. Жене. 11:606. doi: 10.3389/fgene.2020.00606

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

PacBio (2020). IsoSeq v3: Масштабируемое открытие изоформ De Novo [онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: https://github.com/PacificBiosciences/IsoSeq (по состоянию на 2020 г.). , SA (2020). Гибридный подход к секвенированию транскриптома улучшил сборку и аннотацию генов в Cynara cardunculus (L. ). BMC Genomics 21:317. doi: 10.1186/s12864-020-6670-5

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Роадс А. и Ау К. Ф. (2015). Секвенирование PacBio и его приложения. Геном. протеом. биоинф. 13, 278–289. doi: 10.1016/j.gpb.2015.08.002

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Робертс, Р. Дж., Карнейро, М. О., и Шац, М. К. (2013). Преимущества секвенирования SMRT. Геном Биол. 14:405. doi: 10.1186/gb-2013-14-6-405

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Сахрейян С.М.Э., Мохиюддин М., Себра Р., Тилгнер Х., Афшар П.Т., Ау К.Ф. и др. (2017). Получение всестороннего биологического понимания транскриптома путем выполнения анализа секвенирования РНК широкого спектра. Нац. коммун. 8:59. doi: 10.1038/s41467-017-00050-4

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Салмела Л. и Ривалс Э. (2014). LoRDEC: точное и эффективное исправление ошибок длительного чтения. Биоинформатика 30, 3506–3514. doi: 10.1093/bioinformatics/btu538

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Шве А., Остбай Т.К., Краснов А., Рамберг С. и Андреассен Р. (2020). Характеристика дифференциально экспрессируемых миРНК и их предполагаемых транскриптов-мишеней во время смолтификации и адаптации к морской воде в головной почке атлантического лосося. Гены (Базель) 11:1059. doi: 10.3390/genes110

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Смит А., Хабли Р. и Грин П. (2013). RepeatMasker Open-4.0. [Онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: http://repeatmasker.org/ (по состоянию на 2018 г.). и другие. (2015). Смертность и потеря веса атлантического лосося Salmon salar L., экспериментально инфицированного изолятами лососевого альфавируса подтипа 2 и подтипа 3 из Норвегии. Дж. Фиш Дис. 38, 1047–1061. doi: 10.1111/jfd.12312

Резюме PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Tardaguila, M., de la Fuente, L., Marti, C., Pereira, C., Pardo-Palacios, F.J., Del Risco, H., et al. (2018). SQANTI: обширная характеристика последовательностей длинных транскриптов для контроля качества при идентификации и количественном определении полноразмерного транскриптома. Рез. генома. 28, 396–411. doi: 10.1101/gr.222976.117

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Тедерсоо Л., Туминг-Клундеруд А. и Анслан С. (2018). Метабаркодирование PacBio грибов и других эукариот: ошибки, предубеждения и перспективы. Новый Фитол. 217, 1370–1385. doi: 10.1111/nph.14776

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ценг, Э. (2020a). кДНК_Cupcake [онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake (по состоянию на 2020 г.)

Google Scholar

Ценг, Э. (2020b). Cogent: Инструмент реконструкции генома COding [онлайн]. Доступно в Интернете по адресу: https://github.com/Magdoll/Cogent (по состоянию на 2020 г.)

Google Scholar

Ван Ю., Лю Х., Чжэн Д., Ван Ю., Чен Х., Чжао Х. и др. (2019). Систематическая идентификация межгенных длинных некодирующих РНК в сетчатке мыши с использованием полноразмерного секвенирования изоформ. BMC Genomics 20:559. doi: 10.1186/s12864-019-5903-y

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Ван Б., Ценг Э., Регулски М., Кларк Т. А., Хон Т., Цзяо Ю. и др. (2016). Выявление сложности транскриптома кукурузы с помощью долговременного секвенирования одной молекулы. Нац. коммун. 7:11708. doi: 10.1038/ncomms11708

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Волдемариам Н. Т., Агафонов О., Хойхайм Б., Хьюстон Р. Д., Таггарт Дж. Б. и Андреассен Р. (2019). Расширение репертуара микроРНК у атлантического лосося; открытие IsomiRs и микроРНК, высоко экспрессируемых в разных тканях и на разных стадиях развития. Ячейки 8:42. doi: 10.3390/cells8010042

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Волдемариам, Н. Т., Агафонов, О., Синдре, Х., Хойхайм, Б., Хьюстон, Р. Д., Робледо, Д., и др. (2020). миРНК, которые, как предполагается, регулируют пути антивирусных генов хозяина у мальков атлантического лосося, зараженных IPNV, подвержены влиянию вирусной нагрузки и связаны с основными генотипами QTL устойчивости к IPN на поздних стадиях инфекции. Перед. Иммунол. 11:2113. doi: 10.3389/fimmu.2020.02113

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Янез, Дж. М., Хьюстон, Р. Д., и Ньюман, С. (2014). Генетика и геномика устойчивости к болезням у видов лососевых. Фронт. Жене. 5:415. doi: 10.3389/fgene.2014.00415

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Zhang, G., Sun, M., Wang, J., Lei, M., Li, C., Zhao, D., et al. (2019). Полноразмерное секвенирование кДНК PacBio, интегрированное с чтением RNA-seq, значительно улучшает обнаружение транскриптов сплайсинга в рисе. Завод J. 97, 296–305. doi: 10.1111/tpj.14120

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

Жулидов П. А. (2004). Простая нормализация кДНК с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы камчатского краба. Рез. нуклеиновых кислот. 32:e37. doi: 10.1093/nar/gnh031

PubMed Abstract | Полный текст перекрестной ссылки | Google Scholar

ISO 15924 Алфавитный список кодов

Расшифровка транскриптов очень похожих мультигенных семейств из данных Iso-Seq с помощью IsoCon

Введение

Значительная часть генов в геноме человека принадлежит к мультигенным семействам, каждое из которых содержит несколько копий генов, возникших в результате дупликации, т.е. дубликатов генов ^1,2,3,4,5,6 . Многие из этих дубликатов генов связаны с важными фенотипами человека, включая ряд заболеваний ^7,8,9 . В некоторых из таких случаев отдельные копии генов играют различную роль в этиологии заболевания ¹⁰ . Однако аннотация мультигенных семейств остается неполной даже в самой последней сборке человека, особенно из-за неразрешенных сегментных дупликаций с высокой идентичностью последовательностей ^11,12 . Дублированные копии генов из одного и того же семейства различаются по идентичности последовательностей, причем некоторые из них идентичны друг другу. Кроме того, количество копий внутри семей часто различается у разных людей ^1,2,3 . Кроме того, по оценкам, >90% всех мультиэкзонных генов подвергаются альтернативному сплайсингу у людей ^13,14 , а различные дублирующиеся копии генов могут различаться в продуцируемых альтернативно сплайсированных формах (т.е. изоформах).

Эти особенности делают расшифровку сквозных последовательностей транскриптов из дублированных генов и их различных изоформ транскриптов сложной задачей. Количество копий мультигенных семейств можно определить с помощью микрочипов ² , количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) ¹⁵ , капельная цифровая ПЦР ¹⁶ или секвенирование ДНК с использованием Nanostring Technologies ⁸ или платформы Illumina ³ . Последовательности отдельных экзонов, длина которых составляет всего несколько сотен нуклеотидов, могут быть получены из отдельных прочтений данных Illumina DNA или RNA-seq ¹⁷ ; однако повторяющийся характер копий двойных генов усложняет их сборку de novo, а чтения Illumina часто неспособны фазировать варианты по длине полного транскрипта и имеют низкую скорость отзыва в сборках генов с множественными изоформами ^18,19 . Длинные чтения Pacific Biosciences (PacBio) из протокола Iso-Seq обладают потенциалом для преодоления этой проблемы путем последовательного секвенирования множества транскриптов. Этот подход был успешно применен для выявления нескольких сложных структур изоформ, возникающих в результате событий альтернативного сплайсинга, например, у людей, растений и грибов ^18,20,21 . Ни в одном из этих исследований одновременно не рассматривались проблемы расшифровки структуры изоформ и определения копий генов, из которых они произошли.

Несмотря на то, что частота ошибок PacBio снизилась, многие ошибки по-прежнему трудно исправить, и они остаются серьезной проблемой для последующего анализа данных Iso-Seq ^19,22,23 . Это особенно касается транскриптов из семейств генов с высокой идентичностью последовательностей, где трудно выделить ошибки из истинных вариантов. Использование эталонного генома ^{24,25,26,27,28} для коррекции неэффективно в таких ситуациях, когда изменчивость копий гена не может быть надежно зафиксирована эталоном. ЛЕД ¹⁸ , часть биоинформатического конвейера PacBio для обработки данных Iso-Seq, является стандартным инструментом, используемым для исправления ошибок секвенирования без использования эталона. Хотя ICE использовался в нескольких проектах ^29,30 , было показано, что он генерирует большое количество избыточных расшифровок ^18,21,31 . Более того, ICE «в настоящее время не настроен для работы по дифференциации очень сложных семейств генов от полиплоидных видов, где различия в основном основаны на SNP». ³² . Альтернативный подход — использовать считывания Illumina для исправления ошибок в считываниях PacBio ^25,26,28,33 — также неспособен исправить большинство ошибок (как мы демонстрируем в этой статье) и также имеет смещение из-за низкой глубины считывания Illumina в GC. богатые регионы ³⁴ .

