И тут мы переходим к машинному обучению, которое вы еще не упоминали. Зачем оно здесь?

В нашей теоретической работе мы вывели формулу, которая позволяет реконструировать объект из множества измеренных фототоков. Но этот вывод сделан в предположении, что нет никаких аберраций, пыли, диафрагма — гауссова, моды местного осциллятора тоже идеальные, все идеально. А на практике этим, конечно, даже и не пахнет.

J — фототок, E — напряженность поля, m и n — индексы моды по осям x и y соответственно

Поделиться

И насколько сильно реальная ситуация отличается от идеального случая? Насколько далеко мы от того, чтобы использовать эту формулу?

Точность (fidelity) приготовления мод местного осциллятора у нас не ниже 95 процентов. Но для применения нашего оригинального метода этого мало, потому что моды низких порядков дают сигнал на несколько порядков величины выше, чем моды высоких порядков. То есть если сигнал от моды (0,0) будет отличаться на 5 процентов от теоретического, то сигнал от моды (20,20) окажется совершенно бесполезен.

Чтобы не заморачиваться с достижением идеальной ситуации, мы используем нейронную сеть. На вход сети подаются фототоки для каждой из мод, а на выходе должно быть восстановленное изображение объекта. Для того, чтобы обучить наш «микроскоп», мы показываем ему десятки тысяч образцов известной формы и измеряем фототоки в четырехстах модах. В обученную таким образом сеть можно ввести фототоки от неизвестного объекта, и она восстановит изображение этого объекта.

Обучение нейросети: A — пример DMD-изображения из обучающей выборки, B — полученные фототоки (амплитуда и фаза), C — схема нейросети, D — восстановленное изображение (HGM — эрмит-гауссова микроскопия, Hermite-Gaussian microscopy)

Anastasia Pushkina et al. / arXiv.org, 2021

Поделиться

Результаты говорят сами за себя. Разрешение удалось увеличить примерно в два раза.

То есть мы и дифракционный предел преодолеваем в два раза?

Как я говорил, в нашей установке мы его нарочно ухудшили. Но этот искусственно ухудшенный дифракционный предел мы действительно превосходим в два раза.

DMD-изображение логотипа Оксфордского университета (слева), его изображения, полученные без анализа поперечных мод (по центру) и с помощью эрмит-гауссовой микроскопии (справа). Снизу — изображения пар параллельных отрезков, по которым можно оценить предел разрешения

Изображение предоставлено Александром Львовским

Поделиться

Границы применимости метода

Пока вы показали на одном примере, что разложение на поперечные моды можно использовать для конкретного макроскопического случая с конкретным источником света. Можно ли как-то оценить, насколько хорошо этот метод будет работать для других объектов, других длин волн или другой интенсивности излучения?

Наша цель на ближайшие несколько лет — добиться применимости этого метода в практической микроскопии. Понятно, что та игрушка, которую мы сейчас построили, для этого не годится. На практике нужно, во-первых, научиться работать с реальными микроскопическими объектами и объективами. То есть никакой DMD уже не подойдет. Понадобится микроскопический образец со сложной, но заранее известной формой. Двигая и поворачивая образец перед нашим объективом, мы получим множество наборов фототоков, которые можно использовать в качестве обучающей выборки.

Вторая проблема в том, что наш эксперимент сделан с когерентным светом. А реальные микроскопические образцы, как правило, некогерентны. Но с этой проблемой мы вроде бы уже разобрались, и в ближайшее время эти результаты опубликуем.

А каким образом вам удалось решить проблему некогерентности?

В том эксперименте, который опубликован, мы демонстрировали на экране DMD сразу всю секцию объекта. А в той работе, которую мы делаем сейчас, мы ее показываем пиксель за пикселем и суммируем квадраты модулей фототоков — это получается эквивалентно некогерентному объекту.

И самая противная задача — это следующая. Как я говорил, мы используем гетеродинирование для измерения сигнала в каждой моде. А гетеродиннный детектор работает, только когда сигнал и местный осциллятор очень близки по частоте — в пределах единиц гигагерц. На практике же сигнал во флуоресцентной микроскопии гораздо более широкополосный — десятки нанометров. Поэтому нам потребуется принципиально другой способ измерения сигнала в каждой эрмит-гауссовой моде.

У вас есть идеи, как этого добиться?

Да, есть методы «сортировки» приходящего оптического сигнала на каналы, каждый из которых содержит свою эрмит-гауссову моду. Есть даже фирмы-стартапы, которые продают соответствующие приборы. Но эта технология пока в процессе зарождения, и нам нужно будет ее улучшить. Плюс приспособить к нашему микроскопу, к нашим нейронным сетям.

Там наверняка будет много подводных камней — потребуется пара лет. Еще одна диссертация. Кстати, мы сейчас как раз ищем аспиранта для этой работы — пишите нам, если интересно.

Ну хорошо, допустим, вы сделаете микроскоп. Чем он будет лучше по сравнению с ближнепольными микроскопами или какими-нибудь нелинейными методами?

Мы не должны дотрагиваться до объекта для того, чтобы увеличить разрешение. В этом смысле наш метод гораздо более универсален.

То есть основное преимущество — именно в том, что вы можете это делать на расстоянии из-за того, что работаете в дальнем поле?

Вообще без взаимодействия с объектом. Наш метод может оказаться полезен, например, для исследования звезд, для дистанционных измерений (remote sensing), в военном деле, для фотографии. В принципе, он может произвести революцию вообще во всей науке и технологии получения оптических изображений.

Получается, с точки зрения науки такой подход перспективен скорее для астрономических наблюдений? Или для микроскопии — тоже?

Я думаю, что и для того, и для другого. В микроскопии тоже есть много «хрупких» объектов, которые не приспособлены ни для ближнего поля, ни для нелинейной микроскопии, но к которым может подойти наш метод.

А от длины волны применимость метода как-то зависит? Теоретически ведь такой подход работает не только для видимого света?

Длина волны вообще нерелевантна.

То есть можно собрать такую же схему, например, на рентгеновском излучении?

Фундаментальных ограничений нет, но понятно, что сортировать моды на рентгене никакого удовольствия не доставит: для рентгена нет пространственных модуляторов света.

