LG Q7 — характеристики

Совсем недавно LG представила смартфон-середнячок, который, по всей видимости, должен стать бюджетной альтернативой вышедшего месяц назад флагмана. LG Q7 не стал воплощением безрамочности и не удивляет пользователей дизайнерскими изысками, тем не менее, интерес вызывает, ведь гаджет даже не был анонсирован официально.

Не секрет, что дела в компании Элджи идут не так радужно, как у китайских конкурентов. Вот уже пару лет инженеры стараются придумать какой-нибудь оригинальный смартфон, который бы привлек аудиторию. И все же Лджи Ку 7 не стал новым откровением, судя по всему, это попытка сделать середнячок, который бы заполнил нишу ниже актуального и дорогостоящего флагмана LG G7 ThinQ. К тому же, аппарат получил двух собратьев, которые отличаются в линейке приставками «а» и «+». Но попробуем разобрать именно базовую модель и сравнить смартфон с актуальным флагманом:

• Дисплей. Начать следует именно с него, ведь экран меньше – 5. 5” против 6.1.
• Камера. 16 мп в обоих случаях. Естественно флагман получил продвинутую версию, к тому же, в отличие от ку-серии еще и дуал-модуль.
• Батарея. Аналогичная, в 3000мач.
• ОЗУ. 4 гб против 6 флагманских.

А вот с чипсетом пока не до конца ясно. В смысле, с таковым у героя обзора, естественно здесь далеко не флагманская модель процессора. Но чтоб настолько: если верить первичным спецификациям, гаджет получит Snapdragon 450, а вероятнее, и вовсе медиатековский Хелио Р10 или МТ6750S.

Оформление

Нельзя причислить ни к сильным, ни к слабым сторонам аппарата. Оно здесь лаконичное, в духе LG. С безрамочностью решили не заморачиваться, гаджет не сильно отличается от прошлогоднего флагмана, но соотношение 18:9. Брови-челки на экране как во флагманской модели здесь нет. Разрешение составляет 1080х2160 точек. Важная особенность, которую смартфон все же унаследовал от флагмана – защита от пыли и влаги. Проверялась по военному стандарту 810G.

Возможно, этот элемент в некоторой степени повлиял на стоимость.

Итоги

В целом, смартфон получился неплохим. Конечно, у него найдутся критики, но строгое лаконичное оформление и вправду нужно некоторой аудитории. Вот чего нельзя простить данному смартфону, так это стоимость. Она и вовсе недемократична для применяемой платформы. Гаджет планируют продавать по цене в 460 евро и купить его захотят, скорее всего, истинные поклонники классического зарекомендовавшего себя южнокорейского бренда. Ведь в противном случае придется доплатить за флагман, который, к слову, стоит ненамного дороже.

LG G7 Plus ThinQ обзор: плюсы и минусы [2021]

Android OS v8.0 (Oreo)

Qualcomm Snapdragon 845

6 GB / 128 GB

6,1 дюймов 1440 x 3120 px

Смартфон LG G7 Plus ThinQ (LM-G710EAW) выпущен в 2018 году. Он оснащен чипсетом Qualcomm Snapdragon 845, 6 GB оперативной памяти и 128 GB встроенной памяти.

LG G7 Plus ThinQ работает на Android OS v8.0 (Oreo) из коробки. Он поставляется с батареей Li-Po 3000 mAh, несъемный. Он имеет 6,1 дюймов IPS-дисплей с разрешением 1440 x 3120 px. Технология IPS является одной из самых передовых ЖК-технологий в мире.

Оглавление:

LG G7 Plus ThinQ (LM-G710EAW) технические характеристики

Бренд

LG

Имя

G7 Plus ThinQ

Тип

LM-G710EAW

Рейтинг

Запустить

2018

Тело

Вес

162 g

Размеры

153,2 x 71,9 x 7,9 mm

Цвета

черный
синий
серый
красный

Тип SIM

Nano SIM

Система

LG G7 Plus ThinQ работает на Android OS v8.0 (Oreo) прямо из коробки, но микропрограмму G7 Plus ThinQ можно обновить до более новой версии ОС.

OS

Android OS v8. 0 (Oreo)

Чипсет

Qualcomm Snapdragon 845

CPU

Octa-core, Quad-core 2.8 GHz Kryo, Quad-core 1.8 GHz Kryo

GPU

Adreno 630

Дисплей

Размер экрана измеряется в дюймах, по диагонали от угла к углу. 6,1 дюймов емкостный сенсорный IPS экран с разрешением 1440 x 3120 px поддерживает технологию мультитач.

Технология

IPS

Размер

6,1 дюймов

Разрешение

1440 x 3120 px

Мультитач

да

Память

Память смартфона (6 GB) не может быть расширена, но память (128 GB) может быть расширена с помощью карты microSD.

ПАМЯТЬ

6 GB

Внутреннее хранилище

128 GB

Внешнее хранилище

microSD

Камера

Камера LG G7 Plus ThinQ оснащена автофокусом. Автофокус — это функция камеры, которая тонко настраивает фокус камеры, это приятная особенность этого смартфона. Задняя камера имеет оптическую стабилизацию изображения (OIS) для противодействия встряхиванию камеры.

Фронтальная камера

8 MP

Задняя камера

16 + 16 MP
4608 x 3456 px
автофокусировка
оптическая стабилизация изображения

Вспышка

Двойной светодиод

Связь

G7 Plus ThinQ поддерживает 3G и 4G. Этот смартфон имеет встроенный GPS-приемник. GPS — это спутниковая навигационная система, которая позволяет определять точное географическое положение на Земле. G7 Plus ThinQ поставляется с функцией Near Field Communications (NFC) для передачи контента с другими устройствами с поддержкой NFC. Этот смартфон LG не имеет приемника FM-радио.

GSM

850 / 900 / 1800 / 1900

Мобильная сеть

2G / 3G / 4G

WLAN

Wi-Fi 802.11 a/b/g/n/ac

Блютуз

v5.0, A2DP

GPS

A-GPS, GLONASS

NFC

да

FM-радио

нет

USB

USB Type-C

Аудио

3,5 mm jack

Батарея

Батарея Li-Po 3000 mAh, несъемный дает смартфону хороший запас батареи.

Тип

Li-Po 3000 mAh, несъемный

Особенности

Датчики смартфона измеряют физические количества и передают их на процессор приложения. Акселерометр телефонов является встроенным электронным компонентом, который измеряет наклон и движение. Датчик отпечатков пальцев является одним из самых простых и безопасных способов защиты вашего смартфона. Датчик близости обнаруживает, когда пользователь держит телефон рядом с их лицом во время звонка и выключает дисплей, чтобы предотвратить нажатия клавиатуры и потребление батареи от дисплея. G7 Plus ThinQ имеет функцию Двойная SIM, что означает, что вы можете вставить две разные SIM-карты и использовать их обе с одного телефона.

Датчики

акселерометр
барометр
компас
отпечаток пальца
гироскоп
холл
светлый
близость

Специальное

Сертифицированный IP68 пылезащитный и водонепроницаемый
Corning Gorilla Glass 5
Двойная SIM
Быстрая зарядка
Быстрая зарядка
Беспроводная зарядка

Приведенные выше характеристики основаны на официальных данных, опубликованных производителем, но мы также учитываем отзывы пользователей. Если вы обнаружили ошибку или что-то не так в приведенных выше спецификациях для LG G7 Plus ThinQ, не стесняйтесь и сообщите нам о проблеме.

LG G7 Plus ThinQ (LM-G710EAW) фотографии

Если есть информация о LG G7 Plus ThinQ, которую вы хотели бы видеть на этом сайте, напишите нам по адресу webmaster@droidchart.com.

Вся информация по IMEI телефона или серийному номеру

SNDeepInfo — это сервис проверки серийных номеров телефонов, смартфонов, фотоаппаратов, бытовой техники, IMEI телефонов всех марок и другой электронной и бытовой техники.

Что такое серийный номер?

Производитель присваивает каждому выпущенному устройству уникальный серийный номер, в котором зашифрована вся информация о модели устройства, стране, дате выпуска. Серийный номер уникален для каждого устройства одного производителя.

Что такое IMEI?

Мобильные телефоны, кроме серийного номера имеют, так называемый IMEI код. IMEI — это Международный идентификатор уникальный для каждого мобильного телефона. IMEI — общепринятый стандарт для всех мобильных устройств, который «вшивается» в телефон во время изготовления на заводе. Это что-то наподобие серийного номера, который транслируется оператору при авторизации телефона в сети. Формат IMEI кода одинаков для всех телефонов независимо от производителя. Также IMEI код используется для слежения и блокировки украденных телефонов на уровне оператора сотовой связи, что в дальнейшем не позволяет использовать такой аппарат в сети этого оператора. Однако блокировка IMEI кода у одного оператора не мешает использовать его в других сетях.

Как узнать серийный номер устройства?

Как правило, серийный номер напечатан на упаковке и продублирован на корпусе устройства, в большинстве случаев серийный номер доступен через программную оболочку.

Как узнать IMEI телефона?

Чтобы проверить IMEI телефона наберите *#06# и кнопку вызова на своем телефоне.

IMEI телефона выглядит как 15-ти значный цифровой код. IMEI код продублирован под аккумуляторной батареей вашего телефона, на упаковке и в гарантийном талоне.

Зачем это мне?

SNDeepInfo — это самый доступный способ узнать всю информацию об устройстве, прежде чем вы отдадите за него деньги. Введите серийный номер девайса или IMEI телефона в поле ввода и получите точную информацию о модели телефона. Пользователи Apple получают расширенную информацию с указанием физических и технических характеристик (цвет устройства, объем памяти, дату производства, версию прошивки при продаже устройства, способы разблокировки и jailbreak).

Для чего это всё?

SNDeepInfo обезопасит вас от покупки поддельного устройства. Если при проверке, серийного номера не окажется в системе, подумайте, не покупаете ли вы поддельную технику.

SNDeepInfo уберегает вас от покупки краденного.

Каждый пользователь, ставший жертвой кражи или потерявший устройство, имеет возможность оставить в базе IMEI номер украденного телефона или серийный номер устройства. Поэтому SNDeepInfo — это не только сервис проверки IMEI и серийных номеров, но также база данных украденных телефонов и устройств.

SNDeepInfo помогает найти украденное и утерянное. Внесите в базу IMEI код украденного телефона или серийный номер пропавшего устройства, и повысьте шансы на нахождение пропажи. Если при проверке окажется, что устройство числится в списке украденных, вы можете вернуть его полноправному владельцу и получить вознаграждение, если его назначил владелец.

SNDeepInfo — это не просто база IMEI телефонов и проверка серийных номеров, это сервис углубленной проверки качества устройств, тест на добросовестность продавцов и служба поиска украденных телефонов и утерянных устройств.

В настоящий момент сервис поддерживает проверку IMEI кодов всех телефонов, в том числе IMEI Apple iPhone 12, iPhone 12 Pro и iPhone 12 Pro Max, а также Samsung Galaxy S20, и Galaxy Note 10! Планируется расширение сервиса проверки серийных номеров устройств для любой электронной техники.

LG G7 Plus ThinQ — полный и честный обзор

Смартфон LG стремится к тому же, что и его корейский соперник Samsung, в последнее время. Во всем мире, LG по-прежнему, имеет большой портфель смартфонов, но в последнее время, у компании, стало меньше запусков новых устройств. Возьмем, к примеру, его флагмана 2018 года — G7 ThinQ. LG запустила эту модель, непосредственно, перед Google I / O. где она сотрудничала с поисковым гигантом, чтобы запустить первый Android-телефон, с выделенной аппаратной кнопкой для Google Assistant. Три месяца спустя, LG спокойно выпустила G7 Plus ThinQ без каких-либо презентаций, что действительно странно, учитывая его агрессивную цену в 575 долл. США. Эта цена делает его конкурентом 8-гигабайтной версии One Plus 6 и на бумаге, похоже, предлагает лучшие спецификации.

До сих пор, OnePlus 6 был нашей твердой рекомендацией по цене, хотя мы всегда чувствовали, что такие функции, как беспроводная зарядка и надлежащая гидроизоляция, прекрасно дополнят пакет. LG G7 Plus ThinQ обладает этими функциями и теперь пришло время посмотреть, действительно ли, он составит достойную конкуренцию OnePlus 6.

Характеристики LG G7 Plus ThinQ

Общие

• Тип: смартфон
• Операционная система: Android
• Версия ОС на начало продаж: Android 8.0
• Тип корпуса: классический
• Конструкция: водозащищенный
• Количество SIM-карт: 2
• Тип SIM-карт: nano SIM
• Режим работы нескольких SIM-карт: попеременный
• Вес: 162 г
• Размеры (ШxВxТ): 71.9×153.2×7.9 мм

Экран

• Тип экрана: цветной, сенсорный
• Тип сенсорного экрана: мультитач, емкостный
• Диагональ: 6.1 дюйм.
• Размер изображения: 3120×1440
• Число пикселей на дюйм (PPI): 563
• Соотношение сторон: 19.5:9
• Автоматический поворот экрана: есть
• Устойчивое к царапинам стекло: есть

Мультимедия

• Количество основных (задних) камер: 2
• Разрешения основных (задних) камер: 16 МП, 16 МП
• Диафрагмы основных (задних) камер: F/1. 60, F/1.90
• Фотовспышка: задняя, светодиодная
• Функции основной (задней) фотокамеры: автофокус, лазерный, режим макросъемки
• Запись видеороликов: есть
• Макс. разрешение видео: 3840×2160
• Geo Tagging: есть
• Фронтальная камера: есть, 8 МП
• Аудио: MP3, AAC, WAV, WMA, FM-радио
• Разъем для наушников: 3.5 мм

Связь

• Стандарт: GSM 900/1800/1900, 3G, 4G LTE
• Интерфейсы: Wi-Fi 802.11ac, Bluetooth 5.0, USB, NFC
• Геопозиционирование: A-GPS, ГЛОНАСС, GPS

Память и процессор

• Процессор: Qualcomm Snapdragon 845, 2800 МГц
• Количество ядер процессора: 8
• Видеопроцессор: Adreno 630
• Объем встроенной памяти: 128 Гб
• Объем оперативной памяти: 6 Гб
• Слот для карт памяти: есть, объемом до 2048 Гб

Питание

• Тип аккумулятора: Li-Ion
• Емкость аккумулятора: 3000 мА⋅ч
• Время работы в режиме разговора: 15. 5 ч
• Время работы в режиме ожидания: 100 ч
• Тип разъема для зарядки: USB Type-C
• Функция беспроводной зарядки: есть
• Функция быстрой зарядки: есть

Разное

• Громкая связь (встроенный динамик): есть
• Управление: голосовой набор, голосовое управление
• Режим полета: есть
• Профиль A2DP: есть
• Датчики: освещенности, приближения, Холла, гироскоп, компас, барометр, считывание отпечатка пальца
• Фонарик: есть.

Дизайн

Суффикс «ThinQ» означает использование искусственного интеллекта (AI), который был представлен компанией LG, на CES этого года. G7 Plus ThinQ является преемником прошлогоднего флагманского смартфона LG G6. Он имеет алюминиевую раму, достаточно широкую по бокам, чтобы ее легко можно было захватывать рукой и обладает корпусом из стекла Corning Gorilla Glass 5, для передней и задней части.

Стекло прекрасно сочетается с металлом, поэтому вы едва ощущаете края смартфона. Побочным эффектом этого дизайна являются отпечатки пальцев и пятна, которые, как нам известно, трудно избежать.

Кнопки легко доступны и имеют хорошую обратную связь. Специальную кнопку Google Assistant, можно отключить, с помощью приложения «Настройки», если вы не хотите его использовать, но LG не позволяет вам, повторно отображать его.

Когда ваш телефон разблокирован, одно нажатие открывает Google Assistant, а двойное нажатие открывает объектив Google. Чтобы избежать случайной активации, когда ваш телефон заблокирован, вам нужно либо нажать её дважды, либо удерживать её, в течение нескольких секунд, чтобы вызвать Google Assistant.

Дисплей LG G7 Plus ThinQ в сравнении с OnePlus

6.1-дюймовый экран IPS может похвастаться впечатляющим 1000-кратным уровнем яркости, что соответствует превосходной четкости, под прямым солнечным светом. Вы также, получаете разрешение QHD + (1440 x 3120 pi), чтобы изображения и текст выглядели острее. G7 Plus ThinQ имеет надрез или, как это называет LG, «новый второй экран».

У вас есть возможность замаскировать его и использовать разные фоновые изображения, но мы обнаружили, что черный экран, по умолчанию, выглядит лучше всего. Вы также, можете включить функцию «всегда на экране», которая дает вам интерактивные кнопки для Wi-Fi, Bluetooth, кнопки воспроизведения для музыкального проигрывателя и т.д.

Возможности подключения

В области с надрезом, имеется достаточно места для микрофона, светодиода уведомления, датчиков и передней камеры. Границы вокруг дисплея не очень тонкие, а внизу имеется заметный подбородок. Гибридный лоток, с двумя SIM-картами расположен в верхней части и этот телефон поддерживает два соединения 4G VoLTE, одновременно.

Второй слот можно использовать для расширения памяти, за счет использования второй SIM-карты. Внизу расположены разъем для наушников 3,5 мм, порт USB Type-C и решетка с одним динамиком. Несмотря на отсутствие стереодинамиков, G7 Plus ThinQ использует корпус как акустическую камеру, которая помогает усилить громкость. Во время воспроизведения музыки, вы можете почувствовать вибрацию задней части телефона.

Возможности подключения LG G7 Plus ThinQ

Две, вертикально расположенные, задние камеры вмонтированы почти на одном уровне с корпусом и оснащены защитой Gorilla Glass 4, что очень приятно. Рядом с ними, имеется одно светодиодная вспышка и лазерные датчики автоматической фокусировки.

Датчик отпечатков пальцев расположен немного ниже камер. Датчик работает быстро при аутентификации, но у вас, также, есть возможность разблокировки телефона, путем распознавания лица. Лицевая разблокировка срабатывает, когда вы поднимаете телефон вверх к себе, но не слишком надежно, настроена по умолчанию.

Это работает быстро, но мы обнаружили, что достаточно простой двумерной картины зарегистрированного лица, чтобы обмануть ее. Вы можете включить «Расширенное распознавание лиц», что делает вещи более безопасными, но аутентификация занимает больше времени и она не работает хорошо, при слабом освещении.

Дизайн задней панели LG G7 ThinQ

В коробке LG G7 Plus ThinQ, поставляется зарядное устройство, кабель для передачи данных, гарнитура, инструмент для извлечения SIM-карты и ткань для чистки микроволокна. Что касается удобства использования, G7 Plus ThinQ имеет удобные пропорции и не слишком большие размеры.