Были предложены некоторые подходы для исправления ошибок чтения PacBio из транскриптов с высокой идентичностью последовательностей, но ни один из них не применим в широком смысле для определения последовательностей из мультигенных семейств с высокой идентичностью последовательностей без опоры на эталонный геном. Классификация ³⁵ или конструирование ³⁶ аллель-специфических транскриптов с Iso-Seq были описаны, но эти подходы требуют ссылки и могут разделять только два аллеля одного гена. Подходы к генотипированию для мультигенных семейств также были предложены ^37,38 , но они требуют предварительного знания последовательностей изоформ. Подход de novo для кластеризации очень похожих изоформ описан в ref. ³⁹ , но реализация не предусмотрена. Проблема также связана с вирусной фазой 9.0058 40 , но методы, разработанные там, не применимы напрямую к мультигенным семьям.

Еще одним соображением является относительно высокая стоимость PacBio. Количество прочтений, необходимых для восстановления семейств генов, экспрессия которых затмевается суперраспространенными классами мРНК, может быть непомерно высокой. Подход к целевому секвенированию может быть эффективным для сокращения необходимого объема секвенирования, когда пары праймеров ОТ-ПЦР предназначены для извлечения транскриптов интересующего семейства генов ⁴¹ . Этот подход приводит к достаточно высокой глубине секвенирования, чтобы захватить большинство расшифровок и выполнить последующую коррекцию ошибок.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разрабатываем IsoCon, алгоритм de novo для исправления ошибок и устранения избыточности считываний циклической согласованной последовательности (CCS) PacBio, созданных в результате целевого секвенирования с помощью протокола Iso-Seq. Наш алгоритм позволяет расшифровывать последовательности изоформ вплоть до уровня нуклеотидов и выдвигать гипотезы о том, как они относятся к отдельным, очень похожим копиям генов мультигенных семейств. IsoCon использует осторожный итеративный процесс для исправления очевидных ошибок без чрезмерного исправления редких вариантов. Его статистическая структура предназначена для использования возможностей длинных чтений для связывания вариантов в расшифровке. Кроме того, IsoCon статистически учитывает большую изменчивость качества чтения, которая имеет тенденцию к снижению по мере увеличения длины стенограммы. Используя смоделированные данные, мы демонстрируем, что IsoCon имеет значительно более высокую точность и полноту, чем ICE 9.0058 18 в широком диапазоне глубины секвенирования, а также длин транскриптов, сходств и уровней распространенности.

Мы применяем IsoCon для изучения семейств ампликонных генов Y-хромосомы, где невозможность изучения отдельных копий генов и их соответствующих транскриптов ограничила наше понимание эволюции Y-хромосомы приматов и причин нарушений мужского бесплодия, для которых эти гены имеют решающее значение ^42,43,44,45 . Семейства ампликонных генов Y-хромосомы представляют собой особенно интересный и сложный случай для расшифровки, поскольку каждое из них содержит несколько почти идентичных (до 99,99%) копий ^46,47 с потенциально различным числом изоформ. Мы используем целенаправленный дизайн для выделения и секвенирования транскриптов всех девяти семейств ампликонических генов Y-хромосомы из яичек двух мужчин. Наша проверка показывает, что IsoCon значительно повышает точность по сравнению с исправлением ошибок на основе ICE и Illumina с proovread ⁴⁸ и имеет значительно более высокую полноту, чем ICE. Мы показываем, что IsoCon может обнаруживать редкие транскрипты, которые отличаются всего на одну пару оснований от доминирующих изоформ, которые имеют на два порядка большее количество. Используя предсказанные IsoCon транскрипты, мы можем зафиксировать беспрецедентное количество изоформ, отсутствующих в существующих базах данных. Кроме того, мы можем разделить транскрипты на предполагаемые копии генов и получить специфичные для копии последовательности экзонов и варианты сплайсинга.

Чтобы продемонстрировать более широкую применимость IsoCon, мы также запустили его на общедоступном наборе данных целевого секвенирования Iso-Seq гена FMR1 ⁴⁹ . FMR1 является членом семейства генов, связанных с ломкой Х-хромосомой, и отвечает за развитие как синдрома ломкой Х-хромосомы, так и синдрома тремора/атаксии, ассоциированного с ломкой Х-хромосомой, нейродегенеративного расстройства, возникающего у взрослых. FMR1 подвергается обширному альтернативному сплайсингу, который был предметом нескольких исследований ⁴⁹ . Используя IsoCon, мы можем восстановить больше изоформ, чем ICE, и найти новые кандидаты на сплайс-соединения. Наши результаты показывают, что разница в количестве изоформ между носителями и контролем не так велика, как сообщалось ранее в ref. ⁴⁹ .

Результаты

Моделированные данные

Мы создали синтетические семейства генов, используя три эталонных гена в качестве исходной последовательности для нашего моделирования: TSPY , HSFY и ДАЗ . Мы выбрали их, потому что они отражают спектр длины, числа экзонов и сложности, характерный для семейств ампликоновых генов Y (таблица 1). DAZ представляет собой наиболее сложный случай, так как он имеет сильно повторяющуюся экзонную структуру ⁵⁰ . Длина гена также важна, поскольку более длинные транскрипты приводят к меньшему количеству проходов полимеразы во время секвенирования и, следовательно, к более высокой частоте ошибок чтения CCS. Мы смоделировали уровни покрытия в диапазоне, согласующемся с тем, что мы наблюдали в реальных данных.

Полноразмерная таблица

Наше основное моделирование было сосредоточено на двух сценариях. Первый (рис. 1) отражает типичный биологический сценарий. Для каждого из трех семейств генов мы моделировали несколько копий гена и для каждой копии моделировали различные изоформы, пропуская разные экзоны. В каждом семействе было всего 30 смоделированных изоформ, абсолютная распространенность которых была определена случайным образом из значений 2 ⁱ , i ∈[1,8], что приводит к относительной численности от 0,1% до 15%. Мы генерируем три таких набора данных, варьируя частоту мутаций, используемую для создания дублирующихся копий генов. (Обратите внимание, что здесь для простоты мы моделируем только мутацию, хотя известно, что другие процессы, например конверсия генов, влияют на эволюцию дубликатов копий генов ⁵¹ .) Второе моделирование (дополнительный рисунок 1) похоже на первое, но , чтобы отделить эффект мутации от эффекта пропуска экзона, мы не моделируем изоформы. Для каждого семейства генов было смоделировано в общей сложности восемь копий генов и восемь транскриптов (по одному на копию гена) с различной идентичностью последовательностей (дополнительный рисунок 2) и с относительным содержанием в диапазоне от 0,4% до 50%. Мы также повторили эти два моделирования, но сохранили постоянное содержание изоформ (дополнительные рисунки 3 и 4). Полное описание нашей симуляции см. в дополнительном примечании 2.

Полнота и точность для транскриптов с разной экзонной структурой и неодинаковой долей. Скрипичные графики, показывающие отзыв ( a ) и точность ( b ) IsoCon и ICE. На каждой панели строки соответствуют разным семействам и, следовательно, разным частотам ошибок. Самое короткое семейство генов ( TSPY , помеченное по имени копии референсного гена, использованной для его создания, TSPY13P ) с соответственно более низким уровнем ошибок чтения показано в верхних строках панели, в то время как самое длинное семейство генов ( DAZ , обозначенный как DAZ2 ), с соответственно более высоким уровнем ошибок чтения, показан в нижних строках. Столбцы соответствуют разным частотам мутаций ( μ ), используемым при моделировании копий генов (см. Дополнительное примечание 2). Более низкая частота мутаций означает большее количество одинаковых копий генов. На каждом графике показаны результаты для 30 изоформ со случайным распределением содержания в диапазоне от 0,1% до 15%. На каждом графике ось x соответствует количеству смоделированных считываний, а y — ось показывает полноту/точность методов. Каждая скрипка создается с использованием 10 смоделированных повторов секвенирования. Белая точка показывает медиану, толстая черная линия — межквартильный размах (средние 50%), более тонкая черная линия — 95% доверительный интервал, а цветная область — график плотности. Мы отмечаем, что график плотности обрезается в самых крайних точках данных

Полноразмерное изображение

Точность IsoCon увеличивается с увеличением глубины чтения, даже когда средняя глубина чтения на расшифровку достигает 1562x (дополнительный рисунок 1). Такой надежности часто трудно достичь, потому что увеличение охвата сверх того, что необходимо для отзыва, только увеличит количество ошибок в данных. Отзыв зависит от частоты ошибок, на которую влияет длина гена. Для TSPY , при равных показателях численности отзыв становится идеальным при 17-кратном охвате, в то время как для DAZ отзыв достигает> 90% только при 410-кратном охвате (дополнительный рисунок 3). Мы ожидаем, что точность также будет зависеть от сходства копий гена, т. е. семейство генов, которое создается с использованием низкой скорости мутаций, тем самым производя меньше вариантов между копиями гена, может негативно повлиять на способность IsoCon разделять транскрипты. Несколько удивительно, но точность в этих случаях снижается лишь незначительно, а глубина считывания оказывает гораздо более существенное влияние на точность, чем частота мутаций или длина гена.