В начале разговора я спросил, преодолевает ли метод Манькэя Цана дифракционный предел. Вы ответили, что пока непонятно, но разве ваш эксперимент не говорит, что преодолевает?

Нет, тут дело тонкое. Теория Манькэя Цана учитывает интенсивность приходящего сигнала: чем больше фотонов, тем более точно можно восстановить объект. В наших же работах — и теоретической, и экспериментальной, — интенсивность света настолько высока, что можно пренебречь дробовым шумом, возникающим из-за дискретной природы света.

Моделирование оптического дробового шума: на каждом следующем изображении число фотонов, приходящихся на один пиксель, увеличивается

Mdf / wikimedia commons / CC BY-SA 3. 0

Поделиться

А какое вообще минимальное число фотонов требуется, чтобы получить изображение таким методом? И не наткнемся ли мы в какой-то момент на новый дифракционный предел, уже квантовый?

Это не качественный вопрос, а количественный. То есть нет такого, что при 100 фотонах картинка получится, а при 99 — нет. Чем больше фотонов — тем лучше картинка, причем это верно и для нашей эрмит-гауссовой микроскопии, и для стандартного метода.

Квантовый дифракционный предел существует, то есть можно предсказать точно, какого разрешения в принципе можно добиться при заданном числе фотонов. И для каждого конкретного метода измерения можно рассчитать, насколько он близок к этому пределу. Наш метод, основанный на идее Манькэя Цана, оказывается ближе к квантово-оптимальному, чем классический.

Насколько ближе?

Это зависит от конкретной задачи, от тех параметров изображения, которые нам нужно получить. Тут как раз начинаются те теоретические трудности, о которых я говорил в начале. К счастью, мы экспериментаторы — чтобы сделать интересную работу, нам не обязательно знать ответы на все вопросы.

Беседовал Александр Дубов

Лазерная наногравировка позволяет преодолеть дифракционный предел – Наука – Коммерсантъ

661 5 мин. …

В лаборатории нанобиофотоники Института химической физики РАН получены многообещающие результаты в области микро- и наногравировки поверхностей с использованием импульсного лазерного излучения.

Распределение интенсивности света в фокальной плоскости объектива источника света: в однородной среде (a), позади кремниевой (b) или полистереновой (c) микросферы в воде. Интенсивность показана изменением цвета от черного и синего (наименьшая интенсивность) к красному и белому (наивысшая интенсивность)

Фото: Shakhov, A. M., Astafiev, A. A., Plutenko, D. O., Sarkisov, O. M., Shushin, A. I., & Nadtochenko, V.

Во многих областях техники возникает необходимость создать заданный микрорельеф. Это бывает нужно для схем микрофлюидики, при производстве оптических микросенсоров, оптических интегральных микросхем или их элементов: фотонных кристаллов, волноводов, микролазеров.

Сложность такой работы в том, что при нанесении гравировки и при контроле результата оптическими методами их точность (пространственное разрешение) ограничена так называемым дифракционным пределом.

В обыденной жизни видимые нами предметы имеют более или менее контрастные очертания, а распределение света и тени дает представление о форме предмета и даже о фактуре его поверхности. Все это возможно только потому, что свет, играющий роль «щупа» в нашем визуальном восприятии, имеет чрезвычайно малую длину волны.

Сталкиваясь с препятствием, размеры которого сравнимы с длиной волны, свет будет огибать его, проникая в область геометрической тени (именно это явление первоначально и называлось дифракцией). Попадая на узкую щель, свет будет расходиться по разным направлениям, а не только в направлении первоначального движения. Две точки, от которых идет свет, будут практически неразличимы, если расстояние между ними меньше половины длины волны. Именно это расстояние и называется дифракционным пределом.

Иными словами, возможность отличить друг от друга две близко расположенных точки определяется не свойствами оптического прибора, а свойствами самого света. Кстати, это одна из причин, по которой в физических исследованиях часто используют коротковолновое излучение — в ультрафиолетовом или рентгеновском диапазоне. Для видимого же света предел пространственного разрешения около 200-400 нм.

ICP — аббревиатура английского названия Института химической физики им. Н.Н. Семенова, в котором разработана методика нанесения рельефного изображения на поверхность (стекла, сапфира, полимерных пленок) с помощью лазерного излучения, сфокусированного микросферами кремния (показана на схеме)

Фото: Shakhov, A., Astafiev, A., Gulin, A., & Nadtochenko, V. (2015)

Описанная проблема, таким образом, возникает из-за наличия у света волновых свойств. При переходе к мелким пространственным масштабам свет оказывается не совокупностью бесконечно тонких прямолинейных лучей, отражаемых и преломляемых под четко определенными углами, а волнами, расходящимися во все стороны, как круги по воде.

В физике это называют переходом от геометрической оптики к оптике волновой. Однако волновая оптика тоже является предельным случаем общего электромагнитного описания явлений. Она работает на больших расстояниях от источника излучения, в так называемом дальнем поле. В непосредственной же близости от источника (а таковым в оптике будет любая отражающая свет поверхность), в так называемом ближнем поле, распределение электрического и магнитного полей будет подчиняться совсем иным закономерностям.

Ближнее поле хорошо изучено в радиофизике, где оно может составлять метры и более вокруг излучающей антенны и относительно легко доступно для исследования. Сама идея использовать принципы физики ближнего поля в оптической микроскопии возникла еще в 1920-х годах. Но лишь в начале 1980-х годов были получены первые оптические изображения с разрешением в 20 раз меньше длины волны.

Принципы ближнепольной оптики можно применить не только для получения микроскопических изображений поверхности, но и, наоборот, для создания на ней нужного нам распределения электромагнитных полей — для ее обработки. Для этой цели в качестве микролинз ближнего поля мы применили кварцевые микрошарики размером порядка 1 микрона.

Производство кварцевых микрошариков (glass microspheres) началось еще в 1950-х годах. Простые и дешевые в изготовлении, сейчас они используются в разных целях в нефте- и горнодобывающей промышленности, при производстве красок и строительных материалов, косметики и разнообразных потребительских товаров. Небольшие вариации в диаметре и сферичности микрошариков не сказываются на разрешении и точности получаемых изображений.