Высокий дисплей, немного усложняет использование смартфона одной рукой, но вы можете, с помощью жеста уменьшить содержимое, для облегчения доступа. Имеются другие возможности доступа, такие как Floating Bar, который предлагает ярлыки для музыкального проигрывателя, контакты, захват экрана и т. д.

Интерфейс LG G7 ThinQ

Во время этого обзора, наша торговая единица работала на платформе Android 8 Oreo, с исправлением безопасности от 1 июня. ОС Android, на этом устройстве, сильно изменена и мы не можем не сравнить её возможности с устройствами Samsung. В программное обеспечение добавлено множество дополнений, позволяющих вам точно настроить пользовательский интерфейс.

Макет пользовательского интерфейса, можно изменить с однослойного на традиционный макет ящика приложений. Позиции навигационных кнопок можно поменять местами и добавить дополнительные для переключения SIM-карты и т. д.

Приложение Smart Doctor помогает очищать временные файлы и освобождать оперативную память, а игровые инструменты позволяют вам устанавливать разрешение экрана, для каждой игры и предлагать наложение на игру, для отключения предупреждений, снятия скриншотов и т. д.

Смартфон имеет функцию AirDrive, которая, как предполагается, позволит вам управлять файлами, на вашем телефоне, через ваш Mac или ПК. Вам понадобится приложение LG Bridge, на вашем компьютере и вам нужно будет войти в ту же учетную запись, на вашем телефоне и в настольном приложении.

Однако, в отличие от AirDrop от Apple, вы не можете обмениваться файлами, такими как фотографии, непосредственно, из галереи телефона на ваш компьютер. Вместо этого, вам предлагается сделать это, через приложение файлового менеджера.

Мы не смогли просмотреть файлы, на нашем телефоне, через настольное приложение, но мы могли видеть все наши папки, через приложение File Manager. В конце концов, мы редко использовали эту функцию и было проще использовать кабель, для передачи файлов.

Вы также, получаете некоторые предустановленные приложения. Quick Memo + — это приложение для заметок, которое также, синхронизируется с вашей учетной записью Google. Приложение Mobile Switch позволяет переносить данные с вашего старого телефона на G7 Plus ThinQ. Приложение Smart World предлагает кураторский контент, например новости, темы, обои и т. д., а LG Service позволяет записаться на прием в ближайший сервисный центр.

Производительность, камеры и время автономной работы

Тяжелые настройки для Android, могут сначала быть подавляющими, даже для опытных пользователей, но через некоторое время, вы привыкнете к ним. В целом, LG G7 Plus ThinQ работает практически безупречно, с ежедневным использованием.

Интерфейс работает быстро и не увязнет, даже с большим количеством приложений, работающих в фоновом режиме. Качество связи хорошее и телефон не нагревается, при общем использовании. Процессор Snapdragon 845 является проверенным исполнителем, но большинство показателей эталонных тестов, которых прошел этот телефон, были немного ниже, чем у других телефонов на базе этого же процессора. Игры работают отлично, в том числе новые, такие как PUBG и Asphalt 9: Legends.

Телефон, действительно, нагревается во время игр или при длительном использовании камер, но не до такой степени, чтобы его неудобно было держать или это влияло бы на его функциональность.

Варианты цветового исполнения LG G7 Plus ThinQ

Качество звука

Флагманские предложения LG, часто хвалят за хороший звук, а G7 Plus ThinQ ничем не отличается, в этом плане. Функция Quad-DAC присутствует вместе с другими улучшениями звука, такими как DTS:X 3D surround, для проводных наушников.

Входящие в комплект наушники неплохие, обеспечивают достойную шумоизоляцию и хорошее качество звука. Музыкальный проигрыватель, по умолчанию, также имеет некоторые эффектные функции, называемые Flash Light и Boombox Show, которые используют заднюю светодиодную вспышку для эффекта стробоскопа и отображают 3D-визуализацию на экране, соответственно.

Монофонический динамик впечатляюще громкий, что приятно. Дисплей, также поддерживает стандарт HDR 10, который добавляет больше динамизма к цветам при просмотре HDR-видео.

Приложение AI Cam

LG ThinQ AI можно увидеть в действии, в приложении для камеры. При включенном «AI Cam», приложение камеры сканирует кадр и автоматически регулирует экспозицию, цветовую гамму и даже, при необходимости, применит фильтры.

Мы желаем, чтобы у нас была возможность отключить эффекты AI, после съемки и, к счастью, эта функция не слишком навязчива, как на других телефонах, таких как Huawei P20 Pro. Благодаря тесному партнерству LG с компанией Google, G7 Plus ThinQ также получает стикеры AR, от линейки смартфонов Pixel.

Основная 16-мегапиксельная камера имеет диафрагму af / 1.6, а вторая широкоугольная 16-мегапиксельная камера имеет апертуру af / 1.9. Основной датчик фиксирует хорошую детализацию в макро фотоснимках и ландшафтах, наряду с пробивными цветами, а края вокруг предметов могут быть более отчетливыми.

Обзор телевизора LG UM7300

Функция HDR срабатывает автоматически, но мы часто находили, что участки ярких областей оказались переэкспонированными. Широкоугольная камера полезна, при съемке пейзажей или группы людей и искажение ствола здесь не является проблемой.

Образец снимка задней камерой LG G7 Plus ThinQ

Качество снимков и видеозаписи

Детали также хороши, при слабом освещении. Приложение камеры имеет режим Super Bright Camera, который объединяет данные четырех пикселей в один, что дает вам более подробную информацию, но за счет разрешения. Для первичного датчика существует OIS, что помогает сохранять устойчивые снимки, при неблагоприятном свете. Телефон отлично справляется с обнаружением краев, в режиме «Портрет», а размер фонового размытия можно отрегулировать, до и после съемки.

Видеозапись снимается со скоростью 4 K 30 кадров в секунду, но вы не получаете электронную стабилизацию, при этом разрешении. Видеоролики, снятые на 4K, слегка повысили цвета, что наиболее заметно, при съемке с широкоугольным датчиком.

Появились сообщения о том, что LG выпустила обновление, обеспечивающее запись 4K 60 кадров в секунду, на этом телефоне, но наш аппарат, похоже, не получил его. Стабилизация приличная, на скорости 1080p 30 кадров в секунду и фокусировка также, очень быстра, но в кадре заметно мерцание, которого нет, при использовании широкоугольного объектива.

Существует полный ручной режим, который позволяет настраивать параметры звука, такие как усиление и отфильтровывать шум ветра. Вы также, получаете режим замедленного видео, который позволяет снимать со скоростью 240 кадров в секунду, но качество довольно среднее. Режим Cine Video, дает вам довольно крутые фильтры и эффекты кинематографического масштабирования.

Передний 8-мегапиксельный датчик делает хорошие снимки, а функции ИИ работают и здесь, тоже. Нет Auto HDR, хотя и он, не работает хорошо, все время. Стабилизация работает прилично, что хорошо, если вы входите в ведение журнала. При слабом освещении, вы можете использовать экранную вспышку, для улучшения качества изображения.

Батарея

Аккумулятор, емкостью 3000 mAh легко прослужит целый рабочий день, но получить полное 24-часовое использование, немного сложно, особенно если вы играете много. С небольшим количеством потоковой передачи звука Bluetooth, несколькими звонками, использованием приложений для Chrome и обычных сообщений, а также несколькими раундами Asphalt 9: Legends, мы, обычно, достигали около 17 часов работы в среднем, прежде чем мы, вынуждены были подключить зарядное устройство.

Это неплохой результат, но, конечно, хотелось бы лучше. У смартфона есть поддержка Qualcomm Quick Charge 3.0, которая обеспечила нам 42-процентный заряд батареи, примерно через 30 минут. Зарядка телефона занимает всего несколько часов.

Видеообзор

Вердикт

G7 Plus ThinQ — это надежное предложение от LG и, что более важно, он доступен по очень приемлемой цене. Для всех тех, кому не подходит One Plus 6, из-за отсутствия некоторых функций, таких как устойчивость к погодным условиям и беспроводной зарядки, G7 Plus ThinQ — очень хорошая альтернатива. LG предлагает также, более полезную вторичную заднюю камеру, расширяемое хранилище, превосходный монодинамик и яркий, четкий дисплей.

Есть некоторые аспекты телефона, которые, возможно, не понравятся всем. Например, пользовательский интерфейс обладает огромным количеством функций, которые могут быть отпугивающим фактором, распознавание лиц немного медленное, а камеры, хотя и хорошие, имеют некоторые недостающие функции, такие как стабилизация с разрешением 4 КБ и режимы супер-замедленной съемки.

27

LG XBOOM Go PK7 обзор

LG PK7 или LG XBOOM Go — это модный «бумбокс», который идеально подходит как беспроводные колонки, но не стоит этот пластиковый аппарат рассматривать для качественного прослушивания музыки в стерео.

Левчук Александр Николаевич ©

LG XBOOM Go PK7 — это активная акустика для вечеринок, которая имеет световое шоу, громкий звук, защиту от брызг и неплохую автономную работу. Тем не менее, это далеко не компактный и не легкий «апаратец» с перезаряжаемым аккумулятором, 20-часового использования при 50-процентной громкости, возможностями apt-X Bluetooth и прочным, брызгозащищенным корпусом, он, безусловно. Идеально подходит для встреч у бассейна и небольших домашних вечеринок. Зарядка аккумулятора займет почти 4 часа, поэтому лучше оставить его заряжаться на ночь.

Смею заверить, что мне LG XBOOM Go PK7 не отправляли на обзор, тест какие-либо компании или фирмы в качестве рекламы и т.д. Я не имею никакого отношения с компанией LG или их магазинами, и этот обзор основан на моём личном мнении и опыте. 

LG XBOOM Go PK7

LG XBOOM Go PK7 можно купить по цене 11000 руб

Дизайн/функции/корпус

Первое слово, которое приходит на ум, когда я смотрю на PK7, — «прикольный, модный». LG XBOOM Go сделан из твердого текстурированного пластика с рукояткой сверху и зеркально отраженной одной снизу, на которую опирается само устройство.

В верхней части устройства вы найдете толстые прорезиненные кнопки для включения питания, регулировки громкости и многого другого, включая Google Assistant через подключенный телефон.

Вокруг задней панели находится закрытый отсек для портов с разъемами для зарядки, проводным звуком через разъем 3,5 мм и кнопкой сброса.

LG XBOOM Go PK7 порты

Это прочный «бумбокс», который соответствует предполагаемой универсальности, и может проводить много времени на улице. Кстати, PK7 является водостойким по стандарту IPX5, что означает.

Список функций является довольно стандартным для беспроводных колонок — Bluetooth apt-X HD и 3,5-мм гнездо Aux-In, но есть пара дополнительных возможностей, которые LG PK7 выделяют из множество аналогичных.

LG объединилась с Meridian Audio, более известным своими высококачественными аппаратами в попытке получить наилучшее звучание от «бумбокса», двух твитеров и двух пассивных излучателей в боках, которые должны дать больше НЧ.

LG Go PK7

Таким образом, у PK7, появились настройки от Меридиана: «Чистый вокал» или «Улучшенный бас». Другие дополнительные немного менее обычны.

Световое шоу

LG попыталась привнести немного света в PK7. При нажатии на одну из кнопок в верхней части устройства, и вы получите доступ к функции «Beat Lighting». Это заставляет аппарат мигать импульсами света. Вы можете выбрать между «Вода» (синий), «Лес» (желтый) и «Вечеринка» (цвета радуги). Или, конечно, есть кнопка выкл.

Хотя функция Beat Lighting поначалу довольно забавная, но мигание разноцветных огоньков не более чем развлечение для дискотек на свежем воздухе.

LG PK7 купить

Дополнительные функции включают в себя возможность сопряжения двух устройств для запуска ваших композиций в стерео или усиленном моно. Впрочем, у LG PK7 есть возможность принимать звонки со смартфона, общаться с устройством с помощью голосовых команд и использовать фирменное приложение Music Flow от LG (для устройств Android).

ЦАП и усилитель для наушников недорого

Прослушивание/впечатления

Еще раз подчеркну, LG XBOOM Go – это не более чем модный «бумбокс», который идеально подходит как беспроводные колонки, и не стоит этот пластиковый аппарат рассматривать для качественного прослушивания музыки в стерео.

PK7, несомненно, выдает громкий звук. Тем не менее, ему не хватает мощи, он вполне может наполнить звуком малую и среднюю комнату громкой музыкой до 20м2. Однако, не стоит рассчитывать на этот «бумбокс» для создания больших вечеринок!

LG XBOOM PK7

LG PK7 способен обеспечить громкий бас. Но в этом аппарате есть свои минусы, к примеру, есть «Enhanced Bass» нажав на кнопку, мы получаем непонятный сумбур, низкие частоты становятся более грязными – трудно разобрать. Мы оставили этот вариант в покое.

Clear Vocal, с другой стороны, безусловно, имеет свое место. И этот эффект довольно очевиден, со средним диапазоном. Однако и в этой области звукового спектра также может проявиться небольшая резкость в СЧ, поэтому вам нужно быть осторожным, но стоит поэкспериментировать с разными треками, чтобы найти ваши предпочтения.

LG XBOOM Go PK7 кнопки

Итоги

LG PK7 хорош как для небольших вечеринок, так и для походов. Если вам нужен громкий звук, который будет обеспечивать его в течение длительного времени, то LG XBOOM Go PK7 — это именно то, что вам нужно. Кроме того, он может работать как громкая связь, он водостойкий и достаточно прочный, поэтому его можно брать практически везде.

Хотя JBL Pulse 3 предлагает такой же по цене «бумбокс», но он не может выдавать столько энергии и света.

ЦАП +усилитель для наушников

Наиболее очевидной особенностью Go PK7 должно быть световое шоу. В отличие от большинства беспроводной акустики Bluetooth, в этом устройстве есть светодиоды, которые мигают, пульсируют и меняют цвет во время музыки. Идея состоит в том, чтобы добавить в громкую музыку свет. Веселье для вечеринки, но на самом деле это выглядит модно и устарело. Тем не менее, есть приложение, по крайней мере на Android, которое позволяет вам поиграть с настройками освещения для изменений, которые могут лучше соответствовать вашему настроению.

LG XBOOM Go PK7 сертифицирован по классу IPX5 и является водонепроницаемым в той степени, в которой он будет хорошо противостоять брызгам у бассейна или небольшому количеству дождя. Только не бросайте его в ванну или бассейн.

LG PK7

PK7 является относительно доступным устройством для всех предлагаемых функций, особенно по сравнению с конкурентами более высокого класса. С отличным временем автономной работы аккумулятор прослужит вам до 20 часов. Конечно, громкий звук и свет который потребляет дополнительную энергию и «посадит» быстрее батарею, но в целом XBOOM Go PK7 будет работать в течение всего рабочего дня. Идеально подходит для вечеринок на открытом воздухе. 

LG XBOOM Go не идеален, но его недостатки будут простительны. Если вам нужен прочный аппарат с внешностью блондинки, который вы можете вынести на улицу без беспокойства, то рекомендую.

 

LG XBOOM Go PK7

Если вы являетесь производителем, импортером, дистрибьютором или агентом в области воспроизведения звука и хотели бы связаться с нами, пожалуйста, свяжитесь со мной в ВК или по эл. почте: anl555@bk.ru

Вам нужен хороший усилитель для наушников, новый ламповый усилитель или отличный ЦАП, плеер, наушники, АС или другая звуковая техника, (усилитель, ресивер и т.д.) то пишите в ВК, помогу выгодно и с гарантией  приобрести хорошую звуковую технику…

По всем вопросам Пишите мне на эл. почту: anl555@bk.ru или ВК https://vk.com/zvukomaniyak или https://ok.ru/aleksandr.levchuk2 

Не забывайте сохранять нас в закладках! (CTRL+SHiFT+D)

научных журналов — AAAS

% PDF-1.4 % 163 0 объект >>> эндобдж 165 0 объект > / Шрифт >>> / Поля [] >> эндобдж 164 0 объект > эндобдж 131 0 объект > поток Библиотека Adobe PDF 15.0False2018-11-22T20: 08: 02 + 08: 002018-12-12T10: 23: 38-08: 002018-12-12T10: 23: 38-08: 00Adobe InDesign CC 2017 (Windows) uuid: 0181c3c9 -1dd2-11b2-0a00-1e00b8da97ffxmp. did: f4fd3488-9b3f-9d45-a5a3-8a4b2d55f952xmp.id: 4148c8c7-d3d3-c649-92fb-14528b2fa086proof-pdfxmp.14480-646mp.b201b3d3d3e3-643-646e6-646e-64-64-64-64a-64a-64a-64a-a2-64a-64a-a2-64a-a2a-64a-a2-64a-a2сделал: 3c1a44db-b4cf-7e40-805f-12478d22c8a0xmp.did: f4fd3488-9b3f-9d45-a5a3-8a4b2d55f952default

преобразовано из приложения / x-indesign в приложение / pdfAdobe InDesign 2017: (Windows 02-22 CC): CC-11 +08: 00

application / pdf

Научные журналы — AAAS

конечный поток эндобдж 150 0 объект > эндобдж 61 0 объект > эндобдж 29 0 объект > эндобдж 86 0 объект > эндобдж 83 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 84 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 87 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 95 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 88 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 97 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 89 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 105 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 90 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / Properties> / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 107 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 91 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 123 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 92 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 125 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 93 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 127 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 94 0 объект > / ExtGState> / Font> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject >>> / Rotate 0 / Thumb 129 0 R / TrimBox [0 0 594 756] / Type / Page >> эндобдж 188 0 объект > / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject >>> / Type / Page >> эндобдж 219 0 объект [224 0 R 225 0 226 0 R 227 0 R] эндобдж 220 0 объект > поток q 181. 5 0 0 23,5 72 660,5 см / Im0 Do Q BT / T1_0 1 Тс 10 0 0 10 72 620 тм (Нейтрофилы: новые идеи и открытые вопросы) Tj ET BT / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 72 607 тм (Клаус Лей, Хэл М. Хоффман, Пол Кубес, Марко А. Кассателла, Артуро Зихл \ insky, Кэтрин К. Хедрик и Серджио Д. Кац) Tj ET BT / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 72 560,99997 тм (DOI: 10.1126 / sciimmunol.aat4579) Tj 6,89099 1 тд (, eaat4579.) Tj / T1_0 1 Тс -0,556 0 Тд (3) Tj / T1_2 1 Тс -6.33499 0 Тд (Sci. Immunol. \ 240) Tj ET BT / T1_0 1 Тс 6 0 0 6 79 491 тм (СТАТЬЯ ИНСТРУМЕНТЫ) Tj ET BT 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 187 489 тм (http: // иммунология.sciencemag.org/content/3/30/eaat4579)Tj ET BT 0 г / T1_0 1 Тс 6 0 0 6 79 455 тм (ССЫЛКИ) Tj ET BT 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 187 444,99997 тм (http://immunology.sciencemag.org/content/3/30/eaat4579#BIBL)Tj 0 г 0 1 ТД (В этой статье содержится 101 статья, 39 из которых вы можете получить бесплатно) Tj ET BT 0 0 1 рг / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 193,38391 128 тм (Условия использования) Tj 0 г -15.17299 0 Тд (Использование этой статьи регулируется) Tj ET 72 114 кв. м. 522 114 л 0 0 мес. S BT ET BT / T1_1 1 Тс 8 0 0 8 72 77.99991 тм (зарегистрированная торговая марка AAAS.) Tj 53.40895 1 тд (is) Tj / T1_2 1 Тс -9.28099 0 Тд (Наука иммунология) Tj / T1_1 1 Тс -44.12796 0 Td (Ассоциация содействия развитию науки. Нет претензий к оригиналу U.S. Go \ Вернмент Работы. Название) Tj 0 1.00001 TD (New York Avenue NW, Вашингтон, округ Колумбия, 20005. 2017 \ 251 Авторы, некоторые ри \ ghts зарезервированы; эксклюзивный лицензиат American) Tj 9,55899 1 тд (\ (ISSN 2470-9468 \) опубликован Американской ассоциацией адва \ Цемент Науки, 1200) Tj / T1_2 1 Тс -9.55899 0 Тд (Наука иммунология) Tj ET BT / T1_1 1 Тс 0-8 8 0 576 341.1b. ٿ & S # Cʞ wGx’5

»Заявление LJI о разнообразии и инклюзивности

Совет директоров и руководство Института иммунологии Ла-Хойя привержены делу поощрения, развития и сохранения культуры разнообразия и инклюзивности.