Наши эксперименты ясно показывают, что припоминание IsoCon сильно зависит от глубины чтения. Мы исследовали это более подробно, взяв каждый транскрипт, смоделированный как часть экспериментов на дополнительном рисунке 1. Мы показываем (рис. 2), захватывал ли IsoCon транскрипт в зависимости от глубины секвенирования (т. Е. Общее количество прочтений) его соответствующий эксперимент и его собственная глубина секвенирования (т.е. количество прочтений, которые были секвенированы из изоформы). Для TSPY , IsoCon фиксирует большинство транскриптов с глубиной >3, в то время как это число составляет ~10 для HSFY . Скорость мутации играет лишь незначительную роль по сравнению с глубиной транскрипта, поскольку большинство кандидатов с меньшей глубиной чтения теряются на этапе исправления ошибок (рис. 2). Мы также наблюдаем, что для DAZ минимальная глубина транскрипта, необходимая для захвата изоформы, увеличивается по мере увеличения общей глубины секвенирования, предполагая, что относительное количество транскриптов также является фактором. Вероятно, это связано с тем, что матрица множественного выравнивания становится все более шумной (особенно для DAZ ), поскольку количество последовательностей растет, что негативно влияет как на исправление ошибок, так и на расчет поддержки в статистическом тесте.

Возможности IsoCon для записи расшифровок. Каждая изоформа из экспериментов на дополнительном рисунке 1 (включая 10 смоделированных повторов) соответствует маркеру на этом графике, который отмечен в зависимости от того, был ли он захвачен и выведен как окончательный прогноз (зеленый), полученный на этапе исправления ошибок, но отфильтрованный. отсутствует на статистическом шаге (синий) или вообще не производится на этапе коррекции (красный) с помощью IsoCon. Это полоса, созданная с помощью пакета Seaborn 9.0058 64 , который представляет собой особый тип точечной диаграммы, где ось x является категориальной (общее количество прочтений соответствующего эксперимента), а точки распределены по горизонтали. Ось y показывает количество прочтений, секвенированных из изоформы, в логарифмической шкале. Изоформы, у которых нет прочтений, не показаны

Полноразмерное изображение

Мы также наблюдаем, что IsoCon превосходит ICE как по точности, так и по полноте (рис. 1, дополнительные рисунки 1, 3–5). ICE имеет низкую точность, которая снижается с увеличением глубины чтения. Например, при глубине чтения 500 и выше точность ICE близка к 0 во всех наших экспериментах. С другой стороны, точность IsoCon всегда >80% при глубине считывания 500 и выше. IsoCon также имеет более высокий отзыв почти во всех случаях для HSFY и DAZ . Что касается TSPY , преимущество отзыва колеблется между двумя алгоритмами, но в целом довольно похоже. Дальнейшее исследование производительности IsoCon подробно описано в дополнительном примечании 3.

Данные из двух образцов семенников человека

Мы получили данные целевого секвенирования транскриптов RT-PCR для девяти семейств ампликоновых генов для двух образцов семенников мужчин, используя протокол Iso-Seq от PacBio. (Дополнительный рисунок 6 показывает количество проходов за чтение) и отдельно с использованием технологии секвенирования Illumina. Затем мы использовали конвейер ToFU 9.0058 18 , чтобы отфильтровать любые считывания PacBio CCS, которые либо были химерными, либо не охватывали весь транскрипт от конца до конца. Полученный набор мы называем исходным (CCS) чтением. Для сравнения мы запустили IsoCon и ICE ¹⁸ при чтении CCS. Мы также оценили инструмент proovread ⁴⁸ , который использует чтения Illumina для исправления показаний CCS (называемых Illumina-скорректированными чтениями CCS). Дополнительное примечание 4 содержит подробные сведения о том, как эти инструменты запускались. Мы сравнили результаты трех подходов, а также подхода с использованием только исходных считываний CCS. В таблице 2 показано количество сгенерированных прочтений и количество транскриптов, вызванных каждым из этих четырех различных подходов.

Полноразмерная таблица

Валидация

Для проверки IsoCon и сравнения его точности с другими методами мы использовали (1) показания Illumina, (2) внутреннюю согласованность между образцами и (3) соответствие с базой данных эталонных транскриптов.

Мы подтвердили точность на уровне нуклеотидов показаний IsoCon, ICE, CCS с поправкой на Illumina и исходных показаний с помощью данных Illumina, полученных для тех же двух человек. Во всех положениях в предсказанных транскриптах мы классифицировали положение как поддерживаемое, если оно имело по крайней мере два прочтения Illumina, совпадающих с ним по тому же нуклеотиду, что и транскрипт. Поскольку глубина секвенирования Illumina была на несколько порядков выше, чем у PacBio (таблица 2), мы ожидаем, что будет поддерживаться большинство правильных позиций. Обратите внимание, что отсутствие поддержки Illumina не всегда указывает на ошибку, поскольку смещение Illumina GC приведет к тому, что некоторые регионы не секвенируются. Однако мы ожидаем, что количество ошибок расшифровки будет коррелировать с количеством неподдерживаемых позиций. На рис. 3 показаны проценты поддерживаемых нуклеотидов для каждого подхода. В среднем 9Поддерживается 9% позиций транскриптов IsoCon, но поддерживаются только 93% позиций транскриптов ICE. Точно так же поддерживаются 96% скорректированных Illumina позиций чтения и 79% исходных позиций чтения. Кроме того, 70% расшифровок IsoCon полностью поддерживаются (т. е. в каждой отдельной позиции) Illumina, по сравнению с 2% для ICE, 15% для прочтений, скорректированных Illumina, и 20% для нескорректированных прочтений.

Illumina-поддержка предсказанных транскриптов. Гистограмма показывает процентное соотношение позиций в IsoCon/ICE/корректном чтении и исходных считываниях CCS flnc, которые поддерживаются как минимум двумя выравниваниями Illumina с одним и тем же нуклеотидом

Полноразмерное изображение

Хотя мы ожидаем некоторую изменчивость в транскриптах, присутствующих в двух образцах, мы также ожидаем, что большая их часть будет общей. IsoCon обнаружил 121 транскрипт, который присутствует в обоих образцах, что соответствует 32% общего количества транскриптов (в среднем между двумя образцами; дополнительная фигура 7). Чтения CCS, скорректированные Illumina, разделяют 11%, в то время как и ICE, и исходные чтения разделяют менее 2%. Вероятно, это указывает на более высокую точность IsoCon по сравнению с другими методами.

IsoCon также лучше справился с восстановлением известных расшифровок Ensembl. Мы загрузили аннотированные кодирующие последовательности девяти семейств ампликонических генов Y-хромосомы из базы данных Ensembl ⁵² , содержащую 61 уникальный транскрипт после удаления избыточности (см. Дополнительное примечание 5). Затем мы идентифицировали стенограммы базы данных, которые полностью соответствовали предсказанным стенограммам. У IsoCon было 21 совпадение с Ensembl, в то время как у ICE было только восемь (включая совпадения IsoCon; рис. 4). IsoCon также имел больше совпадений с базой данных, чем исходные чтения, несмотря на уменьшение количества последовательностей в> 29 раз.(Таблица 2). CCS-прочтения с поправкой Illumina в целом имели на одно точное совпадение больше, чем IsoCon, но имели более чем в 14 раз больше предсказанных транскриптов IsoCon, что свидетельствует о низкой точности.

Способность методов фиксировать эталонные кодирующие белок транскрипты в базе данных ENSEMBL. Цифры в скобках рядом с названием семейства генов на оси x указывают количество уникальных транскриптов в базе данных. Кодирующие последовательности отсутствуют для XKRY

Полноразмерное изображение

Мы также исследовали точность транскриптов IsoCon, которые имели более высокие значения p значимости, и обнаружили, что, хотя точность немного снизилась по сравнению с транскриптами с более низкими значениями p , она все же остается значительно выше, чем Чтения CCS с поправкой на ICE или Illumina (дополнительное примечание 5).

Разнообразие изоформ

Для изучения транскриптов, обнаруженных IsoCon, мы сначала отфильтровали транскрипты, обнаруженные только в одном образце. Хотя мы ожидаем изменчивости между двумя людьми, такие транскрипты также могут быть ложноположительными, возникающими из-за ошибок ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) ⁵³ . Эти ошибки, если они присутствуют, были введены до создания библиотеки и могут быть обнаружены как при чтении Iso-Seq, так и при чтении Illumina. Они приведут к уникальным последовательностям, которые будут имитировать настоящие транскрипты как в данных Iso-Seq, так и в данных Illumina. В нашем последующем анализе используется только 121 транскрипт, который был одинаково предсказан IsoCon в обоих образцах. Это устраняет любые ошибки ОТ-ПЦР, присутствующие только в одном образце, и уменьшает количество ложноположительных транскриптов из-за неисправленных ошибок секвенирования. В таблице 3 показано количество общих транскриптов, разделенных на семейства генов. Однако мы отмечаем, что истинное количество транскриптов в образце может быть выше из-за специфичных для образца вариантов, которые мы отбросили. Далее мы классифицировали каждый транскрипт как белок-кодирующий или некодирующий в зависимости от того, находится ли он в кадре или вне кадра с эталонными транскриптами человека (подробности см. в Дополнительном примечании 5). Мы обнаружили, что 72 из 121 транскрипта являются кодирующими, а пять из девяти семей содержат в общей сложности 49 транскриптов.некодирующие транскрипты (таблица 3), остальные четыре семейства имеют только кодирующие транскрипты. Мы также обнаружили, что 94 из 121 транскрипта не были известны ранее (таблица 3), т. е. не имели 100% совпадения, охватывающего весь транскрипт, при сопоставлении с базой данных неизбыточных нуклеотидов NCBI ( nr / nt ). Множественное выравнивание для транскриптов IsoCon RBMY — семейства с наиболее предсказанными транскриптами — показано на рис. 5.