Замечательно то, что эти шарики можно захватить лазерным излучением: при высокочастотном (более 80 МГц) импульсном лазерном излучении диэлектрическая кварцевая частица втягивается в область наиболее интенсивного электромагнитного поля в лазерном луче. Этот эффект в последние годы широко используется в самых разных областях науки и техники и известен как «лазерный пинцет» или «оптическая ловушка». В нашем случае один и тот же лазерный луч может использоваться и для воздействия на вещество поверхности, и для управления кварцевой частицей.

Распределение интенсивности излучения в световом пятне, полученном в ближнем поле такой микролинзы, будет иметь заметный градиент (см. рис.). Можно подобрать параметры излучения (интенсивность, длительность воздействия импульса и некоторые другие) так, что в нужной нам области лазерное излучение окажет нужное нам тепловое, термохимическое или фотохимическое действие на материал. Причем размер этой области может быть гораздо меньше, чем дифракционный предел. Нам уже удалось уменьшить размер области, которую мы способны обработать лазерным излучением, до 1/8-1/11 длины волны, вместо «стандартного» предела в 1/2.

При этом лазер отнюдь не прожигает освещаемый им участок поверхности, а вызывает его химическую модификацию. Например, если мы воздействуем излучением на поверхность кварца (представляющего собой оксид кремния, SiO2), то она теряет кислород. Сначала после обработки поверхности кварца лазером на ней возникают микропики (в месте точечного воздействия лазерного луча) или микровалы (по ходу лазерного луча). Происходит это из-за теплового расширения кварца и его «вскипания» при выделении кислорода. И лишь после последующего травления щелочью, вымывающей кремний, на микрорельефе кварца на месте пиков возникают ямки, а на месте валов — траншеи (см. рис.).

С учетом пространственного разрешения (десятки нанометров) наш метод следовало бы назвать наногравировкой (в научном лексиконе чаще используется термин наноструктурирование поверхности). В настоящее время структурирование поверхности в таких пространственных масштабах возможно только с помощью ионной или ультрафиолетовой литографии, однако эти технологии несравнимо дороже и сложнее в использовании. Технология, описанная здесь, открывает широкие возможности для развития целого нового направления, известного как Lab-on-a-chip («лаборатория на чипе») и чрезвычайно востребованного в последнее время не только в научных, но и, например, в медицинских задачах.

Василий Птушенко, кандидат физико-математических наук;

Александр Шахов, кандидат физико-математических наук;

Артем Астафьев, кандидат физико-математических наук;

Виктор Надточенко, доктор химических наук, профессор, Институт химической физики РАН

Фото: Shakhov, A. , Astafiev, A., Gulin, A., & Nadtochenko, V. (2015)

— нанесение на поверхность полимерного светочувствительного материала (фоторезиста), который под воздействием ультрафиолетового излучения становится растворимым и удаляется растворителем. Используются «глубокое» (deep ultra violet, DUV) или «жесткое» (extreme ultra violet, EUV) ультрафиолетовое излучение с длинами волны около 200 нм или 13,5 нм соответственно. Технология обеспечивает разрешение до нескольких нанометров. Есть и ряд недостатков: сложность и дороговизна получения EUV достаточно высокой мощности, поглощение EUV практически любыми материалами, в том числе и компонентами оптических схем, необходимость работы в вакууме.

Ионная (или ионно-лучевая) литография — нанесение изображения на поверхность с помощью пучков ионов, как правило, протонов или альфа-частиц. В силу высокой чувствительности материалов к облучению потоком относительно тяжелых заряженных частиц позволяет отказываться от использования полимерного фоторезиста. Обеспечивает разрешение до 10 нм.

Микрофлюидика (микрогидродинамика) — наука о поведении жидкостей на микро- и нанопространственных масштабах. Основные области применения — технические устройства малых размеров (например, устройства струйной печати), медицина и молекулярная биология.

За дифракционным пределом | Nature Photonics

За пределами дифракционного предела

Скачать PDF

Скачать PDF

• Опубликовано: Июль 2009 г.

Природа Фотоника том 3 , стр. 361 (2009 г.) Процитировать эту статью

• 28 тыс. обращений

• 28 цитирований

• 33 Альтметрический

• Детали показателей

Появление схем визуализации, способных преодолевать дифракционный барьер Аббе, произвело революцию в оптической микроскопии.

В 1873 году немецкий физик Эрнст Аббе понял, что разрешающая способность оптических приборов, включая телескопы и микроскопы, существенно ограничена дифракцией света. Его открытие показало, что, в конечном счете, разрешение прибора для формирования изображения ограничено не качеством прибора, а длиной волны используемого света и апертурой его оптики. Это означало, что микроскоп не мог разрешить два объекта, расположенных ближе, чем на λ /2NA, где λ — длина волны света, а NA — числовая апертура формирующего изображения объектива.

Это ограниченное дифракцией явление препятствовало работе оптической микроскопии более века и считалось фундаментальным нерушимым правилом. Однако в последнее время появилось несколько новых захватывающих подходов к визуализации, которые могут «нарушить» это правило при определенных обстоятельствах. Теперь кажется, что нет никаких фундаментальных ограничений в достижении пространственного разрешения; используя видимый свет, с этими подходами можно разрешить до нескольких нанометров.

Чтобы отпраздновать эти события, в этом выпуске основное внимание уделяется методам визуализации со сверхвысоким разрешением, которые работают за пределами дифракционного предела. Можно найти сборник статей о различных методах визуализации — от флуоресценции в дальней зоне до плазмоники. Сборник состоит из обзорной статьи, промежуточной статьи, двух комментариев и интервью.

Авторы и права: XIAOWEI ZHUANG/HARVARD UNIVERSITY

В интервью на стр. 368 У. Э. Мёрнер подчеркивает некоторые невероятные преимущества визуализации, когда она не ограничена дифракцией ¹ . Такие методы не только позволяют неинвазивно исследовать внутреннюю часть биологических клеток, но и обещают нановизуализацию полупроводниковых устройств в электронной промышленности. Мёрнер элегантно обобщает преимущества и недостатки различных подходов к визуализации с ограничением субдифракции, разработанных на сегодняшний день, а также обсуждает будущие перспективы таких методов.