Наши сотрудники — наш самый ценный актив. Коллективная сумма индивидуальных различий, жизненного опыта, знаний, изобретательности, инноваций, самовыражения, уникальных способностей и таланта, которые наши сотрудники вкладывают в свою работу, представляет собой значительную часть не только нашей культуры, но и нашей репутации и достижений Института.

Мы принимаем и поощряем различия наших сотрудников по происхождению, возрасту, цвету кожи, инвалидности, этнической принадлежности, семье или семейному положению, полу, гендерной идентичности или самовыражению, генетической информации, языку, состоянию здоровья, национальности, физическим и умственным способностям, политической принадлежности. , раса, религия или вероисповедание, пол, сексуальная ориентация, социально-экономический статус, военный статус или статус ветерана и другие характеристики, которые делают наших сотрудников уникальными.

Приверженность института Ла-Холья к разнообразию и вовлечению применима — но не ограничивается — к нашей практике и политике по найму и отбору; компенсации и льготы; профессиональное развитие и обучение; Акции; переводы; социальные и развлекательные программы; увольнения; прекращения; и постоянное развитие рабочей среды, основанной на предпосылке справедливости, которая поощряет и поддерживает:

• Уважительное общение и сотрудничество между всеми сотрудниками.
• Работа в команде и участие сотрудников, позволяющая представлять все группы и точки зрения сотрудников.
• Баланс работы и личной жизни за счет гибкого графика работы, позволяющего учесть различные потребности сотрудников.
• Вклад работодателей и сотрудников в сообщества, которым мы служим, чтобы способствовать большему пониманию и уважению разнообразия.
• Обучение и разъяснительная работа по повышению разнообразия без предвзятости и дискриминации.

Все сотрудники La Jolla Institute обязаны всегда относиться к другим с достоинством и уважением.Ожидается, что все сотрудники будут демонстрировать поведение, отражающее вовлеченность во время работы и на рабочих функциях, на рабочем месте или за его пределами. Сотрудникам, которые считают, что они подвергались любому обращению, которое противоречит приверженности компании принципам разнообразия и инклюзивности, следует обращаться за помощью в отдел кадров.

Оценка иммунологической памяти к SARS-CoV-2 на срок до 8 месяцев после заражения

Рис. 5 Взаимосвязь иммунной памяти.

( A ) Взаимосвязь между полом и скачком титров IgG с течением времени.Мужчины: предпочтительная модель линейного распада, t _1/2 = 110 дней; 95% ДИ: от 65 до 349 дней, R = -0,27, p = 0,0046. Самки: предпочтительная модель линейного распада, т _1/2 = 159 дней; 95% ДИ: от 88 до 846 дней, R = -0,22, p = 0,016. ANCOVA p = 0,00018. Тест на однородность регрессий F = 1,51, p = 0,22. ( B — E ) Иммунная память через 120+ дней PSO у негоспитализированных и госпитализированных субъектов с COVID-19.Цвета символов представляют пик тяжести заболевания (белый: бессимптомный, серый: легкая, синий: умеренный, красный: тяжелый). Для субъектов с несколькими временными точками выборки для этих анализов использовалась только последняя временная точка. (B) Титры связывания Spike-специфического IgG (слева) и RBD-специфического IgG (справа). n = 64 (не госпитализированы), n = 10 (госпитализированы). U-тесты Манна-Уитни. (C) Частота В-клеток памяти, специфичных для спайка (слева) и RBD (справа) через 120+ дней PSO. n = 66 (не госпитализированы), n = 10 (госпитализированы).U-тесты Манна-Уитни. (D) Частота общих SARS-CoV-2-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток (слева) и спайк-специфичных CD8 ⁺ Т-клеток (справа). p = 0,72 для общего SARS-2-CoV, p = 0,60 для спайков по U-тесту Манна-Уитни. n = 72 (не госпитализированы), n = 10 (госпитализированы). (E) Частота общего количества SARS-CoV-2-специфичных CD4 ⁺ Т-клеток (слева) и спайк-специфичных CD4 ⁺ Т-клеток (справа). р = 0.23 для общего SARS-CoV-2, p = 0,24 для спайков по U-тесту Манна-Уитни. ( F ) Иммунная память к SARS-CoV-2 во время ранней фазы (1-2 месяца, черная линия), средней фазы (3-4 месяца, красная линия) или поздней фазы (5-8 месяцев, синяя линия) ). Каждому индивидууму присваивался балл 1 для каждого ответа выше LOS для RBD IgG, spike IgA, RBD-специфических В-клеток памяти, SARS-CoV-2-специфичных CD4 ⁺ Т-клеток и SARS-CoV-2– специфические CD8 ⁺ Т-клетки, дающие максимум пять компонентов иммунной памяти SARS-CoV-2.В анализ были включены только выздоравливающие пациенты с COVID-19 со всеми пятью исследованными иммунологическими параметрами. n = 78 (от 1 до 2 месяцев), n = 52 (от 3 до 4 месяцев), n = 44 (от 5 до 8 месяцев). ( G ) Точечные графики в процентах, показывающие частоты (нормализованные до 100%) субъектов с указанными компонентами иммунной памяти, как описано в (B), в течение ранней (1-2 месяца) или поздней (5-8 месяцев) фазы. G, RBD-специфический IgG; B — специфичные для RBD В-клетки памяти; 4 — Т-клетки CD4 ⁺ , специфичные для SARS-CoV-2; 8, Т-клетки CD8 ⁺ , специфичные для SARS-CoV-2; A, спайк-специфический IgA. n = 78 (от 1 до 2 месяцев), n = 44 (от 5 до 8 месяцев). ( H ) Отношения между отделами иммунной памяти у субъектов с COVID-19 с течением времени в виде соотношений (полные кривые и данные, показанные на рис. S10, от B до F). AU, условные единицы, в масштабе рис. S10, от B до F; B: соотношение IgA, RBD-специфических В-клеток памяти к пиковым антителам IgA; B: IgG, отношение В-клеток памяти к RBD и антителам IgG к RBD; B: соотношение CD4, RBD-специфических В-клеток памяти к SARS-CoV-2-специфическим CD4 ⁺ Т-лимфоцитов; CD4: CD8, SARS-CoV-2-специфические CD4 ⁺ отношение Т-клеток к SARS-CoV-2-специфическим CD8 ⁺ Т-лимфоцитов; CD4: IgG, SARS-CoV-2-специфическое соотношение CD4 ⁺ Т-клеток к RBD IgG-антителам.

Иммунологическая память к SARS-CoV-2, оцененная на срок до 8 месяцев после заражения

Иммунная память вируса SARS-CoV-2 имеет важное значение для определения эффективности и продолжительности действия любых одобренных вакцин от болезни COVID-19.

Подробные, всесторонние и информативные результаты исследования группы экспертов относительно иммунной памяти к вирусу в 254 образцах из 188 вылеченных случаев COVID-19 в США, включая 43 образца через 8 месяцев после заражения, дают больше точная индикация продолжительности иммунной памяти, чем для более коротких периодов времени.

Результаты исследования основаны на оценке различных компонентов вируса, в том числе различных типов клеток, а также различной степени тяжести заболевания, с целью изучения долговечности защиты от повторного заражения вирусом COVID-19.

Принимая во внимание отсутствие определенных механизмов долгосрочного защитного иммунитета у людей, важные результаты предполагают, что Т-клеточная память может достичь более медленной фазы распада после первых 8 месяцев после инфицирования, хотя часть инфицированного населения с низкая иммунная память может пострадать от повторного заражения.

Устойчивый иммунитет, чтобы приблизиться к коллективному иммунитету, потребует, чтобы значительная часть населения была инфицирована и / или вакцинирована против болезни, что будет зависеть от продолжительности иммунной памяти.

Проблема, заслуживающая внимания в дальнейших исследованиях, — это влияние мутировавших штаммов вируса, например, из Великобритании и Южной Африки, и, возможно, из Испании и других стран, о . ..

Подробнее

Иммунная память SARS- Вирус CoV-2 необходим для определения эффективности и продолжительности действия любых одобренных вакцин от болезни COVID-19.

Подробные, всесторонние и информативные результаты исследования группы экспертов относительно иммунной памяти к вирусу в 254 образцах из 188 вылеченных случаев COVID-19 в США, включая 43 образца через 8 месяцев после заражения, дают больше точная индикация продолжительности иммунной памяти, чем для более коротких периодов времени.

Результаты исследования основаны на оценке различных компонентов вируса, в том числе различных типов клеток, а также различной степени тяжести заболевания, с целью изучения долговечности защиты от повторного заражения вирусом COVID-19.

Принимая во внимание отсутствие определенных механизмов долгосрочного защитного иммунитета у людей, важные результаты предполагают, что Т-клеточная память может достичь более медленной фазы распада после первых 8 месяцев после инфицирования, хотя часть инфицированного населения с низкая иммунная память может пострадать от повторного заражения.

Устойчивый иммунитет, чтобы приблизиться к коллективному иммунитету, потребует, чтобы значительная часть населения была инфицирована и / или вакцинирована против болезни, что будет зависеть от продолжительности иммунной памяти.

Проблема, заслуживающая внимания в дальнейших исследованиях, — это влияние мутировавших штаммов вируса, например, из Великобритании и Южной Африки, и, возможно, из Испании и других стран, на продолжительность иммунной памяти и эффективность любых одобренных вакцин.

Показать меньше

Психометрические свойства индикатора суждения о лидерстве

Психологические исследования и управление поведением 2013: 6

отправить рукопись | www.dovepress.com

Dovepress

Dovepress

120

Faraci et al

Для каждого сценария респондентов просят оценить качество

четырех способов разрешения ситуации, используя

пять балльная шкала Лайкерта (1, совершенно неуместно; 5, очень

уместно). Процедура подсчета баллов дает два типа

баллов: оценка суждения, т. Е. Насколько хорошо люди способны

оценить наиболее эффективный стиль лидерства как наиболее подходящий —

, и балл предпочтения, т. Е. Частота с который

человек, завершивший LJI, одобрил 4 (соответствующие)

или 5 (очень подходящие) рейтинги, тем самым раскрывая степень до

, в которой человек принимает определенную стратегию лидерства.

Анализ данных

После прямого и обратного перевода психологические свойства метрики

LJI были оценены на основе собранных данных

.Надежность внутренней согласованности была рассчитана с использованием

альфа Кронбаха. Валидность, связанная с критериями, включала анализ

дисперсии средних общих суждений LJI в группах менеджмента

, исследованных в порядке старшинства. Также были изучены корреляции

между оценками предпочтений, отражающие тенденцию использовать каждые

из четырех подстилей управления.

Результаты

Демография участников

Всего участников 53.8% мужчин и 46,2% женщин, при этом средний возраст

составлял 44,68 ± 9,3 (диапазон 24–75) лет. Что касается старшинства

, то управленческие группы были разделены на руководителей

(21,3%), старших менеджеров (37,9%), работодателей

(35,5%) и консультантов по менеджменту (5,3%) (см. Диаграмму 2).

Среднее количество скоординированных людей составило 11,79 ± 19,3 и

, их среднее количество лет, проработанных в их организации, составило

13,61 ± 9,5 (диапазон 0–44).

Надежность внутренней согласованности

Внутренняя согласованность LJI с точки зрения коэффициента альфа

составила 0,66. Надежность теста связана с корреляцией

между наблюдаемым баллом и истинным баллом; квадратный корень

из коэффициента надежности является довольно близкой оценкой

этой корреляции, если размер выборки превышает

около 200,7. Надежность LJI оценивалась на основе выборки

из 299 менеджеров в различных регионах. уровни.Таким образом, корреляция между оценками наших участников и их истинным уровнем суждения о лидерстве

составляет 0,81.

Критерийная валидность

Чтобы определить валидность, связанную с критерием, мы связали

баллов LJI с реальной мерой.

участников были разделены на управленческие группы, ранжированные в порядке старшинства. Ожидается, что

старшие менеджеры будут иметь более высокие баллы

LJI, чем младшие менеджеры, на основании как большего опыта

, так и более строгих процессов отбора для их трудоустройства

.В таблице 1 показаны общие оценки LJI

, полученные каждой профессиональной группой. На основании анализа дисперсии

средние оценки различных групп кажутся разными в прогнозируемом направлении. Как и ожидалось, результаты

указывают на то, что группы различались по своим показателям на

LJI, с постепенным снижением оценок от менеджеров с самым высоким —

до менеджеров с самым низким рейтингом

[F (4, 269 ) = 6.60, P, 0,001].

Корреляции между стилями LJI

В таблице 2 показаны корреляции, полученные между оценками предпочтения

, которые отражают тенденцию к использованию каждого из четырех стилей управления

. Согласно нашим результатам, как директивный, так и консультативный стили

(r = 0,219, P, 0,01) и

консультативный и консенсуальный стили (r = 0,233, P, 0,01)

показали умеренную положительную корреляцию. Отрицательная, хотя

значимо низкая корреляция была обнаружена между консультационным и делегативным стилями (r = -0.187, P, 0,01) и между

директивным и согласованным стилями (r = -0,188, P, 0,01) и

была обнаружена меньшая, но все же значимая положительная корреляция

между тенденцией к использованию делегативного и согласованного

стиля (r = 0,128, P, 0,05). Не было обнаружено корреляции между тенденцией

к использованию делегативного и директивного стилей.

Неблагоприятное воздействие

Чтобы проверить наличие неблагоприятного воздействия, средняя общая производительность судна —

161 мужчины сравнивалась с показателями

138 женщин.Средняя общая оценка суждения для мужской выборки

составила 0,59 ± 0,30, а средняя общая оценка суждения

для женской выборки составила 0,58 ± 0,31. Таким образом, разница между

этих групп составляет примерно 0,04, что на самом деле очень мало. Результаты t-теста для независимых выборок

[t (276) = 0,287, P = 0,774] не выявили статистически значимой разницы

в результатах тестов между мужчинами и женщинами.

Представление баллов

На рисунке 3 показано среднее предпочтение участников в лидерстве

балла.На рисунке 4 представлена ​​картина среднего лидерства

Таблица 1 Описательный индикатор суждения о лидерстве Общее суждение

балла для каждой группы менеджеров

Среднее значение занятости SD SE

Исполнительные менеджеры 0,66 0,29 0,04

Старшие менеджеры 0,59 0,29 0,03

Работодатели 0,54 0,30 0,03

Консультанты по вопросам управления 0,30 0,30 0,08

Сокращения: SD, стандартное отклонение; SE, стандартная ошибка среднего.

Взаимодействие моноцитов и Т-лимфоцитов при серьезности COVID-19

ВВЕДЕНИЕ

Пандемия коронавирусного заболевания 2019 г. (COVID-19), вызванная SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2), в настоящее время затронула более 13 человек. миллиона человек и унесло более 580 000 жизней.Клинические проявления COVID-19 различаются: у некоторых людей симптомы проявляются от легких до тяжелых, а у других симптомы отсутствуют. Тяжелые случаи связаны с острым респираторным дистресс-синдромом, который требует госпитализации и искусственной вентиляции легких ( 1 ). COVID-19 также обычно связан с повышенным риском сердечно-сосудистых событий, таких как тромбоз ( 1–4 ), тромбоэмболия легочной артерии ( 3, 4 ) и инсульт ( 3, 4 ), особенно у пациентов в критическом состоянии. .Сопутствующие заболевания, такие как диабет, гипертония, респираторные заболевания и возраст (> 65 лет), часто встречаются в тяжелых случаях ( 1, 5–9 ) и ухудшают прогноз ( 5, 8, 10 ). Таким образом, улучшенное лечение COVID-19 требует более глубокого понимания неоднородности иммунных ответов на инфекцию SARS-CoV-2 и клеточных субпопуляций, которые управляют этими процессами.