Таблица 3 Прогнозируемые IsoCon транскрипты девяти семейств ампликоновых генов. В столбцах показаны прогнозы, общие для образцов, разделенные семейством генов и классифицированные как кодирующие или некодирующие. Показано рассчитанное количество групп в сравнении с известными числами копий из эталонного генома и наблюдаемыми в популяциях человека. Новые транскрипты — это те, которые не имеют идеального соответствия справочной базе данных транскриптов NCBI, числа в скобках указывают дополнительные транскрипты, которые имеют идеальное соответствие только с EST, синтетическими конструкциями или транскриптами, предсказанными in silico

Полноразмерная таблица

Иллюстрация взаимосвязи между 61 транскриптом RBMY, предсказанным IsoCon и общим для обоих образцов. Транскрипты пронумерованы от 1 до 61. В левой части рисунка используется IGV ^65,66 для визуализации множественного выравнивания транскриптов. Закрашенные позиции — это позиции с изменчивостью в транскриптах, тогда как серые области обозначают консервативные позиции. Удаления показаны горизонтальной линией с номером, указывающим их длину. Правая часть рисунка иллюстрирует взаимосвязь между 61 стенограммой в виде графика. Вершины являются транскриптами (помечены их индексами). Вершина выделена жирным шрифтом, если предполагается, что она кодирует белок. Ребро между двумя транскриптами означает, что они являются потенциальными изоформами из одной и той же копии гена, т. е. у них есть различия только в наличии/отсутствии экзонов. Чтобы упростить визуализацию, некоторые вершины окружены прямоугольниками, а двойное ребро между двумя прямоугольниками указывает на то, что все пары транскриптов между двумя прямоугольниками являются потенциальными изоформами из одной и той же копии гена. Каждая максимальная клика (т. е. группа вершин), состоящая из более чем четырех вершин, показана в виде цветного круга. Цвета кружков соответствуют строкам множественного выравнивания, отмеченным вертикальной чертой того же цвета. Максимальную клику следует интерпретировать как все транскрипты, которые потенциально происходят из одной и той же копии гена 9.0003

Полноразмерное изображение

IsoCon чувствителен к небольшим вариациям и вариациям с низким содержанием

IsoCon смог обнаружить несколько транскриптов даже в присутствии изоформы с гораздо более высоким содержанием, которые отличались всего на 1–3  п. н. Например, один транскрипт RBMY , извлеченный IsoCon в образце 2, поддерживался только пятью прочтениями и отличался только одним нуклеотидом от транскрипта, который поддерживался 863 прочтениями. Второй пример — еще один IsoCon RBMY 9.0497, который поддерживался только пятью прочтениями в образце 2 и отличался только одним нуклеотидом от транскрипта, который поддерживался 306 прочтениями. Оба этих транскрипта с более низким содержанием были получены в обоих образцах (поддержка этих транскриптов в образце 1 составляла 10 и 9 прочтений соответственно), имели идеальную поддержку Illumina и кодировали белок. Ни один из них не был обнаружен ICE или представлен без ошибок в исходных чтениях; однако оба они также были получены в считываниях CCS, скорректированных Illumina. На рис. 5 показаны эти два транскрипта с меньшей распространенностью, обозначенные цифрами 3 и 1 соответственно.

Разделение транскриптов на копии генов

Семейство генов состоит из копий генов, каждая из которых может образовывать несколько изоформ в результате альтернативного сплайсинга. В таких случаях транскрипты будут выравниваться друг с другом с большими вставками/делециями (из-за отсутствия экзонов), но без замен. Мы определяем минимальное количество групп (т. е. кластеров), необходимых для того, чтобы каждый транскрипт можно было отнести по крайней мере к одной группе, а каждая пара транскриптов в одной и той же группе отличалась только большими вставками/делециями (подробности см. в дополнительном примечании 5). . Мы называем это количеством групп, которое является нашей наилучшей оценкой количества копий, то есть размера каждого семейства генов. Обратите внимание, что аллель-специфические транскрипты не существуют для семейств ампликонных генов Y из-за гаплоидной природы Y-хромосомы. Мы также определяем количество групп кодирования, то есть количество групп, рассчитанное только из транскриптов кодирования. Группа соответствует понятию максимальной клики из теории графов ⁵⁴ , а поскольку количество расшифровок относительно невелико, количество групп можно вычислить с помощью алгоритма грубой силы (дополнительное примечание 5).

Количество групп для девяти различных семейств показано в таблице 3, а на рис. 5 показано представление о группах на примере семейства RBMY . Важное различие между группой и копией гена заключается в том, что транскрипт может принадлежать нескольким группам. Это происходит, если экзон, содержащий вариант, разделяющий две копии гена, пропускается в процессе сплайсинга. В таком случае мы не можем определить, из какой копии происходит стенограмма, и наш подход помещает ее в обе группы. Таким образом, размер каждой группы является оценкой сверху количества изоформ, происходящих из каждой копии гена.

Мы отмечаем, что истинное количество копий в семействе генов может быть выше или ниже количества групп, определенных IsoCon, по нескольким причинам. Во-первых, невозможно разделить транскрипты, происходящие от копий с идентичными экзонными последовательностями. В результате мы можем недооценить истинное количество копий. Во-вторых, число копий может отличаться у двух проанализированных самцов ⁵⁵ . Поскольку мы исключаем транскрипты, уникальные для каждого самца, мы можем недооценить истинное количество копий. Кроме того, количество копий для семейства генов может быть одинаковым у двух мужчин, но некоторые из копий могут иметь разные последовательности. В-третьих, могут быть копии, которые биологически различаются только наличием/отсутствием экзонов или другими большими вставками — если нет замен, полученные транскрипты будут сгруппированы вместе и будут рассматриваться как происходящие из одной и той же копии гена в соответствии с нашим подходом. Поскольку большинство ампликонических генов Y-хромосомы человека были образованы путем дупликации целой области ⁵⁶ , такая ситуация не должна быть распространена. Тем не менее, если бы он присутствовал, это занижало бы количество копий. В-четвертых, редактирование РНК может генерировать транскрипты, имеющие замены, но происходящие из одной и той же копии, что приводит к переоценке истинного числа копий. В-пятых, наш подход к групповым транскриптам основан на точности выравнивания транскриптов, которые иногда могут быть неточными при наличии повторов. В-шестых, наш подход иногда помещает транскрипт более чем в одну группу (как описано выше) и, следовательно, может завышать количество изоформ, происходящих из каждой копии гена. Учитывая эти предостережения, мы, тем не менее, ожидаем, что количество групп будет полезным показателем размера генного семейства.

Мы сравнили наше количество кодирующих групп с количеством копий, аннотированных на Y-хромосоме в эталонном геноме человека (GRCh48/hg38), и наблюдалось в предыдущих исследованиях вариаций ДНК в человеческих популяциях (таблица 3). Для одного из семейств генов ( HSFY ) мы не обнаружили общих транскриптов между людьми. Для четырех семейств генов ( CDY , DAZ , RBMY и TSPY ) количество кодирующих групп находится в пределах ранее наблюдаемого диапазона на основе анализа ДНК в популяциях человека (таблица 3). Для оставшихся четырех семейств генов ( BPY , PRY , VCY и XKRY ), количество кодирующих групп меньше, чем количество копий, указанное в предыдущих исследованиях. Три из этих семей — BPY, VCY и XKRY— имели только один кодирующий транскрипт, общий для двух образцов. Таким образом, в целом количество кодирующих групп является консервативной оценкой количества копий генов на семейство ампликоновых генов.

Новые варианты сплайсинга

Для 121 предсказания IsoCon, которые были разделены между образцами, 38 транскриптов указывали на новые вариации в координатах начала интрон-экзон (дополнительная таблица 1, подробности анализа в дополнительном примечании 4). Это включает 21 расшифровку «новый в каталоге» (определено в ссылке 9).0058 57 как «содержащие новые комбинации ранее известных сплайс-соединений или новых сплайс-соединений, образованных из уже аннотированных доноров и акцепторов»), и 17 транскриптов, содержащих по крайней мере одно сплайс-соединение, которое не совпадало с каким-либо известным сплайс-соединением (соответствующим либо новое соединение сплайсинга или к копии гена, не представленной на hg19). Все 21 новые в каталоге транскрипты имели сильную поддержку Illumina (по крайней мере, четыре высококачественных полноразмерных выравнивания Illumina) через соединения сплайсов и выровнены по hg19.без замен или вставок вблизи стыков (что дает нам уверенность в выравнивании вблизи стыков). Из остальных 17 транскриптов 15 имели сильную поддержку Illumina в отношении потенциально новых соединений сплайсинга.

Некоторые транскрипты отличались друг от друга только небольшими внутриэкзонными мутациями, но не паттерном сплайсинга. Таким образом, 38 транскриптов соответствуют 25 уникальным новым паттернам сплайсинга, из которых 13 представляют новые паттерны сплайсинга в каталоге. Из 25 10 кодируют, а 15 не кодируют (таблица 3).