Читая эти статьи, вы обнаружите, что техники можно разделить на несколько групп. Во-первых, существуют подходы для ближнего и дальнего поля: первые работают близко к образцу, часто собирая исчезающие сигналы, которые быстро затухают, но содержат дополнительную информацию о образце, тогда как вторые собирают оптические сигналы (обычно флуоресценцию) на обычном рабочем расстоянии. . Затем методы визуализации на основе флуоресценции можно разделить на отдельные категории в зависимости от того, как они рассматривают природу образца — либо как набор отдельных молекулярных меток, либо как флуорофор с постоянно меняющейся плотностью. Методы, включающие переключение оптических сигналов, также можно разделить на категории по тому, как они обеспечивают разделение сигналов — либо за счет целенаправленного переключения сигналов, либо за счет стохастического переключения одной молекулы.

Подход, который, несомненно, вызвал большой интерес в сообществе специалистов по визуализации в дальнем поле, — это микроскопия истощения стимулированного излучения, впервые предложенная Стефаном Хеллом. На странице 381 Хелл и его коллеги рассматривают недавний прогресс в трехмерной визуализации прозрачных флуоресцентных объектов с использованием наноскопии дальнего поля ² . Они объясняют, как две противоположные линзы в сочетании с включением и выключением флуоресценции между соседними маркерами могут преодолевать дифракционный барьер. Хотя приведенными примерами являются микроскопия истощения стимулированного излучения и микроскопия локализации фотоактивации, авторы ожидают, что схемы с двумя линзами могут быть применены к другим подходам и, в конечном итоге, станут центральными для трехмерной оптической визуализации в дальней зоне на наноуровне.

В биологии стохастическая оптическая реконструктивная микроскопия — метод, использующий обнаружение отдельных молекул и фотопереключаемые зонды для получения флуоресцентного изображения с высоким разрешением — теперь позволяет визуализировать внутреннюю часть клетки с беспрецедентным уровнем детализации. На странице 365 Xiaowei Zhuang объясняет, как с помощью этого подхода можно достичь пространственного разрешения в несколько десятков нанометров ³ . Она также описывает, как многоцветная трехмерная стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия может быть эффективно использована для визуализации молекулярных структур в клетках.

На странице 362 Райнер Хайнцманн и Матс Густафссон более широко рассматривают проблему субдифракционного изображения и обсуждают, что необходимо для того, чтобы это стало возможным. Они объясняют, почему использование пространственно-неоднородного освещения и образца с нелинейным фотооткликом являются единственными двумя фундаментальными требованиями для визуализации сверхвысокого разрешения пространственно непрерывного распределения флуоресценции ⁴ .

Помимо флуоресценции, поверхностные плазмоны (которые либо возбуждаются на металлической поверхности, либо локализованы в небольшом металлическом наконечнике) также обеспечивают метод преодоления дифракционного предела света. В обзорной статье Сатоши Каваты и его коллег на странице 388 комментируется потенциал плазмоники для улучшения изображений 9.0054 5 .

Как объясняет Мёрнер в интервью, все эти различные подходы к изображению за пределами «дифракционного предела» дополняют друг друга. Ясно одно: достижения в области визуализации сверхвысокого разрешения сокращают разрыв между оптической микроскопией и схемами визуализации сверхвысокого разрешения (такими как рентгеновская или электронная микроскопия), которые основаны на гораздо более коротких длинах волн, чем видимый свет. Появление оптических микроскопов сверхвысокого разрешения позволит наблюдать за миром вокруг нас с новым уровнем ясности. Это почти наверняка приведет к созданию очень захватывающей новой науки, особенно в области биологии, но не ограничиваясь ею.

Ссылки

1. Вон Р. Фотон природы. 3 , 368–369 (2009).

   Артикул Google ученый

2. Хелл, С. В., Шмидт, Р. и Эгнер, А. Фотон природы. 3 , 381–387 (2009).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

3. Zhuang, X. Фотон природы. 3 , 365–367 (2009 г.).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

4. Хайнцманн Р. и Густафссон М.Г.Л. Фотон природы. 3 , 362–364 (2009).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

5. Кавата С., Иноуэ Ю. и Верма П. Фотон природы. 3 , 388–394 (2009).

   ОБЪЯВЛЕНИЕ Статья Google ученый

Скачать ссылки

Права и разрешения

Перепечатка и разрешения

Об этой статье

Эта статья цитируется

• Интеллектуальная квантовая статистическая визуализация за пределами критерия Аббе-Рэлея

  • Нараян Бхусал
  • Мингюань Хун
  • Омар С. Маганья-Лоайса

  npj Квантовая информация (2022)

• Характеристика проводящих тонких пленок ZnO, легированных алюминием, для плазмонных применений

  • Ф. Ф. Масулех
  • И. Синно
  • К. П. Мур

  Прикладная физика А (2018)

• Белок, ингибирующий апоптоз нейронов (NAIP), локализуется в цитокинетическом механизме во время клеточного деления.

  
  • Франсиско Абадиа-Молина
  • Вирджиния Морон-Кальвенте
  • Алекс Маккензи

  Научные отчеты (2017)

Скачать PDF

Дифракционный предел света

• 28 июня 2017 г. 28/06/17
• Стандартный

Введение в дифракционную предел света

микроскопия, которая использует видимый свет и линзы для увеличения изображений очень маленьких образцов. Это стандартный метод, часто используемый в областях науки о жизни и материаловедении.

Первые базовые оптические/световые микроскопы были разработаны в 17 веке. В настоящее время доступно множество вариантов, обеспечивающих высокое разрешение и контрастность образцов. Благодаря компьютерному оптическому проектированию и методам автоматического шлифования качество изображений улучшилось в геометрической прогрессии практически без отклонений [1].

Однако оптические микроскопы по-прежнему должны преодолевать критический предел оптического разрешения, вызванный дифракцией волновых фронтов видимого света, когда они проходят через круглую апертуру в задней фокальной плоскости объектива или линзы.

 

Рисунок 1: Схема предела дифракции

Discover Cubix

Сумма технологий 3D-культивирования клеток следующего поколения.

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

Дифракционный предел в контексте микроскопии сверхвысокого разрешения

Существует множество факторов, которые могут повлиять на конечное разрешение оптической системы обработки изображений, такой как микроскоп, но наиболее важным из них является дифракционный предел света .

Разрешение микроскопа обратно пропорционально длине волны наблюдаемого света и прямо пропорционально размеру самого объектива.