Периферическое воспаление связано с развитием тяжелой формы COVID-19 ( 11 ), а вторичные иммунные механизмы могут регулировать прогрессирование заболевания ( 12 ).Моноциты — это миелоидные клетки, которые регулируют врожденный иммунный ответ на вирусную инфекцию, и традиционно классифицируются как CD14 ⁺ CD16 ^— (классический), CD14 ^lo CD16 ⁺ (неклассический) и CD14 ⁺ CD16 ⁺ (средний). Экспансия CD14 ⁺ HLA-DR ^lo , CD14 ⁺ CD16 ⁺ и иммуносупрессивных незрелых моноцитов была продемонстрирована в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) от тяжелобольных пациентов с COVID-19 ( 11, 13 , 14 ).У пациентов с легкими формами COVID-19 наблюдается повышенное содержание CD14 ⁺ HLA-DR ^hi CD11c ^hi воспалительных моноцитов ( 14 ). Т-клетки представляют собой лимфоциты, которые координируют адаптивные иммунные ответы на вирусные инсульты и раздваиваются на подмножества CD4 ⁺ (хелперы) и CD8 ⁺ (цитотоксические). Активация периферических субпопуляций CD8 ⁺ и CD4 ⁺ Т-клеток неоднородна среди пациентов с COVID-19 ( 15 ). Количество циркулирующих Т-клеток также значительно снижается в умеренных и тяжелых случаях, при этом особенно страдают CD8 ⁺ Т-клетки ( 15–17 ).Тем не менее, поскольку существуют противоречивые сообщения об экспрессии маркеров истощения на Т-клетках во время болезни ( 15, 18–20 ), события, контролирующие это истощение, неизвестны. Углубленное профилирование миелоидных и Т-клеточных популяций пациентов с COVID-19 может позволить исследовать эти процессы, идентифицировать другие клеточные подмножества, измененные во время болезни, и корреляцию клеточных фенотипов с клиническими параметрами.

Здесь мы используем цитометрию по времени пролета (CyTOF) для оценки миелоидной и Т-клеточной гетерогенности в PBMC от легких до тяжелых пациентов с COVID-19.Мы использовали эти данные, чтобы охарактеризовать взаимодействие между этими двумя типами клеток в степени тяжести заболевания. В частности, мы идентифицируем уникальные субпопуляции моноцитов и Т-клеток и обнаруживаем, что их относительное количество по-разному коррелирует с интенсивностью заболевания и клиническими факторами. Таким образом, наша работа подчеркивает нарушения как в моноцитах, так и в Т-лимфоцитах как ответ на COVID-19, и предполагает взаимодействие между этими двумя типами иммунных клеток во время болезни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глобальные изменения в составе иммунных клеток и ответах на COVID-19

PBMC были получены из крови 30 пациентов с COVID-19 во время выздоровления и проанализированы с помощью масс-цитометрии (рис.1А). Легко больные пациенты (n = 8) были медицинскими работниками с положительным результатом на SARS-CoV-2 и заболели COVID-19, но не нуждались в госпитализации. Группы пациентов со средней (n = 13) и тяжелой (n = 9) COVID-19 нуждались в госпитализации, а тяжелобольные пациенты нуждались в госпитализации в отделение интенсивной терапии (рис. 1B). Демографические данные пациентов подробно описаны в разделе «Методы». Клинические данные были получены для пациентов с заболеваниями средней и тяжелой степени, находящихся в больнице, и у всех пациентов в обеих группах имелся клинически определяемый воспалительный синдром.У нас мало клинической информации о лицах с COVID-19 в легкой форме, поскольку они не были госпитализированы. Таким образом, целью нашего исследования было определить, какие нарушения иммунной системы различают умеренные и тяжелые случаи COVID-19.

Рис. 1. Экспериментальная схема профилирования фенотипов моноцитов и Т-клеток у выздоровевших пациентов с COVID-19.

Иммунопрофилирование моноцитов и Т-клеток было выполнено с помощью массовой цитометрии в пределах PBMC от легких (= 8), умеренных (n = 13) и тяжелых (n = 9) лиц (A).Обзор когорты пациентов с указанием возраста, пола, тяжести COVID-19, госпитализации, со всеми лицами, привязанными ко времени сбора образца ( B ). Графики в виде прямоугольников и усов для подсчета лейкоцитов ( C ), лактатдегидрогеназы (LDH, D ), ферритина ( E ), C-реактивного белка (CRP, F ), гемоглобина ( G ) , альбумин ( H ), D-димер (I) и международное нормализованное соотношение (INR, J) у лиц со средней (n = 13) и тяжелой (n = 8) степенью.Лейкоциты CD45 ⁺ были сгруппированы и спроецированы на UMAP, и была исследована экспрессия CD4 ( K ), CD8 (L), CD14 ( M ) и CD16 ( N ), что привело к 9 иммунным популяциям. (0). Статистическую значимость рассчитывали с использованием критерия Манна-Уитни.

Тяжелобольные пациенты показали статистически значимое увеличение общего количества лейкоцитов (рис. 1C; * p = 0,013), лактатдегидрогеназы (LDH, рис. 1D; *** p = 0,0004), ферритина (рис.1E; * p = 0,049 ) и С-реактивный белок (CRP; ** p = 0 0,0086; рис. 1F) по сравнению с пациентами средней степени тяжести. Уровни гемоглобина (рис. 1G; ** p = 0,0018) и альбумина (рис. 1H; ** p = 0,0065) были ниже при тяжелом течении болезни. Пациенты с тяжелым поражением также имели более высокие уровни D-димеров в плазме (рис. 1I; *** p = 0,0001) и международное нормализованное отношение (INR), рассчитанное по протромбиновому времени (рис. 1J; *** p = 0,0002). ). Количество тромбоцитов также увеличивалось при тяжелом течении болезни (рис.S1A). Хотя эти последние данные о количестве тромбоцитов не достигли статистической значимости, как D-димеры и МНО, они согласуются с сообщениями об увеличении числа случаев свертывания крови у пациентов с COVID-19 ( 9 ). Уровни насыщения кислородом также были значительно снижены у тяжелобольных пациентов (рис. S1B; ** p = 0,003). Соотношения нейтрофилов: лимфоцитов и нейтрофилов: моноцитов не изменились, хотя наблюдалась тенденция к увеличению количества нейтрофилов у тяжелобольных пациентов (рис.S1C-D). Точно так же соотношение моноцитов: лимфоцитов осталось неизменным (рис. S1E). Сопутствующие заболевания у госпитализированных пациентов с COVID-19 были в основном сердечно-сосудистыми и включали инфаркт миокарда и гипертензию в анамнезе (см. Методы).

Используя панель CyTOF с 41 маркером, направленную на выявление изменений моноцитов и Т-лимфоцитов при COVID-19 (рис. S1F), мы сначала оценили глобальные изменения иммунных клеток у пациентов, стратифицированных по тяжести заболевания. Затем мы использовали FlowSOM, метод беспристрастной кластеризации ( 21 ), наряду с метакластеризацией и консенсусной кластеризацией (см. Методы), чтобы идентифицировать 9 основных типов иммунных клеток, спроецированных на график аппроксимации и проекции унифицированного многообразия (UMAP) ( 22 ), оценивая маркеры для обычных типов Т-клеток и моноцитов (рис.1К-О; инжир. S2). UMAP уровней экспрессии всех маркеров, используемых для идентификации каждой субпопуляции иммунных клеток CD45 ⁺ , можно найти на дополнительном рисунке 2. Частоты всех основных типов иммунных клеток, идентифицированных в воротах CD45 ⁺ для слабой (зеленый), умеренной ( синий) и тяжелобольных (красный) больных COVID-19 (рис. S1G, H). В частности, мы идентифицировали клетки CD8 ⁺ , CD4 ⁺ , а также двойные положительные / отрицательные (DN / DP) и CD56 ⁺ клетки в компартменте Т-клеток (рис.S1G; Рис. 1К, L; инжир. S2). Другими основными типами клеток были дендритные клетки (DC), естественные клетки-киллеры (NK), клетки CD123 ⁺ (вероятно, плазмацитоидные дендритные клетки (pDC)) и моноциты (рис. S1H) с использованием комбинаций маркеров экспрессии CD14 (рис. 1M). , CD16 (фиг. 1N), HLA-DR, CD1c и CD123 (фиг. S2). Поскольку наше исследование было сосредоточено на моноцитах / DC и T-клетках, маркеры эозинофилов, нейтрофилов и B-клеток, присутствующие в PBMC, были помещены в один и тот же канал для исключения (CD19 / Siglec8 / CD66b). Мы наблюдали небольшое снижение частот CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-лимфоцитов у пациентов с тяжелой формой COVID, что согласуется с предыдущими отчетами ( 15, 16, 23–26 ) (рис.S1G). Мы также обнаружили значительное увеличение общей частоты моноцитов, стратифицированных по тяжести заболевания, и аналогичную тенденцию для CD1c ⁺ CD11c ^hi DC (рис. S1H).

Классическая неоднородность моноцитов при COVID-19

Гетерогенные фенотипы миелоидных клеток наблюдались у пациентов с COVID-19 ( 13 ), но неизвестно, как эти фенотипы продиктованы заболеванием SARS-CoV-2. Мы разработали панель CyTOF для углубленного изучения гетерогенности моноцитов и DC, как мы это делали в нашей работе по профилированию иммунных клеток во время атеросклероза ( 27 ).Все моноциты и DC, идентифицированные на рисунке 1C, были повторно кластеризованы и спроецированы на новый UMAP для получения подробного ландшафта миелоидной гетерогенности (фиг. 2A; фиг. S3). Используя кластеризацию FlowSOM и метакластеризацию для объединения подмножеств этих миелоидных клеток, мы идентифицировали 10 кластеров, содержащих моноциты и DC, в нашей когорте COVID-19. К ним относятся 1 кластер DC, четыре кластера CD14 ⁺ классических моноцитов (cMo), 1 кластер CD14 ⁺ CD16 ⁺ промежуточных моноцитов (iMo) и 2 кластера CD14 ^lo CD16 ⁺ неклассических моноцитов (nMo). (Рисунок.2А). Мы также наблюдали 2 новых субпопуляции моноцитов, присутствующих в крови пациентов с COVID-19: CD14 ⁺ CD16 ⁺ CD56 ⁺ (CD56 ⁺ ) моноциты и CD14 ⁺ CD3 ⁺ (CD3 ⁺ ). ) моноцитов (рис. 2A / C). Моноциты CD56 ⁺ обладают цитотоксическими NK-подобными характеристиками и были идентифицированы у мышей ( 28 ). Связанная подгруппа CD14 ⁺ CD56 ⁺ , которая лишена CD16 и обладает высокой фагоцитарностью, была описана у людей ( 29 ).Также были идентифицированы моноциты CD3 ⁺ , и мы подтвердили, что это не дублеты или агрегаты клеток (данные не показаны). Экспрессия маркеров CyTOF, присутствующих в каждом кластере миелоидных клеток, показана на тепловой карте на рисунке 2B. Мы также заметили, что обогащение каждого кластера варьировалось между пациентами; однако все пациенты обладали всеми кластерами (рис. 2С). Классический кластер моноцитов cMo1 увеличивался как в умеренных, так и в тяжелых случаях по сравнению с легкими случаями (рис. 2D). Кроме того, классический кластер моноцитов cMo3 имел тенденцию к увеличению численности как при умеренном, так и при тяжелом заболевании по сравнению с легким заболеванием (рис.2D). Классические моноциты могут вносить свой вклад в воспаление, связанное с тяжестью COVID-19, поскольку они в целом активируют маркеры активации во время инфекции SARS-CoV-2 ( 14 ). При сравнении маркеров, определяющих классические субпопуляции моноцитов (фиг. 2B и фиг. S3), мы наблюдали, что cMo1 и cMo2 обладают высокой экспрессией CD33. cMo1 также экспрессирует CD45RA и CD163. cMo2 экспрессируют CD9, HLA-DR, CD93 и CD36. cMo3 имеют умеренную экспрессию CD33, CD36 и гораздо более низкую экспрессию HLA-DR, чем cMo1 и cMo2.Хотя мы и другие ( 30 ) наблюдаем увеличение количества классических моноцитов среди пациентов с COVID-19, субпопуляции cMo1, cMo3, в частности, увеличивались, тогда как cMo2 уменьшались с тяжестью заболевания (рис. 2D). cMo3 был самым большим классическим кластером моноцитов с точки зрения клеточной частоты, а cMo4 был самым маленьким (рис. 2A / D). cMo4 был в изобилии у нескольких пациентов с умеренным и тяжелым поражением и характеризовался низкой экспрессией сиглека CD33, который по-разному экспрессируется в человеческих PBMC ( 31 ).Моноциты CD56 ⁺ и моноциты CD3 ⁺ также демонстрировали небольшое снижение с увеличением тяжести заболевания (рис. 2D).

Рис. 2. Иммунопрофилактика моноцитов у выздоровевших пациентов с COVID-19.

Миелоидных клеток были сгруппированы и спроецированы на UMAP, выявив 10 подмножеств миелоидов ( A ). Тепловая карта средней интенсивности 24 маркеров в 10 подмножествах миелоидов ( B ). Сложенные гистограммы частот миелоидного подмножества для каждого человека ( C ). Графики частот CD3 ⁺ моноцитов, CD56 ⁺ моноцитов, cMo1, cMo2, cMo3, cMo4, DC, iMo, nMo1 и nMo2 ( D ) для легкой (n = 9), средней (n = 13) , и тяжелые (n = 9) индивидуумы.Графики корреляции Спирмена DC с CRP и количеством тромбоцитов для умеренных (синий) и тяжелых (красный) людей (E). Графики корреляции Спирмена nMo1 с ЛДГ, МНО и D-димером для умеренных (синий) и тяжелых (красный) лиц (F). Статистическая значимость определялась с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона, «** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05.

Промежуточные и неклассические моноциты сильно подвержены влиянию COVID-19

Наиболее сильные изменения, наблюдаемые для миелоидных клеток в нашей когорте, касались промежуточных и неклассических субпопуляций моноцитов.Промежуточные моноциты (iMo) — это CD14 ⁺ CD16 ⁺ и повышены при атеросклерозе ( 32 ), связаны с микровоспалением сосудов при диабете 2 типа ( 33 ) и связаны с нарушением функции сосудов при заболевании почек ( 34 ). Считается, что iMo представляет собой переходную стадию моноцитов, через которую классические моноциты CD14 ⁺ превращаются в неклассические моноциты CD14 ^dim CD16 ⁺ ( 35 ).После активации классические моноциты склонны к потере и усилению экспрессии CD14 ⁺ и CD16 ⁺ соответственно ( 36 ). Клетки iMo экспрессируют гены, связанные с презентацией антигена, и участвуют в активации адаптивного иммунного ответа, воспаления и ангиогенеза ( 37 ). В нашей когорте COVID-19 кластер iMo положительно коррелировал с тяжестью заболевания (p <0,05), при этом частота iMo увеличивалась в 2,5 раза у лиц с легкой степенью тяжести по сравнению с тяжелобольными (рис.2D). Об увеличении провоспалительного iMo, экспрессирующего как IL-6, так и GM-CSF, также сообщалось у госпитализированных пациентов с COVID-19 в Хэфэй, Китай ( 38 ).

Напротив, CD14 ^dim CD16 ⁺ неклассические моноциты (nMo) играют критическую роль в поддержании сосудистого гомеостаза ( 39 ) и защищают от вирусных патогенов ( 40 ). Шульте-Шреппинг и др. ( 14 ) недавно сообщили об истощении всех неклассических моноцитов в COVID-19.Однако из наших предыдущих исследований сердечно-сосудистых заболеваний человека мы знаем, что неклассические моноциты состоят из отдельных подмножеств ( 27 ). Здесь, в нашей когорте COVID-19, неклассические моноциты сгруппированы в две отдельные популяции (рис. 2A). Одна популяция (nMo2) была положительной по 6-сульфо-Lac-Nac (Slan), гликозилированной форме P-селектина гликопротеина-1 (PSGL-1) (фиг. 2B). Slan ⁺ неклассические моноциты (называемые здесь nMo2) были идентифицированы при раке ( 41 ), атеросклерозе ( 27 ) и рассеянном склерозе ( 42 ) и ранее были обозначены как Slan-DC ( 43 ). ).nMo2 продуцирует IL-12 ( 44 ), IFNγ ( 45 ), активирует как антиген-специфические CD4 ⁺ , так и цитотоксические CD8 ⁺ Т-клетки ( 46, 47 ), способствует фагоцитозу и уничтожению опухоли ( 41, 48 ) и усиливают активацию NK-клеток ( 48, 49 ). Таким образом, моноциты Slan ⁺ неклассического nMo2 регулируют гомеостаз сосудов и вызывают иммунные реакции. Здесь мы обнаружили, что Slan ⁺ CD16 ⁺ неклассические моноциты (nMo2) практически отсутствовали как у умеренных, так и у тяжелых пациентов с COVID-19 (рис.2С, светло-розовые полосы; Рис. 2D; p 0,003 и p = 0,01, критерий суммы рангов Уилкокса). Таким образом, потеря nMo2 может способствовать прогрессированию заболевания COVID-19 до умеренного и тяжелого.

Другая неклассическая подгруппа моноцитов, nMo1, была увеличена в 4 раза у тяжелобольных пациентов по сравнению с умеренно больными; тем не менее, эта популяция была значительно ниже в группе умеренного заболевания по сравнению с группой легкого заболевания (рис. 2D). Клетки в nMo1 слабо экспрессируют Slan, но предыдущее исследование нашей лаборатории показало, что они действительно экспрессируют CD40, CD63, CD93 и CD36 ( 27 ).Кластер nMo1 у пациентов со средней степенью поражения также демонстрировал более высокую экспрессию HLA-DR, CD45RA, PD-L1 и PD-L2, чем в группах с легким или тяжелым заболеванием (фиг. 2B; фиг. S3). Неклассические моноциты CD45RA ⁺ связаны с повышенным уровнем холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) ( 29 ). Интересно, что CD45RA также является маркером миелоидных клеток-предшественников, часто обнаруживаемых в крови у пациентов с острым миелоидным лейкозом ( 50 ), что дополнительно поддерживает нарушение регуляции гомеостатического миелоидного ответа на инфекцию SARS-CoV-2.Присутствие PD-L1 и PD-L2 в кластере nMo1 у пациентов с умеренными заболеваниями (по сравнению с пациентами с легким или тяжелым заболеванием) предполагает, что эти клетки не могут обеспечить эффективный иммунный ответ и могут способствовать истощению Т-клеток. Экспрессия PD-L1 и PD-L2 на nMo1 ниже у тяжелых пациентов, но механизм этого снижения PD-L1 и PD-L2 у тяжелых пациентов неизвестен. Наконец, поскольку мы включили только DC-маркеры CD11c, CD123, CD1c и CD141 в нашу панель CyTOF, мы наблюдали только 1 подмножество DC (рис.2А). Эта подгруппа DC была уменьшена у умеренных и тяжелых пациентов по сравнению с легкой формой заболевания (рис. 2C), как ожидалось и наблюдалось в других исследованиях ( 15, 18 ).