Данные из

Затем мы идентифицируем кандидатов с p _i выше порога значимости α . Это α является параметром нашего алгоритма, установленным по умолчанию на 0,01. Затем эти кандидаты удаляются из набора кандидатов 9.0496 С . Учитывая параметр τ , если имеется более τ кандидатов со значением значимости выше α , мы удаляем только τ лучших кандидатов с самыми высокими значениями. Затем выполняется этап фильтрации кандидатов алгоритма: мы снова назначаем чтения кандидатам и идентифицируем кандидатов с недостаточной поддержкой в ​​соответствии с нашей проверкой гипотезы. Алгоритм останавливается, когда больше нет кандидатов с p _i выше α . Псевдокод для этого алгоритма вместе со всем IsoCon приведен на дополнительном рисунке 9. и X _d , которые были присвоены им. Мы используем \(x_i \in X_c \cup X_d\) для обозначения каждого чтения, и пусть n будет количеством чтений в \(X_c \cup X_d\). Мы вычисляем попарные выравнивания от \(X_c \cup X_d \cup \{c\}\) до д . Затем мы строим матрицу множественного выравнивания A из этих попарных выравниваний так же, как и на этапе коррекции (подробности см. в Дополнительном примечании 1). Каждая запись в A соответствует либо нуклеотиду, либо пробелу. Пусть V будет индексом столбцов A , где c и d не совпадают. Мы называем эти позиции вариантными позициями.

Лет А _i,j обозначают символ в столбце j строки i строки A . Строки \(1 \le i \le n\) соответствуют чтениям x _i , а строка n  + 1 соответствует c . Для \(1 \le i \le n\) мы определяем двоичную переменную S _i , которая равна 1 тогда и только тогда, когда n +1, j для всех j ∈ V . То есть, S _I IS 1, если и только тогда, когда прочитал x _I , поддерживает все варианты V , I.E. E. Share As C V , I.E. E. Share As C V , т.е. А . Мы делаем следующие предположения:

1. 1.

   d , действующая в качестве эталонной последовательности в этом тесте, не содержит ошибок.

2. 2.

   Нуклеотид в прочтении в позиции, которой нет в V и отличается от соответствующего нуклеотида в d , вызван ошибкой секвенирования. Другими словами, в положении, когда c и d совпадают, они не могут быть оба неправильными.

3. 3.

   Вероятности ошибки в двух разных позициях чтения независимы.

4. 4.

   S _i и \(S_{i\prime}\) являются независимыми случайными величинами для всех \(i \ne i\prime\).

Наша нулевая гипотеза состоит в том, что вариантные позиции в A возникают из-за ошибок последовательности в X . Чтобы получить распределение S _i в соответствии с нулевой гипотезой, нам сначала нужна вероятность, обозначаемая p _ij , что позиция j при чтении i соответствует i . ошибка. В значительной степени это можно получить из оценок качества Phred в чтении (подробности см. в Дополнительном примечании 1). При предположении 3 имеем, что S _i следует распределению Бернулли со средним значением \(p_i = \mathop {\prod}\limits_{j \in V} {p_{ij}}\).

Релевантная тестовая статистика при нулевой гипотезе — это количество, которое моделирует силу (или значимость) поддержки вариантов V . Мы хотели бы подсчитывать только чтения, которые полностью поддерживают все варианты, т. е. чтения x _i с s _i  = 1( s

7 7 9533 i обозначает наблюдаемое значение S _i ). Эти чтения могут иметь ошибки в невариантных местоположениях, но в вариантных местоположениях они должны согласовываться с c . Для каждого такого прочтения мы хотели бы взвесить его вклад обратной величиной вероятности того, что все символы в различных местоположениях вызваны ошибками последовательности. Интуитивно, чтение с высоким базовым качеством должно считаться большим доказательством, чем чтение с низким базовым качеством. Принимая во внимание эти соображения, мы определяем нашу тестовую статистику как 9{с_{я}}}}\)

Обратите внимание, что p _i уменьшается с количеством вариантов в V и с более высокими базовыми показателями качества; следовательно, \(T\) предназначен для использования связанных вариантов в расшифровке, в том смысле, что требуется меньше чтений для поддержки расшифровки, когда расшифровка имеет больше вариантов. Более того, \(p_i\) уменьшается для прочтений с более высоким базовым качеством CCS в вариантных позициях, что означает, что для поддержки транскрипта требуется меньше прочтений, если они имеют более высокое качество. Мы заметили, что значения качества оснований в CCS сильно варьируют и зависят от (i) количества проходов в прочтении CCS, (ii) длины мононуклеотида и (iii) секвенированного основания, с C и G имеющие более низкие качества, связанные с ними (дополнительный рис. 10)

Пусть \(t\) будет наблюдаемым значением этой статистики, и мы будем называть его взвешенной поддержкой. Учитывая \(t\), мы вычисляем значение значимости как \(P(T \ge t)\). Мы используем односторонний тест, поскольку нас интересуют только значения значимости равной или более взвешенной поддержки для \(V\). Нам неизвестно о закрытой форме распределения \(T\) при нулевой гипотезе, и грубый подход к вычислению \(P(T \ge t)\) был бы невозможен. Однако мы можем воспользоваться следующей теоремой из ref. 9п {\ гидроразрыва {{p_i \ log \, p_i}} {{\ mathop {{{\ mathrm {max}}}} \ limits_k \ left ({ — \ log \, p_k} \ right)}}} \)

Обратите внимание, что при этом преобразовании \(P\left( {T\prime \ge t\prime } \right) = P\left( {T \ge t} \right)\), поскольку логарифмическая функция строго монотонно, а нормализация с использованием максимума постоянна. \mu \)

Мы используем эту верхнюю границу в качестве значения значимости. Обратите внимание, что теорема применима только для \(\delta > 0\). Если \(t\prime \le \mu \), то это не так. Однако это означает, что наблюдаемая взвешенная поддержка ниже ожидаемой поддержки в соответствии с нулевой гипотезой. Такие значения явно незначительны, и наше программное обеспечение по умолчанию использует значение 0,5. Транскрипты-кандидаты, которые имеют более порогового значения вариантов позиций (по умолчанию 10) по сравнению со всеми другими транскриптами-кандидатами, статистически не оцениваются, поскольку их p -значение будет близко к 0.

Отношение к ICE

IsoCon, как и ICE, использует итеративный кластерный и консенсусный подход, но эти два алгоритма имеют фундаментальные различия. После кластеризации IsoCon получает взвешенный консенсус на основе профиля ошибок в разделе и использует его в качестве информации для исправления ошибок чтения; ICE, с другой стороны, получает консенсус кластера, используя автономный вызывающий консенсус DAGCON ⁶² , который будет использоваться в следующей итерации без исправления ошибок чтения. IsoCon и ICE также различаются графами, которые они используют для моделирования отношений между последовательностями, и алгоритмом разделения графа на кластеры. IsoCon детерминистически создает кластеры, моделируемые как задача обхода пути, в то время как ICE моделирует кластер как максимальную клику и использует недетерминированный аппроксимативный алгоритм максимальной клики. Возможно, наиболее важно то, что IsoCon, в отличие от ICE, включает в себя статистическую структуру, которая позволяет отличать ошибки от истинных вариантов с более высокой точностью.

Экспериментальные методы

Поли(А) РНК была выделена из РНК семенников двух мужчин европеоидной расы (идентификаторы: CR560016, возраст 59 лет, образец 1; CR561118, возраст 79 лет, образец 2; Origene) с использованием набора Poly(A) Purist MAG ( Термо Фишер Сайентифик). 50 нг поли(А) РНК на каждый образец вместе с 1 мкг контрольной тотальной РНК печени (использовали для контроля) использовали для создания двухцепочечной ДНК с использованием набора для синтеза кДНК SMARTer PCR (Clontech). Была проведена оптимизация цикла ПЦР реакции амплификации кДНК с использованием праймера Clontech, и было определено, что 12 циклов являются оптимальными для крупномасштабной ПЦР-амплификации. Для каждого из девяти семейств ампликоновых генов мы разработали пару праймеров для ОТ-ПЦР, причем один праймер расположен в первом, а другой — в последнем кодирующем экзоне (дополнительная таблица 4). Для одного из этих семейств генов ( CDY ), была разработана дополнительная пара праймеров для захвата транскриптов, происходящих из всех копий гена (дополнительная рис. 11). Один из двух уникальных штрих-кодов PacBio был добавлен к праймерам, чтобы различать продукты ОТ-ПЦР у двух мужчин. Затем продукты ОТ-ПЦР от этих двух человек были разделены на два эквимолярных пула в соответствии с ожидаемыми размерами транскриптов (<1 kb и 1–2 kb; дополнительная таблица 4) и очищены с использованием гранул AMPure XP (Beckman Coulter, Inc., США). ). Затем каждый из двух пулов ОТ-ПЦР использовали для создания отдельной библиотеки PacBio Iso-Seq, которая была секвенирована с помощью RSII (химия P6-C4) с использованием одной клетки SMRT на библиотеку. Таким образом, всего было секвенировано две клетки SMRT.

Кроме того, мы секвенировали те же продукты ОТ-ПЦР с помощью технологии Illumina. Мы создали отдельную библиотеку Nextera XT (с уникальной парой индексов) для каждой комбинации пара праймеров и образцов. Всего было проанализировано девять семейств генов с использованием 10 пар праймеров (как упоминалось выше, одно семейство генов, CDY , было проанализировано с двумя парами праймеров). Таким образом, было сконструировано 10 пар праймеров × 2 человека = 20 библиотек. Эти библиотеки были нормализованы, объединены в эквимолярном соотношении и секвенированы на приборе MiSeq с использованием одного набора MiSeq Reagent Nano Kit, v2 (секвенирование парных концов 250 × 250).

Расширенная версия экспериментального протокола доступна в Интернете по адресу https://doi.org/10.1038/protex.2018.109.