Еще в 1873 году немецкий физик Эрнст Аббе обнаружил, что микроскопы имеют ограничения из-за дифракции света. Его исследования показали, что разрешение микроскопа связано не с качеством самих компонентов микроскопа, а с длиной волны используемого света и апертурой оптики.

Из-за этого явления микроскоп не может разрешить два объекта, если они расположены на расстоянии, меньшем, чем λ/2NA, где λ — длина волны света, а NA — числовая апертура формирующего изображение объектива. Это означает, что предел дифракции света не позволяет микроскопу различать два объекта, разделенных латеральным расстоянием, которое меньше половины длины волны света, использованного для изображения образца [2-3].

Аббе обнаружил, что изображения состоят из массива дифракционно-ограниченных точек с изменяемой интенсивностью, которые накладываются друг на друга для получения окончательного изображения. Есть несколько вариантов перекрытия этих ограничений и максимизации пространственного разрешения и контраста изображения для уменьшения размера пятен, ограниченных дифракцией света . Например, можно уменьшить длину волны изображения, увеличить числовую апертуру или использовать среду изображения с большим показателем преломления [4].

 

Рисунок 2: Схема, показывающая разницу между хорошим и плохим разрешением с учетом дифракционного предела света

---

Как преодолеть

Дифракционный предел света ?

Микроскопия со структурированным освещением сверхвысокого разрешения увеличивает пространственное разрешение в два раза по сравнению с широкопольной микроскопией. В 2D/3D -SIM поперечное и осевое разрешение улучшены на 100 нм и 250 нм соответственно.

Преимущества SR-SIM

SR-SIM также позволяет получать 4D-изображения с высокой частотой кадров. Обычно для 2D/3D- SIM необходимо иметь девять необработанных изображений, а для STORM/PALM – не менее тысячи.

Возможно использование обычных флуорофоров, дающих доступ к существующим биологическим мутированным клеточным линиям.

До четырех различных длин волн[1] можно использовать с микроскопией Structure Illumination , что делает этот метод очень полезным для совместной локализации или доступа к множеству информации с высоким разрешением внутри клеток и органелл.

Наконец, подготовка образцов для наблюдений SR-SIM проще, чем для других методов сверхвысокого разрешения, таких как STED или STLM[2].

Ограничения SR-SIM

Этот метод микроскопии сверхвысокого разрешения очень чувствителен к расфокусированному свету, и его очень трудно сфокусировать на толстых образцах или образцах с плотной меткой[3].

Кроме того, в то время как методы PALM/STORM или STED могут достигать латерального дифракционного предела 20 нм , микроскопия со структурированным освещением ограничена 200 нм[4].

Наконец, во время реконструкции изображения могут возникать некоторые артефакты, которые могут ухудшить качество изображения [5].

Рисунок 3: Схема различных этапов до, во время и после наблюдений SR-SIM, включая подготовку образца, наблюдение и реконструкцию изображений [5].

Откройте для себя CubiX

Эмуляция физиологии клеток и тканей человека

УЗНАТЬ БОЛЬШЕ

Ссылка

Библиография/Источники

[1] Сидор А.М., Чиммек К.Дж., Пухнер Э.М., Меннелла В. Микроскопия сверхвысокого разрешения: от одиночных молекул до супрамолекулярных ансамблей. Trends Cell Biol [Интернет]. 2015 [цитировано 15 июня 2017 г.]; 25: 730–48. http://www.cell.com/trends/cell-biology/pdf/S0962-8924(15)00191-9.pdf

[2] Wegel E, Göhler A, Lagerholm BC, Wainman A, Uphoff S , Кауфманн Р. и соавт. Визуализация клеточных структур в сверхвысоком разрешении с помощью SIM, STED и локализационной микроскопии: практическое сравнение. Научный представитель [Интернет]. 2016;6(1):27290. http://www.nature.com/articles/srep27290

[3] Jost A, Heintzmann R. Многомерная визуализация сверхвысокого разрешения с микроскопией структурированного освещения. Annu Rev Mater Res [Интернет]. 2013 г., июль [цитировано 16 июня 2017 г.]; 43 (1): 261–82. http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-matsci-071312-121648

[4] Энрикес Р., Мхланга М.М. PALM и STORM: Что скрывается за пределом Рэлея? Биотехнолог J [Интернет]. 2009 г., июнь [цитировано 21 июня 2017 г.]; 4 (6): 846–57. http://doi.wiley.com/10.1002/biot.200

4

[5] Kraus F, Miron E, Demmerle J, Chitiashvili T, Budco A, Alle Q, et al. Количественная трехмерная структурированная световая микроскопия ядерных структур. Нат Проток [Интернет]. 2017;12(5):1011–28. http://www.nature.com/doifinder/10.1038/nprot.2017.020

Автор: Пабло Салаверрия

СТУДЕНТ ДОКУМЕНТА | ИННОВАЦИОННЫЙ БЛОК | h3020-MSCA-ITN-DIVIDE

---

Pablo является частью европейской сети h3020-MSCA-ITN-ETN-DivIDE. УЧИТЬ БОЛЬШЕ.

Теги:

Преодоление дифракционного барьера: визуализация клеток со сверхвысоким разрешением

• Список журналов
• Рукописи авторов HHS
• PMC3272504

Сотовый. Авторская рукопись; доступно в PMC 2012 5 февраля.

Опубликовано в окончательной редакции как:

Моб. 2010 23 декабря; 143(7): 1047–1058.

doi: 10.1016/j.cell.2010.12.002

PMCID: PMC3272504

NIHMSID: NIHMS261393

PMID: 21168201

, ¹ , ² and ^{2, 3, *}

Информация об авторе Информация об авторских правах и лицензии Отказ от ответственности

Дополнительные материалы

Любой, кто использовал световой микроскоп, хотел бы, чтобы его разрешение было немного лучше. Теперь, после столетий постепенных улучшений, флуоресцентная микроскопия совершила качественный скачок в своей разрешающей способности, в значительной степени благодаря достижениям за последние несколько лет в новой области исследований, называемой флуоресцентной микроскопией сверхвысокого разрешения. В этом учебнике мы объясняем принципы различных подходов к сверхвысокому разрешению, таких как STED, (S)SIM и STORM/(F)PALM. Затем мы описываем недавние применения микроскопии сверхвысокого разрешения в клетках, которые демонстрируют, как эти подходы начинают давать новое понимание клеточной биологии, микробиологии и нейробиологии.