Фенотипы моноцитов, связанные с клиническими особенностями COVID-19

Затем мы спросили, были ли какие-либо кластеры моноцитов или DC в значительной степени связаны с клиническими особенностями пациентов с COVID-19. Мы коррелировали частоту миелоидных клеток с соответствующими параметрами воспалительного процесса и свертывания крови (показаны на рис. 1), а также с тяжестью COVID-19, используя ранговую корреляцию Спирмена.DC отрицательно коррелировали с уровнями CRP (r = -0,62, p = 0,003) и положительно коррелировали с количеством тромбоцитов (r = 0,45, p = 0,036) по прибытии пациента в больницу (рис. 2E). Из классических кластеров моноцитов cMo1 был связан с уровнями альбумина, но это не достигло статистической значимости. Таким образом, классические моноциты, хотя в большинстве случаев имели повышенную степень тяжести заболевания, не были строго связаны с какими-либо клиническими параметрами, измеренными у наших пациентов. Напротив, iMo были тесно и положительно связаны с тяжестью заболевания (рис.2D), но не были существенно связаны с какими-либо конкретными клиническими параметрами. Была незначительная отрицательная связь с насыщением кислородом, поддерживающая связь с тяжестью заболевания, но она не была значимой (r = -0,4, , p = 0,06; данные не показаны).

Наиболее поразительные результаты были получены в результате нашего анализа неклассических фенотипов моноцитов. Частоты nMo1 были выше у тяжелобольных (рис. 2D), положительно коррелировали с воспалительным маркером LDH (r = 0,45, p = 0.04) (рис. 2F), отрицательно коррелировал с уровнями индикатора коагуляции INR (r = 0,54, p = 0,009) (рис. 2F) и положительно коррелировал с D-димерами (r = 0,56, p = 0,008) (рис. 2F) у этих лиц. Также наблюдалась тенденция к положительной корреляции nMo1 с уровнями воспалительного CRP (r = 0,37, p = 0,08, данные не показаны). Эти данные показывают, что уровни nMo1 тесно связаны с клиническими параметрами коагуляции и воспаления. К сожалению, количество nMo2 было слишком низким для оценки ассоциации этого типа клеток с тяжестью заболевания.

Гетерогенность Т-клеток у пациентов с COVID-19

Затем мы исследовали нарушения в компартменте Т-клеток с тяжестью заболевания в нашей когорте. CD8 ⁺ T-клетки и CD4 ⁺ T-клетки были повторно кластеризованы и спроецированы на UMAP, чтобы получить подробный взгляд на гетерогенность T-клеток (рис. 3A). Используя кластеризацию FlowSOM и метакластеризацию для слияния подмножеств, мы идентифицировали 17 кластеров Т-клеток в PBMC из нашей когорты COVID-19. В частности, мы идентифицировали 7 подмножеств Т-лимфоцитов CD4 ⁺ , 7 подмножеств Т-клеток CD8 ⁺ , подмножество Т-клеток CD3 ⁺ , которые были отрицательными по CD4 и CD8 (дважды отрицательные (DN), CD4 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки (двойные положительные, DP) и CD3 ⁺ CD56 ⁺ Т-клетки (рис.3А). Внутри компартмента Т-клеток CD4 ⁺ возникло 7 основных кластеров клеток на основе CD45RA, CD45RO, CCR7, CXCR3, CD11a, CD73, CD95 и PD-1 (фиг. 3B; фиг. S4). В частности, мы идентифицировали наивную подгруппу CD4 ⁺ T (T _N ) (CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ CD45RO ^lo CD95 ^lo ), память T (T _SCM — CD45RA ⁺ CCR7 ⁺ CD45RO ^lo CD95 ⁺ ) подмножество, 2 подмножества центральной памяти (T _CM : CD45RA ^lo CCR7 ⁺ CD45RO ⁺ ), 2 подмножества эффекторной памяти (T _EM : CD45RA ^lo CCR7 ^lo CD45RO ⁺ ) и подмножество терминально дифференцированного эффектора (T _EMRA : CD45RA ⁺ CCR7 ^— CD45RO ^lo ).Подмножества 2 T _CM отличались низкой и высокой экспрессией воспалительного хемокинового рецептора CXCR3. Как рецептор для CXCL9, CXCL10 и CXCL11, CXCR3 высоко экспрессируется в подмножествах эффекторов и памяти, но в основном отсутствует на клетках CD4 ⁺ T _N ( 51 ). CD4 ⁺ Т-хелперные клетки 1 (Th2) обладают устойчивой экспрессией CXCR3 (фиг. 3B) ( 52 ). Таким образом, мы предполагаем, что подмножество CXCR3 ⁺ T _CM (T _CM 1) является Th2-подобным.Две оставшиеся субпопуляции CD4 ⁺ T _EM различались по высокой и низкой экспрессии PD-1 (фиг. 3B). PD-1 связан с истощением Т-клеток, но также активируется на Т-клетках, которые недавно столкнулись с родственным антигеном.

Рис. 3. Иммунопрофилактика Т-клеток у выздоровевших пациентов с COVID-19.

CD4 ⁺ и CD8 ⁺ T клетки были сгруппированы и спроецированы на UMAP, выявив 17 подмножеств Т-клеток ( A ). Тепловая карта средней интенсивности 24 маркеров в 17 подмножествах ( B ).Сложенные столбчатые диаграммы частот Т-лимфоцитов у пациентов с легкой, средней и тяжелой степенью тяжести ( C ). Графики частот 17 подмножеств Т-клеток ( D ) для легких (π = 8), умеренных (n = 13) и тяжелых (n = 9) лиц. Графики корреляции Спирмена клеток CD4 ⁺ T _SCM с МНО и CD4 ⁺ T _CM 2 клеток с ЛДГ и ферритином (E). Статистическая значимость определялась с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона, **** p <0,001, ** p <0,01, * p <0,05.

В компартменте Т-клеток CD8 ⁺ мы идентифицировали 2 подмножества CD8 ⁺ T _N , подмножество CD8 ⁺ T _SCM , 1 подмножество CD8 ⁺ T _CM -подобное подмножество, 2 Подмножества CD8 ⁺ TEM и 1 подмножество CD8 ⁺ T _EMRA (рис.3B; инжир. S4). 2 субпопуляции CD8 ⁺ TN различались провоспалительным хемокиновым рецептором CXCR3. CD8 ⁺ T _N клетки, экспрессирующие CXCR3, обладают повышенным эффекторным потенциалом по сравнению с клетками TN ( 53 ). Важно отметить, что эти клетки отличаются от клеток CD8 ⁺ T _SCM , поскольку в них отсутствует экспрессия CD95. Подмножество CD8 ⁺ T _SCM экспрессировало маркеры T _N CD45RA, CCR7 и CD95. CXCR3 также был отмечен в этой популяции CD8 ⁺ T _SCM и является известным маркером этих клеток ( 54, 55 ).Подмножество CD8 ⁺ T _CM было CD45RA ^lo и также экспрессировало CCR7; однако экспрессия CD45RO была довольно слабой в компартменте Т-клеток CD8 ⁺ в целом (рис. S3). Эта CD8 ⁺ T _CM -подобная клетка была отмечена высокой экспрессией экто-5 ’нуклеотидазы CD73 и CXCR3. Подмножество 2 CD8 ⁺ T _EM было отмечено высокой экспрессией маркера истощения Т-клеток PD-1 и HLA-DR, тогда как эти маркеры были слабо экспрессированы в CD8 ⁺ T _EM 1.Подобно подгруппе CD8 ⁺ T _CM , экспрессия CD45RO была слабой с CD8 ⁺ TEM 1, но CD45RA и CCR7 не экспрессировались. Анализ частот подмножеств показал, что эти 17 подмножеств были выражены у всех пациентов с легкой, средней и тяжелой степенью тяжести (рис. 3C).

Изменения в подмножествах Т-клеток с тяжестью COVID-19

При количественной оценке частот подмножеств Т-лимфоцитов CD4 ⁺ во всех группах пациентов мы наблюдали значительно ослабленные (в 3 раза) частоты CD4 ⁺ T _CM 1 подмножество, связанное с высокой экспрессией CXCR3 у умеренно больных по сравнению с умеренно больными (рис.3D). Эти клетки T _CM , отмеченные высокой экспрессией CXCR3, могут включать Th2-подобную подгруппу. В противовирусных ответах Th2-поляризованные Т-клетки CD4 распространяют антивирусные Т-клеточные ответы CD8 ⁺ . Наше исследование показывает, что эта подгруппа Th2 теряется при заболевании средней степени тяжести. Мы также отметили значительное (9-кратное) обогащение субнабора клеток CD4 ⁺ T _EMRA в пределах умеренно по сравнению с умеренно больными людьми (рис. 3D). Недавнее исследование выявило значительное увеличение частот CD4 ⁺ T _EMRA у лиц с COVID-19 по сравнению с контрольными здоровыми людьми соответствующего возраста; однако пациенты с COVID-19 в этом исследовании не были разделены по степени тяжести заболевания ( 26 ).Таким образом, у умеренно больных COVID-19 наблюдается потеря клеток CD4 ⁺ CXCR3 ^hi T _CM и увеличение клеток T _EMRA .

Исследование компартмента Т-клеток CD8 ⁺ выявило 1,75-кратное ослабление в подмножестве 1 клеток CXCR3 ^lo CD8 ⁺ T _N в легкой форме по сравнению с средне больными и в легкой по сравнению с тяжелобольными (рис. 3D). Более того, более эффекторно-подобная подгруппа 2 CXCR3 ⁺ CD8 ⁺ T _N была уменьшена (6.В 6 и 8,8 раза соответственно) в пределах легкой степени по сравнению с пациентами со средней и тяжелой степенью поражения, соответственно (рис. 3D). Подгруппа, подобная CD8 ⁺ T _CM , была значительно снижена в 1,7 и 1,8 раза в пределах легкой степени по сравнению с умеренной и легкой степенью по сравнению с людьми с тяжелым поражением, соответственно (рис. 3D). Более того, подмножество CD8 ⁺ T _EM 1 было увеличено в умеренно по сравнению с умеренно больными людьми. Таким образом, у тяжело больных COVID-19 были обнаружены обогащенные CD8 ⁺ T _EM / T _EMRA популяции и уменьшенные подмножества TN.

Анализ нашей когорты (см. Методы) подтвердил, что средний возраст не госпитализированных лиц с легким заболеванием был значительно ниже, чем у пациентов с умеренно-тяжелым заболеванием (*** p = 0,0004 (легкое против умеренного) , * p = 0,0161 (легкое против тяжелого), однофакторный дисперсионный анализ). Поскольку возраст связан с T _N и частотами T-клеток памяти ( 56, 57 ), мы решили сосредоточить это исследование только на изменениях, наблюдаемых у госпитализированных пациентов (средне + тяжелобольные), которые были примерно одинакового возраста.Мы наблюдали двукратное снижение циркулирующих клеток CD4 ⁺ TSCM при умеренном по сравнению с тяжелым заболеванием COVID-19 (рис. 3D). Клетки T _SCM человека, наименее дифференцированная подгруппа памяти, фенотипированы как клетки T _N , которые экспрессируют CD95. Клетки T _SCM являются высокопролиферативными, самообновляющимися, продуцирующими цитокины и наделенными способностью дифференцироваться в подмножества T _CM и TEM ( 58, 59 ). Важно отметить, что в компартменте Т-клеток этот кластер клеток CD4 ⁺ T _SCM был единственной дифференциально экспрессируемой субпопуляцией между умеренным и тяжелым заболеванием (рис.3D). Интересно, что, хотя это и не является статистически значимым, частоты клеток CD8 ⁺ T _SCM также были одинаково снижены у умеренно и тяжело больных COVID-19 (рис. 3D).

Фенотипы Т-клеток, связанные с клиническими параметрами COVID-19

При корреляции с клиническими параметрами мы наблюдали сильную отрицательную связь частот CD4 ⁺ TSCM у лиц с легкой и средней степенью поражения с международным нормализованным соотношением (МНО), рассчитанным на основе протромбина. время (r = -0.43, p = 0,0488), которая значительно снижалась при тяжелом течении болезни (Рис. 1J; Рис. 3E). Напротив, частоты CD4 ⁺ T _CM 2 (CXCR3 ^lo ) положительно коррелировали с воспалительными параметрами лактатдегидрогеназы (ЛДГ; r = 0,45, p = 0,05) и ферритина (r = 0,56, p ). = 0,01) (рис. 3E). Частоты CD4 ⁺ T _EMRA положительно коррелировали с гемоглобином (r = 0,45, p = 0,04) (рис. S5A). Исследование компартмента Т-клеток CD8 ⁺ показало, что частоты клеток CD8 ⁺ T _SCM были обратно коррелированы с МНО (r = -0.53, p = 0,0016; Рис. S5B), тогда как частоты CD8 ⁺ T _EMRA положительно коррелировали с гемоглобином (r = 0,46, p = 0,03) (рис. S5C) и альбумином (r = 0,44, p = 0,0382; рис. . S5D).

Взаимодействие моноцитов и Т-клеток при серьезности COVID-19

Затем мы спросили, связаны ли частоты субпопуляций моноцитов с частотами конкретных Т-клеток и связаны ли эти корреляции с серьезностью заболевания. Хотя классические моноциты не были сильно связаны с конкретными клиническими измерениями в нашей когорте, мы обнаружили, что частоты cMo3 (только) показали статистически значимые ассоциации с субпопуляциями Т-клеток.В частности, мы наблюдали отрицательную ассоциацию cMo3 с клетками CD4 ⁺ T _N (r = -0,51, p = 0,0048; фиг. 4A). Кластер cMo3 также был в значительной степени связан со следующими подмножествами Т-клеток, которые были изменены с тяжестью COVID-19 или которые коррелировали с воспалительными показателями: CD8 ⁺ T _N 1 клетки, CD4 ⁺ T _SCM , а также as, CD4 ⁺ T _CM 2, CD4 ⁺ T _EM 2 и CD8 ⁺ T _EM 2.В частности, кластер cMo3 был отрицательно связан с клетками CD8 ⁺ T _N 1 (CXCR3 ^lo ) и CD4 ⁺ T _SCM (фиг. 4A). В отличие от отрицательных ассоциаций с T _N и T _SCM , cMo3 был положительно связан с CD4 ⁺ T _CM 2 (r = 0,63, p = 3e-4), CD4 ⁺ T _EM 2 (r = 0,41, p = 0,0268) и CD8 ⁺ T _EM 2 (r = 0,46, p = 0.011) (рис. 4А). CD4 ⁺ T _EM 2 и CD8 ⁺ T _EM 2 могут представлять «истощенные» Т-клетки, поскольку эти подмножества были отмечены экспрессией PD-1 (фиг. 3B). Недавнее исследование показало, что стимуляция PBMC COVID-19 вызвала выраженный ответ CD4 ⁺ T _CM и CD8 ⁺ T _EM / T _EMRA ( 60 ). Таким образом, cMo3 может способствовать нарушению регуляции иммунитета в ответ на COVID-19.

Рис. 4. Подмножества моноцитов и Т-клеток коррелированы у лиц с COVID-19.

Графики корреляции Спирмена cMo3 с CD4 ⁺ T _N , CD8 ⁺ T _N 1, CD4 ⁺ T _CM , 2, CD4 ⁺ T _EM 2, CD8 ⁺ T _EM 2 и CD4 ⁺ T _SCM (A), ÍMo с CD4 ⁺ T _N , CD8 ⁺ T _N 1, CD4 ⁺ T _∈MRA , CD4 ⁺ T _EM 2 и CD8 ⁺ T _EM 2 (B) и ⋂Mo1 с CD4 ⁺ T _EM 1 (C) в пределах умеренного (n = 8, светло-зеленый) , средние (n = 13, синие) и тяжелые (n = 9, красные) индивидуумы.

Кроме того, мы обнаружили, что промежуточные моноциты (iMo) показали самую сильную корреляцию с субпопуляциями Т-клеток, которые определяли тяжесть заболевания (рис. 4B). В частности, iMo отрицательно коррелировал как с CD4 ⁺ T _N (r = -0,51, p = 0,0044), так и с CXCR3 ^lo CD8 ⁺ T _N (r = -0,42, p ). = 0,0204) и положительно коррелировал с соответствующим эффекторным CD4 ⁺ T _EMRA (r = 0,4, p = 0.0279), и PD-1-экспрессирующие CD4 ⁺ T _EM 2 (r = 0,54, p = 0,0026) и CD8 ⁺ T _EM 2 подмножества (r = 0,58, p = 0,001) (рис. 4В). Клетки в кластере iMo экспрессируют высокие уровни HLA-DR и относительно высокую экспрессию CD9. CD9 представляет собой тетраспанин, присутствующий в микродоменах плазматической мембраны, включая липидные рафты ( 61 ). CD9 в моноцитах и ​​DC регулирует трафик HLA-DR, тем самым влияя на активацию Т-клеток ( 61 ).Таким образом, высокая экспрессия HLA-DR в iMo может управлять презентацией антигена и, в конечном итоге, способствовать истощению Т-клеток у этих пациентов с тяжелым заболеванием. Поскольку клетки внутри iMo считаются переходным состоянием в развитии моноцитов, и поскольку мы обнаружили, что частоты iMo в значительной степени связаны с тяжестью заболевания COVID-19 (рис. 2D), корреляция iMo с этими подмножествами Т-клеток указывает на потенциальную вероятную функциональную перекрестную связь между жидкие состояния моноцитов и Т-лимфоциты на разных стадиях тяжести заболевания.

Кластер nMo1 положительно коррелировал с клетками CD4 ⁺ T _EM 1 (r = 0,37, p = 0,0048) (рис. 4C). Эти эффекторные Т-клетки памяти CD4 ⁺ показали высокую экспрессию CD73 (5’-эктонуклеотидаза), эктофермента, который катализирует превращение 5’АМР в иммуносупрессивный аденозин ( 62 ). CD73 — маркер Т-регуляторных (Treg) клеток; CD25 ^{высокий} CD127 ^lo CD4 ⁺ Т-клетки, которые экспрессируют фактор транскрипции Foxp3 и эктофермент CD39 ( 63 ).Таким образом, это подмножество CD4 ⁺ TEM 1, вероятно, является подмножеством Treg. Однако, поскольку мы не включили маркеры CD25, CD127, Foxp3 или CD39 в нашу панель CyTOF, мы не можем полностью определить это подмножество. CD4 ⁺ Клетки ТЕМ 1 показали тенденцию к снижению частоты в пределах легкой по сравнению с умеренным и тяжелым заболеванием. В другом исследовании Treg-клетки были ослаблены у людей с тяжелой формой по сравнению с легкой формой COVID-19 ( 64 ). Точно так же наши сотрудники обнаружили, что антигенсвязывающие реактивные Treg-клетки SARS-COV2 значительно ослаблены в госпитализированных по сравнению с негоспитализированными людьми ( 65 ).В то время как инфильтрирующие опухоль легкого неклассические моноциты секретируют хемокины, которые рекрутируют Т-клетки ( 48 ), взаимодействие между неклассическими моноцитами и Treg недостаточно хорошо описано. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить взаимодействие неклассических моноцитов и Treg во время COVID-19.