Доступность кода

IsoCon имеет открытый исходный код и находится в свободном доступе по адресу https://github. com/ksahlin/IsoCon. Результаты IsoCon в этой статье были получены с коммитом 79589f3 на GitHub. Подробная информация о параметрах программного обеспечения приведена в дополнительном примечании 4. Скрипты для всех анализов доступны по адресу https://github.com/ksahlin/IsoCon_Eval. Этот репозиторий также включает в себя змейку ⁶³ рабочий процесс, который воспроизводит промежуточные и окончательные данные для анализа семейства ампликоновых генов.

Ссылки

1. Заррей, М., Макдональд, Дж. Р., Мерико, Д. и Шерер, С. В. Карта вариаций числа копий генома человека. Нац. Преподобный Жене. 16 , 172–183 (2015).

   КАС Статья Google ученый

2. Картер, Н. П. Методы и стратегии анализа вариаций числа копий с использованием ДНК-микрочипов. Нац. Жене. 39 , С16–С21 (2007).

   КАС Статья Google ученый

3. «>

   Sudmant, P.H. et al. Разнообразие вариаций числа копий человека и мультикопийность генов. Наука 330 , 641–646 (2010).

   ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

4. Редон, Р. и др. Глобальная вариация числа копий в геноме человека. Природа 444 , 444–454 (2006).

   ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

5. Бейли, Дж. А., Кидд, Дж. М. и Эйхлер, Э. Э. Полиморфные гены числа копий человека. Цитогенет. Геном Res. 123 , 234–243 (2008).

   КАС Статья Google ученый

6. Ли, У.-Х., Гу, З., Ван, Х. и Некрутенко, А. Эволюционный анализ генома человека. Природа 409 , 847–849 (2001).

   ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

7. «>

   Ruderfer, D.M. et al. Паттерны генной непереносимости редких вариаций количества копий в 59 898 экзомах человека. Нац. Жене. 48 , 1107–1111 (2016).

   КАС Статья Google ученый

8. Брахмачари, М. и др. Цифровое генотипирование макросателлитов и мультикопийных генов выявляет новые биологические функции, связанные с изменением числа копий больших тандемных повторов. PLoS Genet. 10 , e1004418 (2014).

   Артикул Google ученый

9. Конрад Б. и Антонаракис С. Э. Дублирование генов: стремление к фенотипическому разнообразию и причина болезней человека. год. Преподобный Геном. Гум. Жене. 8 , 17–35 (2007).

   КАС Статья Google ученый

10. Цучия Н., Кёгоку К., Мияшита Р. и Куроки К. Разнообразие мультигенных семейств иммунной системы человека и его влияние на генетический фон ревматических заболеваний. Курс. Мед. хим. 14 , 431–439 (2007).

    КАС Статья Google ученый

11. Бейли, Дж. А., Явор, А. М., Масса, Х. Ф., Траск, Б. Дж. и Эйхлер, Э. Э. Сегментные дупликации: организация и влияние в текущей сборке проекта генома человека. Рез. генома. 11 , 1005–1017 (2001).

    КАС Статья Google ученый

12. Бейли, Дж. А. и Эйхлер, Э. Э. Сегментарные дупликации приматов: тигли эволюции, разнообразие и болезни. Нац. Преподобный Жене. 7 , 552–564 (2006).

    КАС Статья Google ученый

13. Пан, К., Шай, О., Ли, Л.Дж., Фрей, Б.Дж. и Бленкоу, Б.Дж. Глубокое исследование сложности альтернативного сплайсинга в транскриптоме человека с помощью высокопроизводительного секвенирования. Нац. Жене. 40 , 1413–1415 (2008).

    КАС Статья Google ученый

14. Wang, E. T. et al. Альтернативная регуляция изоформ в транскриптомах тканей человека. Природа 456 , 470–476 (2008).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

15. Хигути Р., Доллинджер Г., Шон Уолш П. и Гриффит Р. Одновременная амплификация и обнаружение специфических последовательностей ДНК. Биотехнология 10 , 413–417 (1992).

    КАС Статья Google ученый

16. Hindson, B.J. et al. Высокопроизводительная цифровая система капельной ПЦР для абсолютного количественного определения количества копий ДНК. Анал. хим. 83 , 8604–8610 (2011).

    КАС Статья Google ученый

17. Steijger, T. et al. Оценка методов реконструкции транскриптов для секвенирования РНК. Нац. Методы 10 , 1177–1184 (2013).

    КАС Статья Google ученый

18. Гордон С.П. и др. Широко распространенные полицистронные транскрипты у грибов, обнаруженные с помощью секвенирования одиночных молекул мРНК. PLoS ONE 10 , e0132628 (2015).

    Артикул Google ученый

19. Лю, X., Мей, В., Солтис, П. С., Солтис, Д. Э. и Барбазук, В. Б. Обнаружение альтернативно сплайсированных изоформ транскриптов из одномолекулярных долгочитаемых последовательностей без эталонного генома. Мол. Экол. Ресурс. 17 , 1243–1256 (2017).

    КАС Статья Google ученый

20. Чжан, С.-Дж. и другие. Эволюция изоформ у приматов посредством независимой комбинации альтернативных событий процессинга РНК. Мол. биол. Эвол. 34 , 2453–2468 (2017).

    КАС Статья Google ученый

21. Hoang, N.V. et al. Обзор сложного транскриптома из высокополиплоидного генома сахарного тростника с использованием полноразмерного секвенирования изоформ и сборки de novo из короткого секвенирования. BMC Геном. 18 , 395 (2017).

    Артикул Google ученый

22. Kuo, R. I. et al. Нормализованное секвенирование длинной РНК у курицы выявило сложность транскриптома, подобную человеческой. BMC Геном. 18 , 323 (2017).

    Артикул Google ученый

23. Tardaguila, M. et al. SQANTI: обширная характеристика последовательностей длинного считывания транскриптов для контроля качества при идентификации и количественном определении полноразмерного транскриптома. https://doi.org/10.1101/118083 (2017 г.).

24. Abdel-Ghany, S.E. et al. Обзор транскриптома сорго с использованием длинных чтений одиночных молекул. Нац. коммун. 7 , 11706 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

25. Weirather, J.L. et al. Характеристика генов слияния и значительно выраженных изоформ слияния при раке молочной железы с помощью гибридного секвенирования. Рез. нуклеиновых кислот. 43 , e116 (2015).

    Артикул Google ученый

26. Донг, Л. и др. Секвенирование транскриптов отдельных молекул в реальном времени облегчает аннотацию генома мягкой пшеницы и исследование транскриптома зерна. BMC Геном. 16 , 1039 (2015).

    Артикул Google ученый

27. «>

    Гао, С. и др. Профилирование полноразмерного транскриптома PacBio экспрессии митохондриальных генов насекомых. РНК Биол. 13 , 820–825 (2016).

    Артикул Google ученый

28. Minoche, A. E. et al. Использование секвенирования одномолекулярных транскриптов для предсказания эукариотических генов. Геном Биол. 16 , 184 (2015).

    Артикул Google ученый

29. Ченг, Б., Фуртадо, А. и Генри, Р. Дж. Длинное чтение транскриптома кофейных зерен показывает разнообразие полноразмерных транскриптов. Gigascience 6 , 1–13 (2017).

    Артикул Google ученый

30. Ван, Б. и др. Выявление сложности транскриптома кукурузы с помощью долговременного секвенирования одной молекулы. Нац. коммун. 7 , 11708 (2016).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

31. Workman, R. E. et al. Полноразмерное секвенирование одной молекулы дает представление об экстремальном метаболизме колибри с красным горлом Archilochus colubris. https://doi.org/10.1101/117218 (2017 г.).

32. PacificBiosciences. PacificBiosciences/кДНК_праймер. Гитхаб . https://github.com/PacificBiosciences/cDNA_primer/wiki/RS_IsoSeq-(v2.3)-Tutorial-%232.-Isoform-level-clustering-(ICE-and-Quiver). По состоянию на 16 ноября 2017 г.

33. Au, K.F. et al. Характеристика транскриптома ЭСК человека с помощью гибридного секвенирования. Проц. Натл акад. науч. США 110 , E4821–E4830 (2013 г.).

    КАС Статья Google ученый

34. Лав, М. И., Хогенеш, Дж. Б. и Иризарри, Р. А. Моделирование смещения последовательности фрагментов РНК-секвенции снижает систематические ошибки в оценке распространенности транскриптов. Нац. Биотехнолог. 34 , 1287–1291 (2016).

    КАС Статья Google ученый

35. Тилгнер, Х., Груберт, Ф., Шэрон, Д. и Снайдер, М.П. Определение персонального, аллель-специфического и одномолекулярного долгочитаемого транскриптома. Проц. Натл акад. науч. США 111 , 9869–9874 (2014).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

36. Мангул, С. и др. HapIso: точный метод реконструкции изоформ, специфичных для гаплотипов, из длинных одномолекулярных ридов. https://doi.org/10.1101/050906 (2016).

37. Нуманагич, И. и др. Cypiripi: точное генотипирование CYP2D6 с использованием данных высокопроизводительного секвенирования. Биоинформатика 31 , i27–i34 (2015).

    Артикул Google ученый

38. «>

    Нуманагич, И. и др. Аллельная декомпозиция и точное генотипирование высокополиморфных и структурно-вариантных генов. Нац. коммун. 9 , 828 (2018).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google ученый

39. Лян, М. и др. Различение очень похожих изоформ генов с помощью кластерного биоинформатического анализа длинных чтений одиночных молекул PacBio. Мин. биоданных 9 , 13 (2016).