На протяжении веков световая микроскопия значительно облегчала нам понимание того, как функционируют клетки. На самом деле целые области биологии возникли из изображений, полученных под световым микроскопом. Например, более 300 лет назад Антони ван Левенгук использовал свои самозаземляющиеся оптические линзы, чтобы обнаружить бактерии и положить начало области микробиологии. Затем, примерно 200 лет спустя, Рамон-и-Кахаль использовал световые микроскопы для визуализации срезов мозга, окрашенных методом Гольджи, и создания красивых рисунков нейронов, что привело к его гениальному видению того, как информация течет в нервной системе, и помогло сформировать современную нейробиологию.

Действительно, одним из основных элементов, который делает световую микроскопию столь эффективной в биологических исследованиях, является разработка различных методов окрашивания, позволяющих маркировать определенные молекулы и клетки. Например, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) обнаруживает молекулы ДНК и РНК со специфическими последовательностями, тогда как иммунофлуоресцентные метки и флуоресцентные белки позволяют визуализировать определенные белки в клетках (Giepmans et al., 2006). Даже отдельные молекулы внутри живой клетки могут быть визуализированы, если эти стратегии мечения сочетаются с высокочувствительными оптическими схемами и детекторами (Lord et al., 2010; Xie et al., 2008).

Непревзойденное сочетание молекулярно-специфического контраста и возможности визуализации живых клеток делает флуоресцентную микроскопию самым популярным методом визуализации в клеточной биологии. Просмотрите любой журнал по клеточной биологии, и вы увидите, что влияние флуоресцентной микроскопии очевидно: > 80% изображений клеток в книге обычно получают с помощью флуоресцентного микроскопа. Однако применение флуоресцентной микроскопии во многих областях биологии все еще затруднено из-за ее умеренного разрешения в несколько сотен нанометров. Это разрешение примерно соответствует размеру органеллы и, таким образом, недостаточно для анализа внутренней архитектуры многих субклеточных структур.

Разрешение оптической микроскопии ограничено дифракцией или «распространением» световой волны, когда она проходит через маленькое отверстие или фокусируется в маленькое пятно. Поскольку это свойство присуще всем волнам, преодоление дифракционного барьера световой микроскопии долгое время считалось невозможным. Однако такие ограничения не помешали небольшой группе ученых заняться флуоресцентной микроскопией «сверхразрешения», которая преодолевает этот, казалось бы, непреодолимый барьер.

Риск с лихвой окупился. Недавно эти исследовательские группы разработали несколько методов оптической микроскопии, которые разрушили дифракционный барьер, улучшив пространственное разрешение на порядок или более по сравнению с дифракционным пределом. Самое главное, эти методы начинают давать представление о биологических процессах на клеточном и молекулярном уровне, что до сих пор было недостижимо. В этом учебнике мы рассматриваем технологические достижения в развивающейся области «флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения». Затем мы опишем применение этих методов в различных областях биологии, которые быстро продемонстрировали большие перспективы этой захватывающей новой области биоимиджинга.

Когда свет фокусируется объективом микроскопа, понятия световых «лучей», сходящихся к бесконечно острой «фокусной точке», не происходит. Вместо этого световая волна образует размытое фокальное пятно конечного размера за счет дифракции (). Размер пятна зависит от длины волны света и угла, под которым сходится световая волна; последняя, ​​в свою очередь, определяется числовой апертурой объектива. Ширина пятна на полумаксимальной интенсивности (т. е. полная ширина на половине максимальной) составляет ~0,6 λ/NA, где λ — длина волны света, а NA — числовая апертура линзы. Точно так же точечный излучатель, такой как одиночная флуоресцентная молекула, также выглядит как размытое пятно конечного размера при изображении через микроскоп. Профиль интенсивности этого пятна, который определяет функцию рассеяния точки (ФРТ) микроскопа, имеет примерно такую ​​же ширину, как и у фокального пятна, описанного выше. Следовательно, два одинаковых излучателя, разнесенные на расстояние меньше ширины ФРТ, будут выглядеть как единый объект, что сделает их неразрешимыми друг от друга ().

Открыть в отдельном окне

Дифракционно-ограниченное разрешение обычной световой микроскопии

(A) Фокусное пятно типичного объектива с высокой числовой апертурой, изображенное голубым эллипсовидом, имеет ширину ~250 нм в поперечном направлении направлениях и ~550 нм в аксиальном направлении. Аналогичную ширину имеет и изображение точечного излучателя, отображаемое через объектив, а именно функция рассеяния точки. Эти значения ширины определяют разрешение, ограниченное дифракцией. Два объекта, разделенные расстоянием, превышающим этот предел разрешения, отображаются на изображении как два отдельных объекта. В противном случае они отображаются как единое целое (т. е. неразрешимые). Эти два случая иллюстрируются двумя поперечными сечениями изображения микротрубочек, голубыми кривыми A и B на правой панели, в соответствующих положениях, обозначенных белыми линиями на средней панели.

(B) Шкала размеров различных биологических структур в сравнении с разрешением, ограниченным дифракцией. (Слева направо) Клетка млекопитающего, бактериальная клетка, митохондрия, вирус гриппа, рибосома, зеленый флуоресцентный белок и небольшая молекула (тимин).

Этот предел разрешающей способности был впервые обнаружен Эрнстом Аббе около 150 лет назад, поэтому его также называют пределом Аббе (Abbe, 1873). Дифракционно-ограниченное разрешение изображения объектива с высокой числовой апертурой составляет ~250 нм перпендикулярно направлению распространения света (т. е. в латеральном измерении) и 550 нм параллельно направлению распространения света (т. е. в аксиальном измерении). ) (). Многие субклеточные структуры меньше этих пределов разрешения, и, следовательно, они неразрешимы с помощью световых микроскопов.