К сожалению, нам не удалось провести корреляцию ни с nMo2, ни с cMo4 из-за их малого количества у пациентов с умеренными и тяжелыми поражениями. Вместо этого метода мы выполнили неконтролируемую кластеризацию PBMC от всех индивидуумов, проанализировав 487 комбинаций (10 миелоидных подмножеств + 24 маркера, 17 подмножеств Т-клеток + 14 маркеров).На рис. S6 показаны основные дифференциально выраженные комбинации признаков по тяжести заболевания из этого анализа. Мы обнаружили, что экспрессия CD141 в nMo2 (nMo2-CD14) и экспрессия CD93 как в nMo1, так и в nMo2 (nMo2-CD93 и nMo1-CD93) лучше всего отличает пациентов с легкими заболеваниями (зеленые столбцы) от госпитализированных пациентов (синие и красные столбцы) (рис. . S6). Таким образом, основные изменения миелоидного компартмента, связанные с тяжестью COVID-19, связаны с неклассическими подгруппами моноцитов. Кроме того, мы наблюдали ряд особенностей, которые преимущественно выражались у пациентов с умеренными заболеваниями, такие как экспрессия PD1 у наивных CD8 ⁺ (CD8 ⁺ T _N 2-PD1) и CXCR3 в CD4 ⁺ T _{Клетки CM} (CD4 ⁺ T _CM 2-CXCR3) (рис.S6). В целом, мы показываем, что определенные субпопуляции Т-лимфоцитов и моноцитов изменяются на периферии пациентов с COVID-19, подчеркивая системные иммунные реакции на заболевание.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем текущем исследовании мы изучали гетерогенность миелоидов и Т-лимфоцитов у субъектов, выздоравливающих от COVID-19 легкой, средней и тяжелой степени. В частности, мы идентифицировали 10 кластеров моноцитов / DC и 17 кластеров Т-лимфоцитов с помощью масс-цитометрии. Из них кластеры промежуточных и неклассических моноцитов, а также клетки CD4 ⁺ T _SCM коррелировали с тяжестью заболевания, факторами свертывания и воспалительными индексами.Мы также обнаружили, что промежуточные моноциты тесно коррелировали с потерей клеток T _N и увеличением количества эффекторных Т-клеток, PD-1 ⁺ «истощенных» CD4 ⁺ T _EM 2 клеток и CD8 ⁺ . T _EM 2 кл. Кластер nMo1 также коррелировал с клетками CD4 ⁺ T _EM 1 и тяжестью заболевания.

Легко больные люди в нашей когорте были намного моложе, чем средне и тяжелобольные, в то время как последние две группы были примерно одинаковыми по среднему возрасту (подробности см. В разделе «Методы»).Это наблюдение отражает опубликованные данные о том, что люди пожилого возраста более восприимчивы к тяжелым случаям COVID-19 ( 66 ), но сбивает с толку тот факт, что умеренно больные люди представляли определенную демографическую группу (медицинские работники). Тем не менее, многие патологические состояния связаны с возрастом, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак. Недавнее исследование нашей лаборатории показало, что частота моноцитов человека минимально зависит от возраста ( 27 ). Напротив, количество наивных Т-клеток заметно уменьшается с возрастом, и это изменение сопровождается сопутствующим увеличением количества Т-клеток памяти ( 56, 67, 68 ).Клетки CD4 ⁺ TSCM представляли собой единственную популяцию Т-клеток, которая, как было обнаружено, значительно ослаблена при умеренном или тяжелом заболевании. Более того, частота клеток TSCM отрицательно коррелировала с параметром свертывания INR у людей с COVID-19. Клетки TSCM — это антиген-испытанная и наименее дифференцированная подгруппа памяти. У человека клетки T _SCM отличаются от клеток T _N по экспрессии CD95 (Fas или Apo-1). Повышенная частота клеток TSCM связана с улучшенным ответом на вирусные инфекции.Например, у ВИЧ-инфицированных ⁺ человек, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию, увеличиваются частоты CD8 ⁺ TSCM, которые отрицательно коррелируют с вирусной нагрузкой и количеством Т-лимфоцитов CD4 ⁺ ( 69 ). Недавнее исследование не обнаружило различий в частотах периферических CD4 ⁺ или CD8 ⁺ TSCM между донорами COVID-19 и контрольной группой того же возраста ( 26 ). Однако, поскольку эти данные не были стратифицированы по тяжести заболевания, по-прежнему необходима продольная количественная оценка субпопуляций Т-клеток во время COVID-19.

Неклассические моноциты играют важную противоопухолевую и атеропротекторную роли ( 48, 70 ) и отличаются своей способностью патрулировать сосудистую сеть ( 71, 72 ). Патрулирование сосудов неклассическими моноцитами происходит как во время устойчивого состояния, так и во время воспаления и позволяет вести наблюдение против вторжения патогенов и поддерживать гомеостаз эндотелия сосудов ( 73 ). Мы сообщили, что сосудистый эндотелий активируется у мышей, у которых есть неклассические моноциты, неспособные патрулировать сосудистую сеть из-за нарушений передачи сигналов интегрина ( 39 ).Мы предполагаем, что как моноциты nMo1, так и nMo2 патрулируют сосудистую сеть, но это еще предстоит проверить. Мы обнаружили, что nMo2 слабо экспрессирует CXCR6, мигрирует в сторону CXCL16 и имеет высокую фагоцитарность ( 27 ). Мы и другие обнаружили, что моноциты Slan ⁺ nMo2 производят IL-12 ( 44 ), рекрутируют NK-клетки ( 48 ) и активируют Т-клетки ( 46, 47 ). Мы предполагаем, что потеря клеток nMo2 у пациентов со средней и тяжелой степенью тяжести может быть одним из объяснений проблем коагуляции, возникающих при инфекции SARS-CoV-2, отчасти из-за отсутствия этих клеток для поддержания гомеостаза эндотелия сосудов.Однако исследования также показали, что моноциты могут выделять тканевой фактор, который важен для коагуляции ( 74 ), поэтому это может быть еще одним механизмом, с помощью которого изменения моноцитов могут влиять на коагуляцию в сосудистой сети пациентов с COVID-19. К сожалению, тканевой фактор не был включен в это исследование в качестве маркера CyTOF. Таким образом, следующим важным шагом этого исследования является изучение того, как изменения свертывания крови вызываются изменениями в субпопуляциях моноцитов на основе COVID-19.

Поскольку мы и другие исследователи давно выдвинули гипотезу о том, что все неклассические моноциты обладают противовоспалительным и противовирусным действием ( 27, 40, 73, 75 ), мы были удивлены, обнаружив, что количество моноцитов nMo1 уменьшается при умеренной степени, но увеличивается при тяжелой степени Больные COVID-19.Фактически, клетки nMo1, по-видимому, определяют тяжесть заболевания в нашей когорте. Клетки nMo1 у умеренных пациентов демонстрировали более высокую экспрессию HLA-DR, PD-L1 и PD-L2, чем у тяжелых пациентов, что свидетельствует о возможном фенотипе истощения или о том, что они вызывают истощение Т-клеток. Мы также обнаружили положительную корреляцию между этими клетками и уровнями CRP, D-димеров и INR. Нам не удалось провести функциональные исследования этих клеток из-за малого количества доступных образцов. Вместо этого мы исследовали различия в экспрессии маркеров между клетками nMo1 и nMo2.Дифференциально обогащенные маркеры между этими субпопуляциями включали CD9 и CD36. CD9 на моноцитах управляет M2-подобными альтернативными путями активации, включая высвобождение IL-10 ( 76 ). Однако, что движет ассоциацией nMo1 с тяжестью заболевания, неизвестно.

Недавняя работа лаборатории Амит ( 77 ) предполагает, что моноциты и макрофаги могут либо инфицироваться, либо фагоцитировать частицы SARS-CoV-2. Хотя моноциты минимально экспрессируют рецептор SARS-CoV-2 ACE-2, они экспрессируют CD147 (также известный как BSG), потенциальный рецептор вируса ( 78 ).Учитывая поглощение вирусом клеток nMo1 и nMo2, моноциты nMo2 в конечном итоге могут быть убиты вирусной инфекцией или избыточным поглощением вирусных частиц. Альтернативная гипотеза заключается в том, что активация клеток nMo1 проникновением вируса или захватом вирусных частиц вызывает реакцию моноцитов nMo1 у пациентов с COVID-19. В будущих исследованиях следует сосредоточить внимание на проверке этих двух гипотез.

В нашем исследовании используются PBMC от выздоравливающих пациентов с COVID-19 для характеристики реакции иммунных клеток на болезнь. Изучение моноцитов и Т-клеток при остром COVID-19, а также выполнение продольных исследований образцов, взятых у пациентов во время начала болезни и выздоровления, может дополнительно определить взаимодействия иммунных клеток во время прогрессирования COVID-19.Таким образом, наши результаты подробно описывают ранее неизвестные фенотипы моноцитов и Т-клеток во время COVID-19 и предполагают взаимодействие между подмножествами этих двух типов клеток во время болезни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы пациентов

Этическое одобрение для этого исследования было получено от Berkshire Research Ethics 20 / SC / 0155 и этического комитета Института иммунологии Ла-Холья. Письменное информированное согласие было получено для всех 30 субъектов. Лица средней (n = 13) и тяжелой (n = 9) степени тяжести были госпитализированы в клиническую больницу на юге Англии либо в палату общего профиля (заболевание средней степени тяжести), либо с переходом на лечение в отделение интенсивной терапии (ОИТ) по поводу пациенты с тяжелым заболеванием.SARS-CoV2 был подтвержден с помощью реакции полимеразы обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР) или путем обнаружения антител к белку спайков, проведенного в клинической вирусологической лаборатории больницы. В когорту легкой степени вошли восемь медицинских работников, которые не были госпитализированы, но диагноз COVID-19 был подтвержден с помощью ОТ-ПЦР или серологических свидетельств антител к SARS-CoV2. Все пациенты предоставили до 80 мл крови для исследований. Клинические и демографические данные были собраны из историй болезни госпитализированных пациентов, включая происхождение, сопутствующие заболевания, результаты анализа крови, лекарственное вмешательство, радиологическое вовлечение, тромботические события, результаты микробиологии и вирусологии.

Средний возраст пациентов с COVID-19 в легкой форме составил 39 + 2 (26-50) лет, средний возраст: 62 + 14 (39-82) лет; Тяжелая: 56 + 10 (33-65) лет (легкая против средней: *** p = 0,0004; легкая против тяжелой: * p = 0,0161; умеренная против тяжелой: p = 0,4076; один -Путь ANOVA). В легкой когорте 50% составляли мужчины, а в умеренной когорте 77% лиц были мужчинами. В тяжелой когорте 78% составляли мужчины. В когорту с легкой степенью тяжести вошли 7 белых / британцев и 1 белый / другой человек.В умеренную когорту вошли 2 участника из Индии, 9 белых / британцев, 1 чернокожий / британец и 1 белый / другой участник. Тяжелая когорта включала 5 белых / британцев, 1 чернокожих / британцев, 2 индейцев и 1 белого / другого участника.

Среднее время пребывания в больнице умеренных людей составляло 7,8 + 3,2 дня, в то время как тяжелые пациенты находились в больнице в среднем 20 + 11,8 дней ( *** p = 0,004; тест Манна-Уитни). Пять из 9 человек (55,5%) в тяжелой когорте были интубированы. Шесть человек сообщили о предыдущих проблемах с дыхательными путями, в том числе 3 в когорте средней степени тяжести с историей астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), 1 человек в когорте тяжелой степени с астмой и два человека со средней степенью поражения с ХОБЛ.Четыре из девяти (44%) человек в тяжелой когорте сообщили о гипертонии, а 1 из 13 (7,7%) человек в умеренной когорте сообщили о гипертонии ( p = 0,1159; точный тест Фишера). Два человека (2/13) в когорте умеренной степени тяжести сообщили о ранее перенесенном ТГВ / аритмии и инфаркте миокарда, соответственно. Двум из тринадцати человек в когорте средней степени тяжести был поставлен диагноз рака ( p = 0,4935; точный тест Фишера). Трое из девяти (33,3%) человек в когорте тяжелой степени страдали диабетом, в отличие от ни одного человека в когорте средней степени тяжести (умеренный vs.Серьезный; p = 0,0545; Точный тест Фишера). Все пациенты средней и тяжелой степени получали антибиотики во время госпитализации. Двое из девяти пациентов с тяжелой формой заболевания были участниками испытаний ремдесивира и REMCAP, соответственно. Все госпитализированные выздоровели и были выписаны из больницы.

Обработка образцов

PBMC были разморожены у восстановленных индивидуумов с COVID-19, закодированы штрих-кодом CD45 и окрашены панелью моноцитов-Т-клеток, как описано ранее ( 27 ).Лица с легким, средним и тяжелым течением COVID-19 были проанализированы в течение пяти различных прогонов CyTOF (Раунд 1: 3 умеренного и 2 тяжелого заболевания, Раунд 2: 5 умеренного и 2 тяжелого заболевания, Раунд 3: 2 легкого, 5 умеренного и 1 тяжелое заболевание, раунд 4: тяжелое заболевание 4 и раунд 5: легкое заболевание 6). Чтобы идентифицировать эффекты партии, технический контроль здоровых PBMC был закодирован штрих-кодом CD45 и добавлен в каждый отдельный образец. Настройка производилась каждые 6 часов. Данные были нормализованы с помощью инструмента NormalizerR2013a_Win64 на основе Matlab.Живые клетки были заблокированы через ДНК-1 через ДНК-2 и представляли собой цисплатин ^-10.

Анализ CyTOF — дебаркодирование и пакетная коррекция

Каждый образец CyTOF был удален из исходного файла fcs (с добавлением здоровых образцов PBMC в качестве контроля) с использованием алгоритма деконволюции ( 79 ), реализованного в пакете CATALYST Bioconductor. Мы повторно оценили маркеры, используемые для штрих-кодирования, построив график плотности соответствующих маркеров в каждом из файлов fcs после удаления штрих-кода. Сначала каждый файл fcs был нормализован с использованием преобразования arcsinh (cofactor = 5).Затем мы воспользовались преимуществом того же контроля исправности всплеска для пакетной коррекции, используя метод квантильной нормализации для объединенного распределения каждой партии (пара выборки и контроль всплеска), как реализовано в функции normalizeBatch . из пакета CYDAR Bioconductor ( 80 ). График плотности всех белковых маркеров был нанесен до и после нормализации; Показаны репрезентативные графики коррекции CD3 (A), CD4 (B), CD8 (C) и CD11a (E), CD14 (F) и CD16 (G) (рис.S7).

CyTOF-анализ — редукция с высокой размерностью и кластеризация

Массовый цитометрический анализ выполнялся аналогично конвейеру, описанному в нашей предыдущей работе ( 27 ). Мы использовали метод кластеризации FlowSOM ( 21 ), метод машинного обучения самоорганизующейся карты (SOM) с параметрами по умолчанию (сетка SOM 10 × 10 соответствует 100 подкластерам) для определения основных типов ячеек из CD45 ⁺ live. клеток, а также для определения гетерогенности миелоидных и Т-клеточных компартментов.Основные типы клеток были идентифицированы с использованием хорошо известных маркеров происхождения. Консенсусная кластеризация использовалась для обоснования оптимального количества кластеров от k = 2 до k = 30 для оценки устойчивости количества кластеров на основе относительного уменьшения площади под кривой CDF (функция совокупного распределения) ( 81 ). Кластеры были объединены на основании сходства их репрезентативных белковых маркеров. Тепловые карты средней экспрессии белка были созданы с использованием пакета pheatmap R (v0.2).Вычисление UMAP было выполнено с использованием пакета umap R (v0.2.3.1), оболочки для пакета Python «umap-learn». Для кластеризации Т-клеток на Фигуре 3 CD14 ^lo CD66b / Siglec / CD19 ^lo CD3 ⁺ CD4 ⁺ и CD3 ⁺ CD8 ⁺ Т-клетки были заблокированы в FlowJo v10.3 перед последующим FlowSOM. кластеризация. Анализ дифференциальной экспрессии комбинированных признаков подмножеств Tcell / миелоида и поверхностных маркеров (всего 487 признаков) был использован для выбора основных признаков, дифференцирующих тяжесть заболевания (пороговая величина изменения кратности 1), как показано на рисунке S6.

Статистический анализ

Различия в частотах иммунных субпопуляций оценивали с использованием критериев суммы рангов Уилкокса. Корреляцию частот Т-клеток и подмножеств моноцитов / DC друг с другом, а также с клиническими параметрами проводили с использованием тестов ранговой корреляции Спирмена.

Массовая цитометрия CyTOF выявляет фенотипически различные популяции нейтрофилов крови человека, дифференциально коррелированные со стадией меланомы.

Введение

Нейтрофилы представляют собой миелоидные клетки костного мозга (BM), которые играют ключевую роль в противораковом иммунитете.1 Нейтрофилы продуцируются со скоростью 10 ¹¹ в день2 3 и составляют 50–70% лейкоцитов крови. Из-за этого быстрого обмена в организме нейтрофилы традиционно рассматривались как однородная популяция. Однако недавние исследования показали, что они демонстрируют более длительный жизненный цикл, чем считалось ранее 4, что возрождает интерес к возможности существования различных популяций нейтрофилов.