    Артикул Google ученый

40. Артёменко А. и др. Длинные чтения одной молекулы могут разрешить сложность вируса гриппа, состоящего из редких, близкородственных мутантных вариантов. Дж. Вычисл. биол. 24 , 558–570 (2017).

    КАС Статья Google ученый

41. Чжан, В., Циклитира, П. и Мессинг, Дж. PacBio секвенирование семейств генов — тематическое исследование с генами глютена пшеницы. Ген 533 , 541–546 (2014).

    КАС Статья Google ученый

42. Сков, Л., Датский пангеномный консорциум и Шируп, М. Х. Анализ 62 собранных гибридов Y-хромосом человека выявил быстрые структурные изменения и высокую скорость конверсии генов. Генетика PLoS. 13 , e1006834 (2017).

    Артикул Google ученый

43. Ахмади Растегар, Д. и др. Профили экспрессии генов на уровне изоформы генов фактора азооспермии Y-хромосомы человека и их паралогов X-хромосомы в ткани яичка пациентов с необструктивной азооспермией. J. Proteome Res. 14 , 3595–3605 (2015).

    КАС Статья Google ученый

44. Giachini, C. et al. TSPY 1 Изменение числа копий влияет на сперматогенез и демонстрирует различия между линиями Y. Дж. Клин. Эндокринол. Метаб. 94 , 4016–4022 (2009).

    КАС Статья Google ученый

45. Ферлин, А., Моро, Э., Гаролла, А. и Фореста, С. Мужское бесплодие человека и делеции Y-хромосомы: роль генов-кандидатов AZF DAZ , RBM и DFFRY. Гул. Воспр. 14 , 1710–1716 (1999).

    КАС Статья Google ученый

46. Бхоумик Б.К., Сатта Ю. и Такахата Н. Происхождение и эволюция семейств ампликоновых генов человека и ампликоновой структуры. Рез. генома. 17 , 441–450 (2007).

    КАС Статья Google ученый

47. Скалецкий Х. и др. Специфичная для мужчин область Y-хромосомы человека представляет собой мозаику дискретных классов последовательностей. Природа 423 , 825–837 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЕ КАС Статья Google ученый

48. «>

    Hackl, T., Hedrich, R., Schultz, J. & Förster, F. proovread: крупномасштабная высокоточная коррекция PacBio посредством итеративного консенсуса по краткому чтению. Биоинформатика 30 , 3004–3011 (2014).

    КАС Статья Google ученый

49. Tseng, E., Tang, H.-T., AlOlaby, R.R., Hickey, L. & Tassone, F. Измененная экспрессия ландшафта вариантов сплайсинга FMR1 у носителей премутаций. Биохим. Биофиз. Acta 1860 , 1117–1126 (2017).

    КАС Статья Google ученый

50. Громолл, Дж. и др. Ген обезьяны Старого Света DAZ (удаленный в AZoospermia) дает представление об эволюции кластера генов DAZ на Y-хромосоме человека. Гул. Мол. Жене. 8 , 2017–2024 (1999).

    КАС Статья Google ученый

51. «>

    Розен, С. и др. Обильная конверсия генов между плечами палиндромов в Y-хромосомах человека и обезьяны. Природа 423 , 873–876 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

52. Акен Б.Л. и др. Ensembl 2017. Nucleic Acids Res. 45 , Д635–Д642 (2017).

    КАС Статья Google ученый

53. Фунгтаммасан, А. и др. Ошибки обратной транскрипции и различия РНК-ДНК при коротких тандемных повторах. Мол. биол. Эвол. 33 , 2744–2758 (2016).

    КАС Статья Google ученый

54. Дистель, Р. Теория графов 5-е изд. (Спрингер, Берлин, 2018 г.).

55. Томашкевич, М. и др. Эффективная с точки зрения времени и затрат стратегия секвенирования Y-хромосом млекопитающих: приложение к сборке de novo Y-хромосомы гориллы. Рез. генома. 26 , 530–540 (2016).

    КАС Статья Google ученый

56. Hurles, M. Дублирование генов: геномная торговля запчастями. PLoS Биол. 2 , E206 (2004 г.).

    Артикул Google ученый

57. Tardaguila, M. et al. SQANTI: обширная характеристика последовательностей длинного считывания транскриптов для контроля качества при идентификации и количественном определении полноразмерного транскриптома. https://doi.org/10.1101/118083 (2017 г.).

58. Pretto, D. I. et al. Дифференциальное увеличение специфических изоформ мРНК FMR1 у носителей премутаций. J. Med. Жене. 52 , 42–52 (2015).

    КАС Статья Google ученый

59. Альберт, Т.Дж. и др. Прямая селекция геномных локусов человека с помощью микрочиповой гибридизации. Нац. Методы 4 , 903–905 (2007).

    КАС Статья Google ученый

60. Daily, J. Parasail: библиотека SIMD C для глобального, полуглобального и локального парного выравнивания последовательностей. БМС Биоинформ. 17 , 81 (2016).

    Артикул Google ученый

61. Рагхаван П. Вероятностное построение детерминированных алгоритмов: аппроксимация целочисленных программ упаковки. Дж. Вычисл. Сист. науч. 37 , 130–143 (1988).

    MathSciNet Статья Google ученый

62. Чин, К.-С. и другие. Негибридные, готовые сборки микробного генома из давно прочитанных данных секвенирования SMRT. Нац. Методы 10 , 563–569 (2013).

    КАС Статья Google ученый

63. «>

    Кестер, Дж. и Рахманн, С. Snakemake — масштабируемый механизм рабочего процесса в области биоинформатики. Биоинформатика 28 , 2520–2522 (2012).

    Артикул Google ученый

64. Майкл Васком и др. (2014, 14 ноября). seaborn: v0.5.0 (ноябрь 2014 г.) (версия v0.5.0). Зенодо. https://doi.org/10.5281/zenodo.12710. По состоянию на 22 ноября 2017 г.

65. Торвальдсдоттир, Х., Робинсон, Дж. Т. и Месиров, Дж. П. Integrative Genomics Viewer (IGV): высокопроизводительная визуализация и исследование данных геномики. Краткая информация. Биоинформ. 14 , 178–192 (2012).

    Артикул Google ученый

66. Robinson, J. T. et al. Интегративный просмотрщик геномики. Нац. Биотехнолог. 29 , 24–26 (2011).

    КАС Статья Google ученый

67. «>

    Скалецкий Х. и др. Специфичная для мужчин область Y-хромосомы человека представляет собой мозаику дискретных классов последовательностей. Природа 423 , 825–837 (2003).

    ОБЪЯВЛЕНИЯ КАС Статья Google ученый

68. Сков, Л. Датский пангеномный консорциум и Шируп, М. Х. Анализ 62 собранных гибридов Y-хромосом человека выявил быстрые структурные изменения и высокую скорость генной конверсии. Генетика PLoS. 13 , e1006834 (2017).

    Артикул Google ученый

69. Томашкевич, М. и др. Эффективная с точки зрения времени и затрат стратегия секвенирования Y-хромосом млекопитающих: приложение к сборке de novo Y-хромосомы гориллы. Рез. генома. 26 , 530–540 (2016).

    КАС Статья Google ученый

Ссылки на скачивание

Стенограмма веб-семинара, который я провел по ISO 27035 Управление инцидентами безопасности

Недавно я провел учебный веб-семинар по реагированию на инциденты безопасности ISO 27035. Это стенограмма урока, который я вел. Пожалуйста, простите любые ошибки транскрипции. Майкл С. Редмонд