В течение многих лет несколько методов визуализации раздвинули границы дифракционного предела световой микроскопии. Среди этих методов конфокальная микроскопия и многофотонная флуоресцентная микроскопия не только повышают разрешение изображения, но также уменьшают флуоресцентный фон вне фокуса, позволяя делать оптические срезы и, таким образом, получать трехмерные изображения. Кроме того, инфракрасный свет меньше рассеивается тканями, что позволяет проводить визуализацию глубоких тканей с помощью двухфотонной микроскопии (Zipfel et al., 2003). 4Pi микроскопия и I ⁵ M используют два противоположных объектива для увеличения эффективной числовой апертуры микроскопа и, таким образом, улучшения разрешения изображения (Gustafsson et al., 1995; Hell and Stelzer, 1992; Hell, 2003). Хотя эти методы значительно улучшают разрешение, они по-прежнему принципиально ограничены дифракцией и на практике достигают разрешения ~100 нм во всех трех измерениях (Hell, 2003).

Разрешение, ограниченное дифракцией, имеет место только для света, который распространился на расстояние, существенно превышающее его длину волны (т. е. в дальнем поле). Таким образом, один из способов обойти это ограничение состоит в том, чтобы поместить источник возбуждения или детекторный зонд (обычно оптическое волокно, металлический наконечник или просто небольшую апертуру) рядом с образцом (т. е. в ближнем поле) (Synge, 19).28). Действительно, микроскопия ближнего поля достигла разрешения значительно ниже 100 нм (Betzig et al., 1986; Lewis et al., 1984; Novotny and Hecht, 2006; Pohl et al., 1984). Однако требование, чтобы источник возбуждения или датчик детектирования находился физически близко к целевому объекту (часто в пределах десятков нанометров), затруднило исследование «внутри» клетки или кусочка ткани с помощью микроскопии ближнего поля, что ограничивает применение этот метод в биологии.

Только недавно несколько новых подходов к флуоресцентной микроскопии полностью разрушили дифракционный предел разрешения изображений в дальней зоне. В общем, все эти подходы генерируют «изображения без ограничений дифракции» за счет использования физических свойств флуоресцентных зондов для различения излучения двух соседних молекул в области с ограничениями дифракции. Эти подходы сверхвысокого разрешения можно разделить на два основных класса. Первая категория — это ансамблевые подходы к визуализации, в которых используется паттернированное освещение для пространственной модуляции флуоресцентного поведения молекул в пределах дифракционно-ограниченной области, так что не все из них излучают одновременно, тем самым достигается субдифракционное предельное разрешение. Эта категория включает микроскопию истощения стимулированного излучения (STED) (Hell and Wichmann, 19).94; Klar and Hell, 1999) и родственная технология RESOLFT (Hofmann et al., 2005), а также микроскопия с насыщенным структурированным освещением (SSIM) (Gustafsson, 2005; Heintzmann et al., 2002). Вторая категория использует преимущества визуализации одной молекулы, используя фотопереключение или другие механизмы для стохастической активации отдельных молекул в пределах дифракционно-ограниченной области в разное время. Затем изображения с разрешением субдифракционного предела реконструируются из измеренных положений отдельных флуорофоров. Этот второй класс был назван микроскопией стохастической оптической реконструкции (STORM) (Rust et al., 2006), фотоактивируемой микроскопией локализации (PALM) (Betzig et al., 2006) и микроскопией флуоресцентной фотоактивации локализации (FPALM) (Hess et al. , 2006).

Хотя эти две категории методов используют разные подходы к достижению разрешения субдифракции, эти методы также имеют важные общие черты. В обоих случаях физическое или химическое свойство флуорофора используется для поддержания соседних молекул в разных состояниях (т. е. «включено» и «выключено»), что позволяет отделить их друг от друга (Hell, 2007).

В этой категории методов к образцу применяется структурированное поле света для управления флуоресцентным сигналом, испускаемым его флуорофорами. Эта пространственная модуляция может быть реализована как «позитивным», так и «негативным» образом. В положительном случае световое поле, используемое для возбуждения образца и генерации флуоресценции, имеет прямое структурирование. Напротив, подход с негативным паттернированием заручается помощью дополнительного структурированного светового поля для подавления популяции молекул, которые могут флуоресцировать в образце. В обоих этих подходах пространственная информация, закодированная в шаблоне освещения, позволяет отличить соседние флуорофоры друг от друга, что приводит к повышению пространственного разрешения.

Негативное формирование рисунка: микроскопия STED и RESOLFT

В микроскопии STED узорчатое освещение препятствует излучению флуорофоров (Hell, 2007; Hell and Wichmann, 1994; Klar and Hell, 1999). Это подавление достигается за счет стимулированного излучения, процесса, в котором источник света, называемый светом истощения, переводит возбужденный флуорофор в состояние с наименьшей энергией (то есть в основное состояние), прежде чем он сможет излучать сигнал флуоресценции. На практике истощающий свет применяется в виде рисунка, окружающего фокальное пятно возбуждающего лазера. Это уменьшает размер области флуоресцирующих молекул, как будто «фокусное пятно» микроскопа заостряется (). Сканирование этого заостренного пятна на образце позволяет записать изображение со сверхвысоким разрешением. Таким образом, этот подход к формированию отрицательного паттерна элегантно генерирует положительное изображение без необходимости какой-либо обработки после получения изображения.

Открыть в отдельном окне

Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения с направленным освещением

(A) В микроскопии с истощением стимулированной эмиссии (STED) флуорофоры возбуждаются сфокусированным лучом света (зеленый, верхний слой) и дополнительным истощением световой луч (красный, второй слой) используется для возвращения молекул в основное состояние с помощью процесса, называемого вынужденным излучением. Профиль интенсивности этого дополнительного луча в фокальной плоскости обычно имеет кольцеобразную форму, истощая популяцию молекул, которые могут генерировать флуоресценцию, особенно вблизи края фокального пятна. Эффективность истощения может быть описана красным рисунком, показанным в третьем слое. Этот эффект истощения существенно уменьшает размер флуоресцентного пятна (оранжевый, нижний слой), тем самым улучшая разрешение изображения.

(B) В микроскопии структурированного освещения (SIM) и насыщенного SIM (SSIM) используется структурированное освещение для возбуждения образца и генерации флуоресценции. Это структурированное возбуждение обычно имеет синусоидальную форму (зеленый цвет, верхний слой). Такое освещение генерирует флуоресцентный образец аналогичной формы, когда флуоресценция реагирует линейно (оранжевый, средний слой). При сильном возбуждении флуоресценция насыщается, создавая насыщенный профиль излучения с узкими темными областями (оранжевый, нижний слой), которые обеспечивают пространственную информацию существенно за пределами дифракционного предела.