Вдохновленные такими открытиями, несколько групп с тех пор идентифицировали и охарактеризовали несколько субпопуляций нейтрофилов.Например, использование разделения в градиенте плотности позволило выявить популяции нейтрофилов низкой плотности (LDN) и нейтрофилов высокой плотности (HDN), каждая из которых обладает противоположным действием в иммунной регуляции и прогрессировании рака.6 Марини и соавторы использовали проточную цитометрию, чтобы показать, что CD10 ⁺ и CD10 ^— нейтрофилов представляют популяции с противоположными эффектами на пролиферацию Т-клеток.7 Пиллэй и его коллеги идентифицировали три субпопуляции нейтрофилов на основе их дифференциальной экспрессии CD16 и CD62L, каждая из которых демонстрирует определенные состояния созревания и активации.CD45RA, CD63 и CD11b также указывают на статусы активации в определенных субпопуляциях нейтрофилов.9 10 Сингхал с сотрудниками выделили субпопуляцию нейтрофилов CD14 ⁺ с противоопухолевыми функциями, включая усиление продукции интерферона-g и гранзима B. 11 Evrard и его коллеги продемонстрировали CD15 ⁺ CD49 ⁺ CD101 ^— предшественник нейтрофилов (preNeu) .12 Наша группа идентифицировала CD117 ⁺ CD66b ⁺ CD38 ⁺ предшественник нейтрофилов человека (hNeP), который также был обнаружен в крови животных с опухолями.13 Дополнительная работа в этой области резюмирована в двух отличных обзорных статьях. 14 15 Тем не менее, отсутствие широко распространенных маркеров субпопуляции препятствует нашему пониманию гетерогенности нейтрофилов. Действительно, субпопуляции нейтрофилов, описанные до сих пор, вероятно, представляют собой пересекающиеся популяции. Например, анализ проточной цитометрии позволяет предположить, что субпопуляции нейтрофилов CD10 ⁺ и CD10 ^— фракционируются как на уровни LDN, так и на уровни HDN.7 Кроме того, экспрессия CD10 ⁺ продемонстрирована Marini et al 7 является общей для субпопуляции CD16 ^bright , описанной Pillay et al .8 Специфические нейтрофилы CD14 ⁺ представляют фенотип CD10 ^—, 11 предполагая, что эта субпопуляция перекрывается с популяцией нейтрофилов CD10 ^—.7 Субпопуляция нейтрофилов CD14 ⁺ также имеет фенотип CD49d ⁺ , что указывает на перекрытие с CD49d ⁺ preNeu, продемонстрированным Evrard и др. , 12, а также субпопуляцией нейтрофилов CD49d ⁺ CD62L ^lo («пожилые нейтрофилы»), о которой сообщили Casanova-Acebes и др. .16 Для определения степени пересечения субпопуляций нейтрофилов, о которых сообщалось ранее, необходим высокоразмерный анализ гетерогенности нейтрофилов на одноклеточной основе.

Мы и другие использовали многомерные подходы, такие как одноклеточная цитометрия методом времени пролета (CyTOF) и секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) для устранения гетерогенности нейтрофилов. Эти усилия демонстрируют, что линия нейтрофилов включает гетерогенный пул в BM мыши и человека.12 13 Кроме того, анализы scRNA-seq выявляют шесть кластеров нейтрофилов с различными сигнатурами транскрипции в опухолях легких человека, но поверхностные маркеры, необходимые для классификации этих популяций, не были идентифицированы. .17 Интересно, что работа в этой области также предполагает дифференциальное участие субпопуляций нейтрофилов в раке. 18 19 Таким образом, разработка консенсусных маркеров нейтрофилов необходима для улучшения нашего понимания биологии нейтрофилов и ее взаимосвязи с прогрессированием заболевания.

Здесь мы используем панель CyTOF наиболее часто используемых поверхностных маркеров созревания, активации и функции нейтрофилов для всестороннего исследования гетерогенности нейтрофилов в цельной крови (WB) от пациентов с меланомой, не получавших лечения.Высокомерный анализ этого набора данных выявил семь субпопуляций нейтрофилов, связанных со стадией заболевания и воспроизводимых во время ручного стробирования в проточной цитометрии. Наконец, мы обнаружили, что эти семь субпопуляций нейтрофилов несут отличительные функции, продемонстрированные их разной способностью к фагоцитозу и продукции активных форм кислорода (АФК).

Методы

Сбор крови пациентов с меланомой

Образцы крови пациентов с меланомой, которые не получали лечения после хирургической резекции, были собраны в пробирки, покрытые ЭДТА, базой хранилища биопрепаратов при Онкологическом центре Канзасского университета и доставлены в Ла-Хойю Институт иммунологии (LJI) ночной доставкой.Одновременно в LJI собирали кровь от здоровых доноров в пробирки, покрытые EDTA. Чтобы обеспечить единообразную обработку контрольных и экспериментальных материалов, все образцы крови здоровых доноров хранили при 4 ° C в течение ночи, а затем обрабатывали на следующее утро.

Клеточная суспензия человеческого WB

WB подвергалась лизису эритроцитов (RBC) (буфер для лизиса RBC, eBiosciences) дважды при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин. Затем клетки промывали окрашивающим буфером (забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко + 1% сыворотки крови человека + 0.1% азид натрия + 2 мМ ЭДТА) и фильтровали через фильтр с размером ячеек 70 мкм. Клетки осаждали центрифугированием, и суспензии получали осторожным пипетированием до достижения конечной концентрации 3 × 10 ⁶ клеток на 100 мкл буфера.

Антитела для масс-цитометрии

Антитела, конъюгированные с металлами, были приобретены непосредственно у Fluidigm для доступных мишеней. Для всех других мишеней очищенные антитела были приобретены, как описано ранее. 20 Конъюгации антител получали с использованием набора для маркировки антител Maxpar (Fluidigm) в соответствии с рекомендациями производителя.После этого антитела, конъюгированные с Maxpar, хранили в стабилизирующем растворе антител на основе физиологического раствора с фосфатным буфером (Candor Biosciences) с добавлением 0,05% азида натрия при 4 ° C. Перед использованием все антитела титровали.

Массовая цитометрия (CyTOF)

CyTOF выполняли в соответствии с ранее описанными протоколами.20 Для окрашивания жизнеспособности клетки промывали фосфатно-солевым буфером и окрашивали цисплатином (Fluidigm) до конечной концентрации 5 мкМ. Перед окрашиванием поверхности лизированные эритроцитами клетки WB ресуспендировали в буфере для окрашивания в течение 15 мин при комнатной температуре для блокирования рецепторов Fc.Коктейль поверхностных антител, перечисленный в таблице 1, добавляли к клеточным суспензиям на 1 час при 4 ° C. Затем клетки промывали буфером для окрашивания и фиксировали 1,6% параформальдегидом (Thermo Fisher) в течение 15 мин при комнатной температуре. После этого для каждого образца готовили 1 мл раствора для интеркаляции путем добавления Cell-ID Intercalator-Ir (Fluidigm) в Maxpar Fix и Perm Buffer (Fluidigm) до конечной концентрации 125 нМ (1000-кратное разведение исходного раствора 125 мкМ. ) и встряхните, чтобы перемешать. После фиксации клетки ресуспендировали в растворе для интеркаляции и инкубировали в течение ночи при 4 ° C.Затем клетки промывали в буфере для окрашивания, а затем с последующими промываниями в растворе для сбора клеток (CAS) (Fluidigm) для удаления буферных солей. Затем клетки ресуспендировали в CAS с разведением 1:10 четырехэлементных калибровочных шариков EQ (Fluidigm) и фильтровали через колпачок с нейлоновой сеткой 35 мкм (Corning, Falcon). Образцы анализировали на масс-цитометре Helios 2 CyTOF (Fluidigm), оборудованном Super Sampler (Victorian Airship & Scientific Apparatus), при частоте событий ≤500 событий / с. Файлы данных массовой цитометрии были нормализованы с помощью программы Normalizer21 на основе гранул и проанализированы с помощью программного обеспечения для анализа Cytobank (https: // www.cytobank.org/). Для анализа данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой (FlowSOM) в Cytobank иерархическая кластеризация использовалась для определения семи метакластеров на основе медианной экспрессии маркера (после преобразования arcsinh с кофактором, равным 5) из визуализации t-распределенного стохастического соседа. встраивание (viSNE) результатов.

Таблица 1

Цитометрия с помощью панели «времяпролетного антитела»

Проточная цитометрия и сортировка клеток

Все окрашивание методом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) проводили в окрашивающем буфере при 4 ° C.Клетки фильтровали через стерильные сетчатые фильтры размером 70 мкм для получения суспензий отдельных клеток (30 000 клеток на мкл для анализа проточной цитометрии, 0,5–2 × 10 ⁷ клеток на мл для сортировки). Перед окрашиванием поверхности лизированные эритроцитами клетки WB ресуспендировали в буфере для окрашивания для блокирования рецепторов Fc в течение 15 мин при комнатной температуре. Окрашивание поверхности проводили в течение 30 мин в конечном объеме 500 мкл для сортов FACS и 100 мкл для стандартной проточной цитометрии. Перед сбором клетки дважды промывали не менее 200 мкл буфера FACS.FACS выполняли с помощью Aria II и Aria-Fusion (BD Biosciences) и обычной проточной цитометрии с помощью LSRII и LSR Fortessa (BD Biosciences). Вся проточная цитометрия проводилась на живых клетках. Процентное содержание иммунных клеток CD45 ⁺ рассчитывали путем прямого и бокового рассеяния и анализа жизнеспособности живых клеток. Все анализы и сортировки повторяли не менее трех раз, и чистоту каждой отсортированной фракции определяли визуально и с помощью повторного анализа маркеров поверхности с помощью FACS. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo V.10.5.

Фагоцитоз

Фагоцитарную способность нейтрофилов оценивали с помощью набора для анализа фагоцитоза (красный зимозан) (Abcam) в соответствии с протоколом производителя. Клетки WB, лизированные эритроцитами, разводили до концентрации 3 × 10 ⁶ клеток в 1 мл буфера и инкубировали с 5 мкл суспензии зимозана на образец при 37 ° C и 5% CO ₂ в течение 2,5 часов. После этого образцы центрифугировали в течение 5 минут при 400 × g и затем окрашивали коктейлем из 100 мкл антител для обнаружения фагоцитоза нейтрофилами красных частиц зимозана на основе проточной цитометрии.

Обнаружение клеточных АФК

Производство АФК нейтрофилами было обнаружено с помощью набора для определения клеточных АФК (Abcam) в соответствии с руководством производителя. Клетки WB, лизированные эритроцитами, разводили до концентрации 3 × 10 ⁵ клеток в 100 мл буфера. Предварительную обработку ингибитором ROS (N-ацетил-L-цистеином) проводили для группы отрицательного контроля при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение 30 минут. Затем в коктейль антител добавляли антитело для обнаружения ROS для обнаружения продукции ROS нейтрофилами на основе проточной цитометрии.Индуктор АФК (пиоцианин) добавляли ко всем группам и инкубировали в течение 30 мин до сбора данных на цитометре.

Количественный анализ и статистический анализ

Данные для всех экспериментов анализировали с помощью программного обеспечения Prism (GraphPad). На рисунке 1 коэффициенты линейной регрессии и корреляции Пирсона использовались для определения корреляции между частотами кластеров нейтрофилов и стадиями меланомы. Различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и множественных сравнительных тестов Тьюки с одной объединенной дисперсией.На рисунке 2 парные t-критерии Стьюдента использовались для сравнения различий между здоровыми пациентами и пациентами с меланомой. Для рисунков 3B и E, F и дополнительных онлайн-рисунков 7A, C – E различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и множественных сравнительных тестов Тьюки с одной объединенной дисперсией. Для рисунка 3C и дополнительных онлайн-рисунков 7B и F для сравнения групп + зимозан и -зимозан были выполнены обычные двухфакторные тесты ANOVA и множественные сравнительные тесты Сидака с индивидуальными дисперсиями, рассчитанными для каждого сравнения.Планки погрешностей указывают средние значения ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны путем двустороннего сравнения с 95% доверительными интервалами и показаны в стиле Американской психологической ассоциации (APA).

Рисунок 1

Гетерогенность нейтрофилов у пациентов с меланомой коррелирует со стадией заболевания. (A) Круговые диаграммы показывают средние проценты для каждого кластера FlowSOM (hNeP и Cneut1-6) в общем количестве нейтрофилов крови пациентов, сгруппированных по стадиям меланомы. Для этого анализа использовались только пациенты с диагнозом стадии меланомы, показанной в таблице 2. Количество субъектов на каждой стадии меланомы указано на графике.(B) Линейный регрессионный анализ показан на точечной диаграмме, изображающей корреляции между частотой кластеров нейтрофилов и стадией меланомы. Каждая точка представляет одного пациента. Результаты анализа Пирсона показаны для каждого кластера. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. (C) Гистограмма показывает средний процент каждого кластера в группах пациентов A – D. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2).Количество субъектов в каждой группе указано под каждой колонкой. (D) Графики скрипки показывают частоту кластеров нейтрофилов в пулах пациентов A – D. Квартили и медианные значения для каждой группы пациентов показаны пунктирными линиями. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2). Различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки с одной объединенной дисперсией.Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. (E) Гистограмма показывает процент пациентов на разных стадиях меланомы (таблица 2) в группах пациентов –D. Для этого анализа использовались все пациенты, независимо от того, был ли им поставлен диагноз стадии меланомы (таблица 2). Количество пациентов в каждом пуле указано под каждым столбцом. APA ‘Американская психологическая ассоциация; FlowSOM, анализ данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; N / A, отсутствует информация о диагнозе пациентов.

Рисунок 2

Проточная цитометрия воспроизводит семь субпопуляций нейтрофилов. (A) CD66b ⁺ нейтрофилов крови отбирали вручную и подвергали последовательному стробированию для идентификации субпопуляций нейтрофилов с помощью CyTOF. Шкалы показаны в преобразовании arcsinh с кофактором, равным 5. (B) Стратегия стробирования из (A) была подтверждена проточной цитометрией у не получавших лечения пациентов с меланомой. Шкалы показаны в биэкспоненциальном масштабе. (C) Анализ проточной цитометрии нейтрофилов крови здорового донора со стратегией гейтирования из (A).Шкалы показаны в биэкспоненциальном масштабе. (D) Анализ проточной цитометрии частоты каждой вручную управляемой субпопуляции нейтрофилов в общем количестве нейтрофилов крови. Были проанализированы пять здоровых доноров (возраст 23–46 лет, двое женщин и трое мужчин) и пять не получавших лечения пациентов с меланомой (возраст 59–79 лет, двое женщин и трое мужчин). Каждая точка представляет результат одного пациента. Парные t-критерии использовались для сравнения различий между здоровыми пациентами и пациентами с меланомой. Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение.Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. CyTOF, цитометрия по времени пролета; hNeP, предшественник нейтрофилов человека.

Таблица 2

Демографические данные пациентов и характеристики опухоли

Результаты

CyTOF обнаруживает семь кластеров нейтрофилов в крови пациентов с меланомой

Для выявления новых популяций нейтрофилов в крови мы использовали массовую цитометрию CyTOF для анализа образцов свежей крови, лизированных эритроцитами. из когорты из 21 пациента с меланомой (таблица 2).На момент сбора образцов у этих пациентов был недавно поставлен диагноз, они не получали никакого лечения от своего состояния (не лечились), и их возраст составлял от 24 до 82 лет, средний возраст составлял 69 лет (таблица 2). После обработки образцы подвергали панели антител CyTOF, которая одновременно измеряла экспрессию 40 поверхностных маркеров нейтрофилов (таблица 1). Маркеры клонов лейкоцитов (таблица 1) были использованы для выполнения автоматизированного анализа viSNE для изучения живых одиночных клеток CD45 ⁺ в крови (онлайн-дополнительный рисунок 1A).Нейтрофилы (кластер, обогащенный клетками CD66b ⁺ ) были отличимы от всех других лейкоцитов с использованием этой стратегии (онлайн-дополнительная фигура 1B).

Рисунок 3

Семь субпопуляций нейтрофилов обладают различной фагоцитарной способностью и способностью продуцировать АФК. Трое случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет; одна женщина и двое мужчин) были проанализированы с помощью проточной цитометрии. (A – C) Образцы крови, лизированные эритроцитами, инкубировали с предварительно меченными частицами зимозана в течение 2,5 часов. После этого клетки собирали и окрашивали с помощью панелей проточной цитометрии, описанных на фигуре 2 и дополнительной онлайн-фигуре 6C.Каждая субпопуляция нейтрофилов была закрыта для оценки поглощения ею частиц зимозана. (A) Зимозан-положительные клетки показаны красным; Зимозан-отрицательные клетки показаны синим цветом. Группа без зимозана (-зимозан) показана на нижних панелях как контрольная группа. (B) Процент зимозан-положительных клеток (красные точки на A) в каждой контролируемой субпопуляции нейтрофилов. Планки погрешностей указывают среднее значение с SD. (C) gMFI зимозана в каждой субпопуляции закрытых нейтрофилов. Планки погрешностей указывают среднее значение со стандартным отклонением. (D) Способность семи субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК определяется с помощью проточной цитометрии.Образцы крови, лизированные эритроцитами, были разделены на три группы и инкубированы с −sti, + sti или sti + ROSi. После этого каждая субпопуляция нейтрофилов была заблокирована для оценки ROS + клеток. На гистограммах показаны субпопуляции закрытых нейтрофилов в каждой группе: –sti показан черным цветом; + sti отображается красным цветом; + sti + ROSi отображается синим цветом. (E) Процент ROS + клеток в каждой субпопуляции закрытых нейтрофилов из группы + sti. Планки погрешностей указывают среднее значение со стандартным отклонением. (F) ROS gMFI FC каждой закрытой субпопуляции нейтрофилов от группы + sti до группы -sti.Статистика: (B, E, F) различия между группами определяли с помощью обычного одностороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки с одной объединенной дисперсией. (C) Обычный двухфакторный дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Сидака с индивидуальными дисперсиями, рассчитанными для каждого сравнения, были выполнены для сравнения между группами + зимозан и -зимозан. Планки погрешностей указывают среднее ± стандартное отклонение. Значения P были рассчитаны на основе двусторонних сравнений с 95% доверительным интервалом и показаны в стиле APA. APA, Американская психологическая ассоциация; ANOVA, дисперсионный анализ; FC, изменение кратности; gMFI — средняя геометрическая интенсивность флуоресценции; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; Эритроциты, эритроциты; АФК, активные формы кислорода; ROSi, ингибитор активных форм кислорода; SSC-A, −sti, без стимуляции; + sti, только индуктор АФК (пиоцианин).