Примечания к стенограмме

1. Доктор Майкл С. Редмонд, доктор философии MBCP, FBCI, CEM, PMP, MBA
2. Киберзащита и реагирование Политика безопасности и средства контроля организации должны быть адаптированы к новым угрозам в современном мире. Оценка угроз безопасности продолжается и должна быть сопоставлена ​​с адекватностью и наличием мер безопасности. Применяемые в настоящее время меры безопасности и контрмеры могут не соответствовать потенциальным рискам. Усилия никогда не заканчиваются, но главное знать, как начать.
3. Мотиваторы Увеличение количества сообщаемых инцидентов компьютерной безопасности Увеличение числа и типов организаций, затронутых инцидентами компьютерной безопасности Более целенаправленное осознание организациями необходимости политик и методов безопасности в рамках их общих стратегий управления рисками Новые законы и правила, влияющие на то, как организации должны защищать информационные активы Осознание того, что системные и сетевые администраторы в одиночку не могут защитить организационные системы и активы
4. Почему нарушения безопасности CRIST и последующее мошенничество становятся все более частыми и масштабными. В то время как финансовые учреждения, розничные торговцы, поставщики медицинских услуг и другие целевые организации делают все возможное, чтобы оставаться на шаг впереди киберпреступников, эти инциденты, вероятно, будут продолжаться, подвергая риску конфиденциальную информацию. Хотя вы не всегда можете предотвратить нарушение, быстрое реагирование может минимизировать ущерб для репутации и финансовые последствия. Проактивное и своевременное информирование владельцев счетов может помочь сократить расходы, в том числе связанные с увеличением активности колл-центра, обучением клиентов, кампаниями по восстановлению бренда, соблюдением нормативных требований и расходами на покрытие убытков клиентов.
5. Многие крупные компании подвергаются хакерским атакам: Anthem, Sony, Target и другие. Количество утечек данных увеличилось на 27,5% в 2014 г. В компаниях все чаще принимаются меры против таких инцидентов безопасности.
6. В 2012 г. в результате крупнейшей атаки на государственное агентство было украдено 3,8 миллиона налоговых документов • В августе хакеры украли номера социального страхования и кредитных карт из Департамента доходов Южной Каролины. Фишинговое электронное письмо позволило хакерам украсть учетные данные пользователей и в конечном итоге украсть 74 ГБ зашифрованных и незашифрованных данных.
7. Взлом сервера в 2012 году привел к нарушению HIPAA Министерством здравоохранения штата Юта • В апреле 2012 года 780 000 человек пострадали от взлома сервера на уровне аутентификации, который позволил хакерам получить доступ и украсть SSN и личные медицинские записи из Министерства здравоохранения штата Юта. • Один сервер не был настроен в соответствии с обычной процедурой, что позволило хакерам получить доступ к системе.
8. В 2012 году утечка данных PCI Global Payments Inc. затронула 1,5 миллиона человек • Почти 1,5 миллиона потребителей пострадали от хакеров, получивших доступ к системе обработки платежей Global Payments Inc. в январе и феврале.
9. 14 декабря 2014 г. сбой в работе веб-сайта правительства Нидерландов из-за кибератаки • Кибер-злоумышленники вывели из строя основные веб-сайты правительства Нидерландов в течение большей части вторника, а резервные планы оказались неэффективными, что выявило уязвимость критически важной инфраструктуры во время повышенного беспокойства по поводу онлайн-безопасности. . • Отключение в 09:00 по Гринвичу продолжалось более семи часов, и в среду правительство подтвердило, что это была кибератака.
10. Февраль 2015 г., китайские хакеры «нацелились на оборонные и финансовые фирмы США» после кибератаки на Forbes • Американские фирмы, занимающиеся кибербезопасностью, заявляют, что китайская шпионская группа взломала журнал Forbes, чтобы затем атаковать оборонных подрядчиков, финансовые фирмы и другую ничего не подозревающую добычу, посещающую популярный новостной веб-сайт. • Invincea и iSight Partners подробно рассказали о том, что они назвали кампанией «водопой» в конце прошлого года, в которой использовались преимущества Forbes.com и других законных веб-сайтов. • «Китайская продвинутая постоянная угроза скомпрометировала Forbes.com, чтобы организовать в конце ноября 2014 года атаку через Интернет против американских оборонных и финансовых компаний», — говорится в отчете Invincea, размещенном на ее веб-сайте. • «Наглая атака» использовала уязвимости в программном обеспечении Adobe Flash и Internet Explorer, которые, по данным Invincea, с тех пор были закрыты.
11. 13 февраля 2015 г. Группа здравоохранения штата Теннесси уведомляет сотрудников о нарушении платежных ведомостей • Компания Franklin Healthcare Associates (SoFHA) из штата Теннесси уведомила всех сотрудников о том, что их личная информация была получена во время нарушения безопасности у стороннего поставщика платежных ведомостей компании, а некоторые уже использовался для подачи мошеннических налоговых деклараций. • Сколько жертв? Все сотрудники уведомлены, пострадали от 20 до 25 человек. • Какой тип личной информации? Информация о заработной плате сотрудников, включая формы W-2. • Что случилось? Был взломан сторонний поставщик платежных ведомостей SoFHA, был получен доступ к информации о заработной плате сотрудников SoFHA, и были поданы мошеннические налоговые декларации. • Какой был ответ? SoFHA работает с национальными, государственными и местными правоохранительными органами для выявления преступников. SoFHA уведомляет всех сотрудников и предлагает им бесплатный год услуг по защите от кражи личных данных. • Подробности: SoFHA уведомила местные органы власти в начале февраля. По состоянию на четверг от 20 до 25 сотрудников сообщили о том, что стали жертвами кражи личных данных, связанных с налогами. • Цитата: «Нам известно, что кибератака касалась только информации о заработной плате сотрудников, и ни разу не были скомпрометированы какие-либо данные пациентов», — цитирует Ричарда Панека, генерального директора SoFHA. «Мошенничество заключается в том, что преступники пытаются подать и получить возврат налога до того, как подаст заявление реальный человек».
12. Вопросы • Каковы основные требования для создания CSIRT? • Какой тип CSIRT потребуется? • Какие виды услуг следует предлагать? • Насколько большой должна быть группа CSIRT? • Где в организации должна располагаться группа CSIRT? • Сколько будет стоить внедрение и поддержка команды? • Каковы начальные шаги для создания CSIRT?
13. План программы CSIRT для управления сценариями для каждого типа инцидентов кибербезопасности (в худшем случае не работает, как при аварийном восстановлении)
14. Что необходимо • Программа реагирования на инциденты кибербезопасности — Группы реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированная программа реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированный план реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированные пособия по реагированию на инциденты кибербезопасности • Оценка внутреннего контроля • Обзор политик • Анализ пробелов • Оценка рисков REWI • Помощь в оценке рисков • Обучение по вопросам безопасности • Планирование обеспечения непрерывности бизнеса и аварийного восстановления
Стандарты
15. • ISO 2700 (Требования) • FFIEC • PCI DSS (обработка кредитных карт) • И многие другие стандарты и рекомендации • COBIT (Структура управления и контроля в сфере ИТ) • ISO 27005 (Управление рисками информационной безопасности) • ITIL (Структура : Определение, планирование, поставка, поддержка функций ИТ для бизнеса) Поддержание
16. Общие вопросы были удалены.
17. ISO и информационная безопасность 27001 Требования к информационной безопасности 27002 Кодекс практики управления информационной безопасностью 27003 Руководство по внедрению системы управления информационной безопасностью 27004 Измерение информационной безопасности 27005 Управление рисками информационной безопасности 27006 Аудит требований и сертификация ISO
18. На что следует обратить внимание CSIRT взаимодействуют с другими организациями Как обращаться с конфиденциальной информацией Охватывают как операционные, так и технические вопросы •Оборудование •Безопасность •Соображения относительно кадрового состава Ресурсы для вновь формирующихся и существующих групп Заинтересованные стороны •Сотрудники CSIRT •Руководители более высокого уровня •Другие лица, взаимодействующие с CSIRT
19. Не только реагирование Координация обработки инцидентов, тем самым устраняя дублирование усилий Смягчение потенциально серьезных последствий серьезной проблемы, связанной с компьютерной безопасностью Включите усилия не только в отношении способности реагировать на инциденты, но и ресурсов для оповещения и информирования группы
20. Различные планы похожи друг на друга CIRP План реагирования на компьютерные инциденты CSIRP План реагирования на инциденты кибербезопасности • Группа реагирования CSIRT на инциденты кибербезопасности
21. Основы программы и плана Цель Объем Допущения Собственность Действия Этапы Структура
22. CSIRT Подготовка к инциденту Обнаружение Прекурсоры и анализ индикаторов Декларация Реагирование Сдерживание Ликвидация Восстановление После инцидента
23. Что необходимо • Программа реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированная программа реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированный план реагирования на инциденты кибербезопасности — Группы реагирования на инциденты кибербезопасности — Документированные пособия по реагированию на инциденты кибербезопасности • Обзор политик • Анализ пробелов • Оценка рисков REWI — Оценка внутреннего контроля • Содействие оценке рисков • Обучение по вопросам безопасности • Планирование обеспечения непрерывности бизнеса и аварийного восстановления
24. Видение Определите свой избирательный округ. Кого поддерживает и обслуживает CSIRT? Определите свою миссию, цели и задачи CSIRT. Что CSIRT делает для определенного избирательного округа? Выберите услуги CSIRT для предоставления группе (или другим лицам). Как CSIRT поддерживает свою миссию? Определить организационную модель. Как CSIRT структурирована и организована? Определите необходимые ресурсы. Какой персонал, оборудование и инфраструктура необходимы для работы CSIRT? Определите свое финансирование CSIRT. Как CSIRT финансируется для ее первоначального запуска и ее долгосрочного обслуживания и роста?
25. Кто должен быть в CSIRT Teams Бизнес-менеджеры. Им необходимо понимать, что такое CSIRT и как она может помочь в поддержке их бизнес-процессов. Должны быть достигнуты соглашения относительно полномочий CSIRT в отношении бизнес-систем и того, кто будет принимать решения, если критически важные бизнес-системы должны быть отключены от сети или закрыты.
26. Прекращение разрешения инициирования последовательности операций
27. Документация • Программа реагирования на инциденты кибербезопасности – Документированная программа реагирования на инциденты кибербезопасности – Документированный план реагирования на инциденты кибербезопасности – Группы реагирования на инциденты кибербезопасности – Документированные пособия по реагированию на инциденты кибербезопасности
Обзор политики
28. • Рекомендации по использованию компьютера • Заявление о допустимом использовании • Особая политика доступа • Соглашение об особых рекомендациях по доступу • Политика сетевых подключений • Процедуры эскалации инцидентов безопасности • Процедура обработки инцидентов • Допустимое шифрование • Политика политики безопасности аналоговых/ISDN-линий • Политика безопасности лаборатории DMZ • Руководство по антивирусному процессу • Политика поставщиков услуг приложений (ASP) • Политика оценки приобретения • Стандарты безопасности ASP • Политика аудита • Политика автоматической переадресации электронной почты • Политика паролей БД • Политика коммутируемого доступа • Политика оборудования DMZ в Интернете • Политика экстрасети • Политика конфиденциальности информации • Политика безопасности внутренней лаборатории
29. Обучение по вопросам безопасности имеет важное значение.

    No related posts.