Мы сосредоточились на обогащенном клетками кластере CD66b ⁺ для анализа гетерогенности нейтрофилов во всех образцах пациентов. Наши результаты показывают, что эти образцы содержали CD117 ⁺ CD66b ⁺ , популяцию hNeP (рисунок 4A), которую мы ранее идентифицировали.13 Кроме того, анализ FlowSOM22 выявил еще шесть кластеров нейтрофилов (обозначенных Cneut1 — Cneut6, рисунок 4B). , каждый с отличными профилями маркеров поверхности (рис. 4C). Кровь двух случайно выбранных здоровых доноров использовалась в качестве контрольной группы для определения популяции добросовестных нейтрофилов крови (дополнительный рисунок 2A онлайн).По сравнению с нейтрофилами крови здоровых доноров, нейтрофилы пациентов с меланомой демонстрировали более высокую гетерогенность, а частота наибольшего кластера нейтрофилов (Cneut2) снизилась с> 95% у здоровых доноров до <90% у пациентов с меланомой (дополнительный рисунок 2B онлайн). Профиль маркеров Cneut2 в здоровой крови существенно не отличался от профиля Cneut2 у пациентов с меланомой (дополнительный рисунок 2C онлайн). Поскольку маркеры зрелости обычно используются для различения субпопуляций циркулирующих нейтрофилов при раке, 12 23 мы затем количественно оценили экспрессию этих маркеров в нейтрофилах, сгруппированных по Cneut1-Cneut6.Мы обнаружили, что кластер Cneut2 экспрессирует высокие уровни CD101, CD10 и CD16 по сравнению с другими кластерами, что указывает на его обогащение терминально дифференцированными зрелыми нейтрофилами (рис. 4C, D) .7 Кроме того, кластеры CD10 ^lo (Cneut1 и Cneut3- Cneut6) экспрессируют пониженные уровни CD101, подчеркивая их незрелость12 по сравнению с кластером Cneut2 (рисунок 4D). Нейтрофилы, объединенные в кластеры Cneut1, Cneut3 и Cneut6, экспрессируют маркеры предшественников (CD34 и CD117) на более низком уровне, чем hNeP, но на более высоком уровне, чем другие кластеры (рисунок 4D и дополнительный рисунок 3A онлайн).В кластере Cneut5 экспрессия CD34 и CD117 была снижена по сравнению с Cneut1, Cneut3 и Cneut6 (дополнительный рисунок 3A онлайн). Напротив, уровни CD10 и CD16 были выше в кластере Cneut5 по сравнению с Cneut3 и Cneut6, что указывает на то, что этот кластер обозначает незрелые нейтрофилы (рисунок 4D). Более того, Cneut3 и Cneut6 экспрессируют CD101 ^— CD49d ⁺ , что позволяет предположить, что эти кластеры принадлежат к популяции preNeu.

Рисунок 4

Анализ крови пациентов с меланомой на основе CyTOF выявляет семь автоматизированных кластеров нейтрофилов.Нейтрофилы крови (автоматизированный кластер CD66b ⁺ из дополнительного онлайн-рисунка 1В) от не получавших лечения пациентов с меланомой были подвергнуты автоматическому анализу. (A) Средние интенсивности экспрессии CD117 и CD66b показаны на карте viSNE в виде точек, окрашенных в спектр (низкий синий, высокий красный). hNeP был идентифицирован на карте viSNE на основании экспрессии CD117 ⁺ CD66b ⁺ . (B) Анализ FlowSOM результатов viSNE выявил семь автоматизированных кластеров. (C) Тепловая карта показывает среднюю интенсивность каждого маркера в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах в глобальном масштабе.(D) Точечный график показывает среднюю интенсивность каждого маркера зрелости в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах. Каждая точка представляет результат одного пациента. (E) Точечный график показывает среднюю интенсивность каждого функционального маркера в шести неидентифицированных автоматизированных кластерах. Каждая точка представляет результат одного пациента. CyTOF, цитометрия по времени пролета; FlowSOM, анализ данных массовой цитометрии с самоорганизующейся картой; hNeP, предшественник нейтрофилов человека; viSNE, визуализация t-распределенного стохастического вложения соседей.

Мы дополнительно охарактеризовали эти кластеры, сравнивая функциональные маркеры, ранее использовавшиеся для оценки популяций нейтрофилов (рисунок 4E). В соответствии с первоначальными данными на рисунке 4C, Cneut2 выражал самые высокие уровни CXCR2, подтверждая его статус созревания. Интересно, что Cneut3 и Cneut6, которые оба идентифицированы как принадлежащие к пулу CD101 ^— CD49d ⁺ preNeu, демонстрировали разные уровни CD45RA и CD14. CD45RA экспрессировался только Cneut3, тогда как CD14 экспрессировался исключительно Cneut6.Кроме того, Cneut3 демонстрирует более высокие уровни CXCR4 по сравнению с кластером Cneut6, что позволяет предположить, что Cneut3 представляет собой ранее сообщавшуюся стареющую (CXCR4 ⁺ CD49d ⁺ CD62L ^lo ) популяцию нейтрофилов (дополнительный рисунок 3B онлайн) .16 Наконец, Cneut1 и Cneut6 экспрессировал низкие количества CD16 по сравнению с Cneut2 (фигура 4D) и окрашивался положительно на CD62L (фигура 4E), что позволяет предположить, что эти клетки представляют собой клетки CD16 ^dim CD62L ^{яркой полосы} , которые были описаны ранее.8 В целом, наш подход позволил воспроизвести как новые, так и установившиеся популяции нейтрофилов из периферической крови пациентов с меланомой.

Гетерогенность нейтрофилов коррелирует со стадией меланомы

Основываясь на вышеупомянутых результатах, мы попытались определить частоту каждого кластера нейтрофилов в образцах наших пациентов. Мы не наблюдали обогащения определенных кластеров нейтрофилов, связанных с демографическими данными пациента, такими как возраст и пол, или характеристиками опухоли, такими как анатомическое расположение или статус изъязвления.Никаких существенных корреляций между изменениями частоты кластеров и демографическими данными пациентов, описанными в таблице 2, не наблюдалось. Однако общая частота предшественников / незрелых нейтрофилов (hNeP, Cneut1 и Cneut3-Cneut5) увеличилась до четырех раз с прогнозом заболевания (рисунок 1A и онлайн-версия). дополнительная фигура 4A, B), тогда как положительная корреляция наблюдалась между процентом Cneut2 от общего числа нейтрофилов со стадией меланомы (Pearson r = 0,5473, p = 0,023), определенной с помощью регрессионного анализа (рисунок 1B).Таким образом, мы предположили, что различные паттерны гетерогенности нейтрофилов, демонстрируемые частотами кластеров, позволяют прогнозировать стадию заболевания. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разделили пациентов на четыре разные группы (A – D) на основе этих паттернов, как было проанализировано viSNE (рисунок 1C и дополнительные рисунки 4C, D в Интернете). Из этого анализа мы определили, что пациенты в группе C имеют самые высокие частоты hNeP, Cneut1 и Cneut3. Пациенты, включенные в группу D, имеют самые высокие частоты Cneut4 и Cneut5 (рисунок 1D).Частота Cneut2 постепенно снижается в группах пациентов A – D. Затем мы исследовали стадию меланомы у пациентов в этих четырех группах (рис. 1E). Интересно, что у всех пациентов в группе A была диагностирована ранняя стадия рака, тогда как в группах C и D был самый высокий процент пациентов со стадией III и стадией IV. Эти результаты предполагают, что определенные паттерны гетерогенности нейтрофилов связаны с прогрессированием меланомы и могут помочь в группировке пациентов и диагностике.

Проточная цитометрия восстанавливает семь субпопуляций нейтрофилов в крови пациентов с меланомой

Затем мы спросили, можно ли использовать маркеры, выделенные в нашем анализе in silico, для разработки стратегии ручного стробирования для репликации семи кластеров нейтрофилов, идентифицированных CyTOF (рисунок 2A и онлайн-дополнительный рисунок 5).Таким образом, мы сначала использовали ручное стробирование, чтобы изолировать общее количество нейтрофилов из данных CyTOF. Эти клетки перекрывались с 90% нашего автоматизированного обогащенного клетками кластера CD66b ⁺ за счет ретроспективного анализа (дополнительный рисунок 5 онлайн). После применения ручного гейт для нейтрофилов CD66 ⁺ мы суммировали семь субпопуляций, исследуя паттерны экспрессии CD117, CD79b, CD45RA, CD16, CD49d, CD101 и CD10. Чтобы проверить, отражают ли популяции, введенные вручную, автоматизированные кластеры, мы проверили эту стратегию гейтирования путем (1) обратного стробирования выбранных вручную субпопуляций на автоматизированную карту viSNE и (2) обратного стробирования автоматизированных кластеров на ручные ворота (онлайн-дополнительный рисунок 6AB). .Оба метода подтвердили, что наша стратегия ручного стробирования способна успешно изолировать CyTOF-идентифицированные hNeP и кластеры нейтрофилов Cneut1-Cneut6.

Затем мы дополнительно проверили эту стратегию ручного стробирования (онлайн-дополнительный рисунок 4 и рисунок 2A) с помощью проточной цитометрии (онлайн-дополнительный рисунок 6C и рисунок 2B, C). Чтобы подтвердить применимость этих результатов в отношении рака, мы исследовали гетерогенность нейтрофилов у пяти здоровых доноров (возраст 23–46 лет, две женщины, трое мужчин) и сравнили их с пятью дополнительными не леченными ранее пациентами с меланомой (в возрасте 59–79 лет). лет, две женщины и трое мужчин).Мы наблюдали, что популяция Cneut2 составляла> 95% от общего количества нейтрофилов у здоровых доноров, тогда как другие популяции (hNeP, Cneut1, Cneut3, Cneut4, Cneut5 и Cneut6) выявлялись редко (рисунок 2C, D). Более того, по сравнению со здоровыми донорами, эти субпопуляции (hNeP, Cneut1, Cneut3, Cneut4, Cneut5 и Cneut6) чаще появлялись у не получавших лечения пациентов с меланомой, которые составляли> 10% общего количества нейтрофилов, по данным проточной цитометрии. Однако частота Cneut2 была снижена до <90% от общего количества нейтрофилов в крови пациентов с меланомой.Этот результат согласуется с результатами CyTOF, которые мы наблюдали на дополнительном рисунке 2, и предыдущими результатами, показывающими, что как незрелые нейтрофилы, так и preNeus мобилизуются при раке24 25

Семь субпопуляций нейтрофилов выполняют различные иммунные функции

После этого мы попытались определить, проявляют ли семь идентифицированных нами субпопуляций нейтрофилов уникальные иммунологические фенотипы. Фагоцитоз и образование АФК — две основные функции нейтрофилов в иммунной системе.26 Таким образом, мы оценили фагоцитарную способность и способность продуцировать АФК семи субпопуляций нейтрофилов.

Семь субпопуляций нейтрофилов от трех случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет, одна женщина и двое мужчин) были проанализированы на предмет их фагоцитоза предварительно меченных частиц зимозана. Поглощение частиц зимозана субпопуляциями нейтрофилов затем определяли количественно путем стробирования с помощью проточной цитометрии (красный цвет в группе с добавлением зимозана (+ зимозан), верхние панели рис. 3A) и сравнивали с контрольной группой (без добавления зимозана (-зимозан). рисунок 3А нижних панелей).Чтобы определить фагоцитарную способность каждой субпопуляции, мы сравнили зимозан-положительную часть (Zym + Neuts) в каждой субпопуляции нейтрофилов из группы с добавлением зимозана (+ зимозан). Поразительно, что каждая субпопуляция нейтрофилов выполняла фагоцитоз с разным уровнем эффективности. Наши результаты показывают, что популяции hNeP и Cneut1 демонстрируют самые высокие фагоцитарные способности (рис. 3B, C). Действительно, фагоцитарные способности hNeP и Cneut1 были сопоставимы или выше, чем у моноцитов, собранных от одних и тех же доноров (онлайн-дополнительные рисунки 7A, B).Более того, фагоцитарные способности других субпопуляций были снижены в 3 раза до> 20 раз (рис. 3B, C). Несмотря на то, что Cneut2 и Cneut5 обладают более низкой фагоцитарной способностью по сравнению с hNeP и Cneut1, они были наиболее распространенными субпопуляциями нейтрофилов в крови пациентов с меланомой (рисунки 1 и 4). Следовательно, абсолютные количества клеток Zym + Cneut2 и Cneut5 по-прежнему составляют наибольшую часть (около 50%) всех фагоцитарных (Zym +) нейтрофилов и около 25% от общего количества фагоцитарных лейкоцитов CD45 ⁺ (онлайн-дополнительные рисунки 7C, D).

Наконец, мы попытались определить способность субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК. Семь субпопуляций нейтрофилов от трех дополнительных случайно выбранных пациентов с меланомой (возраст 59, 77 и 79 лет, одна женщина и двое мужчин) были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Способность закрытых нейтрофилов продуцировать ROS оценивалась в трех экспериментальных группах: без стимуляции (-sti), только индуктор ROS (пиоцианин) (+ sti) или индуктор ROS плюс ингибитор ROS (+ sti + ROSi). Мы установили, что все семь субпопуляций нейтрофилов производили АФК при стимуляции пиоцианином и реагировали на ингибитор (рисунок 3D).Однако эти клетки значительно отличаются друг от друга по способности продуцировать АФК. Например, субпопуляции Cneut2 и Cneut5 показали самый высокий процент клеток ROS + в группе только с индуктором (+ sti) (рис. 3E). Между тем, популяции Cneut4 и Cneut6 показали самую низкую способность продуцировать АФК из всех субпопуляций, с уровнями, сопоставимыми с уровнями, производимыми моноцитами (рисунок 3E и дополнительный рисунок 7E онлайн). Чтобы исключить вмешательство из-за неиндуктор-специфической продукции ROS каждой популяцией во время инкубации, мы сравнили кратное изменение (FC) ROS gMFI в группе, получавшей только индуктор (+ sti), с группой без стимуляции (-sti).Результат FC согласуется с нашим наблюдением, что N ₂ имеет самую высокую способность производить ROS (рисунок 3F). Кроме того, мы обнаружили, что все субпопуляции ответили на ROSi на разных уровнях. Короче говоря, предварительная обработка ROSi блокировала продукцию ROS в Cneut2 на 85%, тогда как эффективность блокирования достигла только около 25% в Cneut4 (дополнительный рисунок 7F в Интернете). Вместе наши данные показывают, что семь субпопуляций нейтрофилов обладают разными иммунологическими возможностями.

Обсуждение

Гетерогенность нейтрофилов стала активной областью исследований, особенно в отношении прогрессирования рака.18 Нейтрофилы выполняют противоположные функции при раке, либо убивая раковые клетки (противоопухолевые функции), либо способствуя росту опухоли (противоопухолевые функции) .18 Такие наблюдения уже давно свидетельствуют о существовании различных субпопуляций нейтрофилов. Традиционно подтипы нейтрофилов разделяли с помощью методов градиентного центрифугирования и без использования характеристики поверхностных маркеров, особенно в исследованиях, связанных с раком.1 18 Появление проточной цитометрии показало, что нейтрофилы экспрессируют разнообразный набор профилей поверхностных антигенов.27 Однако из-за ограничений, накладываемых проточной цитометрией, исследователям приходилось произвольно выбирать только несколько поверхностных маркеров для исследования в любой конкретный момент времени. Например, исследования рака легких традиционно используют один набор маркеров для определения представляющих интерес нейтрофилов, тогда как исследования инфекционных заболеваний используют другой набор маркеров; это также относится к работе над ролью нейтрофилов как в гематопоэзе, так и в ангиогенезе.15 19 Следовательно, субпопуляции нейтрофилов, о которых сообщают разные группы, имеют общие индивидуальные особенности, такие как CD66b и / или CD15, но различаются в отношении оценки других поверхностных антигенов.Таким образом, отсутствие согласованных маркеров нейтрофилов и их функциональных субпопуляций остается проблемой при идентификации субпопуляций, имеющих отношение к заболеванию.

Высокомерный анализ нейтрофилов на уровне отдельных клеток необходим для решения проблем, связанных с идентификацией консенсусных маркеров нейтрофилов. Чтобы удовлетворить этот спрос, мы и другие использовали CyTOF для исследования новых предшественников / предшественников нейтрофилов в BM.12 13 Zilionis и его коллеги сообщили о всестороннем анализе гетерогенности миелоидных клеток с помощью одноклеточной транскриптомики при немелкоклеточном раке легкого.17 Это исследование обнаружило у этих пациентов шесть популяций нейтрофилов крови с уникальными генами; также была обнаружена популяция, подобная миелоидным предшественникам, но она осталась не охарактеризованной. Однако гены, кодирующие поверхностные маркеры, не обсуждались в этом исследовании, что затрудняет сравнение этих нейтрофилов и миелоидных предшественников с установленными субпопуляциями нейтрофилов.

Здесь мы стремились установить парадигму для характеристики гетерогенности нейтрофилов и корреляции конкретных подмножеств нейтрофилов с серьезностью рака.Таким образом, мы разработали панель CyTOF для оценки экспрессии наиболее часто используемых поверхностных антигенов в образцах нейтрофилов от пациентов с меланомой. Мы идентифицировали семь кластеров нейтрофилов в крови пациентов с меланомой, ранее не получавших лечения, с помощью CyTOF и представили доказательства, указывающие на то, что несколько ранее идентифицированных субпопуляций нейтрофилов перекрываются друг с другом6, 12, 16 и / или представляют собой смешанный пул.7 8 Это исследование также предоставило поток стратегия стробирования цитометрии, основанная на нашей работе CyTOF, для повторения этих семи субпопуляций нейтрофилов.Наши результаты показывают, что эти субпопуляции демонстрируют разную способность фагоцитировать дебрис и производить АФК. Интересно, что снижение способности Т-клеток как связывать димеры пептид-MHC, так и отвечать на специфические пептиды индуцируется продуцированием ROS на основе миелоидных клеток.28 И наоборот, было показано, что производство ROS миелоидом необходимо для антиген-специфической отзывчивость как CD4 +, так и CD8 + T-клеток.29 Эту противоречивую роль ROS в регуляции активности T-клеток можно частично объяснить двойной ролью ROS; при низких и умеренных концентрациях АФК полезны для выживания клеток, тогда как высокие уровни АФК могут вызывать гибель клеток.30 Таким образом, способность этих семи субпопуляций нейтрофилов продуцировать АФК предполагает, что они могут выполнять различные роли в регуляции ответов Т-клеток при раке. Интересно, что наши результаты показывают заметное сходство между этими субпопуляциями и ранее зарегистрированными подтипами нейтрофилов с незрелыми состояниями развития. Мы предполагаем, что наблюдаемая нами гетерогенность нейтрофилов, полученных от пациентов с раком, может быть связана с привлечением популяций preNeus и незрелых нейтрофилов из BM в кровоток с помощью связанных с раком цитокинов, таких как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор.Поскольку панель CyTOF, используемая в этом исследовании, является селективной для нейтрофилов крови человека и маркеров рака, наши результаты не отражают гетерогенность нейтрофилов по видам, органам и / или различным заболеваниям. Более высокие измерения неоднородности внутри наших зарегистрированных субпопуляций в таких биологических условиях должны быть в центре внимания будущей работы. Некоторые редкие субпопуляции нейтрофилов, такие как экспрессирующие Т-клеточные рецепторы (TCR) 31, также могут быть потеряны во время стробирования. Более того, мы не можем исключить возможность фенотипического переключения между этими семью субпопуляциями и, таким образом, считаем это понятие интересным направлением для последующего наблюдения.