(C) Примеры изображений STED. (Вверху) Сравнение конфокального (слева) и STED (справа) изображения внешней мембраны митохондрий, иммуномеченой против белка TOM20. На панели STED показано поперечное сечение xy трехмерного изображения isoSTED. (Внизу слева) Двухцветное isoSTED-изображение TOM20 (зеленый) и матричного белка HSP70 (красный). (Внизу справа) Трехмерная визуализация isoSTED-изображения TOM20. Перепечатано с разрешения Macmillan Publishers Ltd: Nature Methods Schmidt et al., 2008. Перепечатано с разрешения Schmidt et al., 2009, Американское химическое общество.

(D) Примеры изображений 3D SIM. (Вверху) Центральный разрез конфокального изображения ядра, окрашенного на ДНК, ламин B и комплекс ядерных пор. ДНК (синий) окрашена DAPI. Ламин B (зеленый) и комплекс ядерных пор (красный) окрашены иммунохроматографией. Правые панели показывают увеличенные изображения рамочной области на левой панели. (Внизу) Соответствующие 3D-изображения SIM-карты. Из Schemelleh et al., 2008. Перепечатано с разрешения AAAS.

Важно отметить, что сама световая картина истощения создается той же оптикой с ограничением дифракции. Следовательно, если флуорофоры реагируют на истощающий свет линейным образом, увеличение разрешения будет довольно ограниченным. STED-микроскопия превосходит этот предел, используя преимущества реакции насыщения флуорофоров: как только интенсивность истощающего лазера превышает уровень насыщения, количество флуорофоров, остающихся в возбужденном состоянии (и, таким образом, способных генерировать флуоресценцию), приближается к нулю. Таким образом, когда к образцу прикладывается кольцеобразный истощающий свет с пиковой интенсивностью, значительно превышающей уровень насыщения, только молекулы в небольшой области вблизи центра кольца могут генерировать флуоресценцию. Размер этой области и, следовательно, разрешающая способность микроскопа масштабируются примерно обратным квадратным корнем из интенсивности обедняющего света (или δ≈Δ∕1+Idep/Isat, где δ — разрешение, Δ — полное ширина на половине максимума размера фокусного пятна, ограниченного дифракцией, и I _dep — интенсивность истощающего лазера) (Hell, 2007).

В принципе, этот подход позволяет неограниченно улучшать разрешение при бесконечно сильном источнике обеднения. На практике на разрешение STED влияет ряд факторов, в том числе аберрации в оптике, рассеяние от образца и фотостабильность флуорофоров. STED-микроскопия достигла замечательного разрешения 6 нм, используя высокую интенсивность истощения для изображения флуоресцентных дефектов в алмазах, которые почти никогда не подвергаются фотообесцвечиванию (Rittweger et al., 2009).). На биологических образцах визуализация STED достигла разрешения 20 нм при использовании органических красителей и разрешения 50–70 нм при использовании флуоресцентных белков (http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/STED_Dyes.html).

В дополнение к стимулированному излучению другие насыщающиеся оптические переходы, переводящие молекулу в темное состояние, также могут использоваться для уменьшения площади молекул, флуоресцирующих в фокусном пятне (Bretschneider et al., 2007; Hofmann et al., 2005). . Это расширение подхода STED, называемое микроскопией обратимых насыщаемых оптически линейных флуоресцентных переходов (RESOLFT), позволяет реализовать сверхвысокое разрешение с существенно более низкой интенсивностью света, вызывая меньшее повреждение хрупких биологических образцов (Hell, 2007; Hofmann et al. , 2005).

Позитивное паттернирование: микроскопия со структурированным освещением

Микроскопия со структурированным освещением (SIM) улучшает разрешение изображения за счет использования позитивного паттерна возбуждающего света (Heintzmann and Gustafsson, 2009), который обычно представляет собой синусоидальный паттерн, созданный путем объединения (т. е. интерференции) двух световые лучи. В результате моментальный снимок образца становится произведением самой структуры образца и этой картины возбуждения (). Затем окончательное изображение реконструируется с помощью вычислений из нескольких снимков, собранных путем сканирования и поворота шаблона. В этом процессе дополнительная пространственная модуляция от схемы возбуждения повышает пространственное разрешение реконструированного изображения (Gustafsson, 2000; Heintzmann and Cremer, 19).99).

Как и в случае исчерпанной световой картины, используемой в STED, световая картина, создаваемая интерференцией, также ограничивается дифракцией. Следовательно, когда сигнал флуоресценции масштабируется линейно с интенсивностью возбуждающего света, SIM приводит только к удвоению пространственного разрешения (), которое составляет ~ 100 нм в латеральных измерениях (Gustafsson, 2000).

Как и в случае с негативным подходом к построению паттерна, насыщающая реакция флуорофора также может быть использована здесь для дальнейшего повышения разрешения (Gustafsson, 2005; Heintzmann et al., 2002). При достаточно сильном возбуждении флуоресцентное излучение флуорофора насыщается. Насыщенный SIM (SSIM) использует это явление для создания четких темных областей, где картина возбуждения имеет нулевую интенсивность, обеспечивая разрешение изображения, значительно превышающее дифракционный предел (). При таком подходе было получено разрешение 50 нм для визуализации флуоресцентных микросфер (Gustafsson, 2005).

Флуоресцентные зонды

Основная форма SIM (т. е. линейная форма) основана не на какой-либо специальной фотофизике флуорофоров, а исключительно на оптике микроскопа. Таким образом, любой флуоресцентный зонд, совместимый с обычной флуоресцентной визуализацией, совместим с SIM. Кроме того, с помощью SIM можно получить многоцветное изображение, как и при обычной флуоресцентной микроскопии. Можно отображать до четырех цветов в диапазоне спектра от видимого до ближнего инфракрасного (ИК) без значительных перекрестных помех между различными цветовыми каналами. В качестве примера показано трехцветное SIM-изображение ДНК, ламина B и комплексов ядерных пор в ядре (Schermelleh et al., 2008). Напротив, для SSIM требуются специальные флуорофоры с высокой фотостабильностью, поскольку в этой схеме визуализации флуорофоры большую часть времени поддерживаются в высокореактивно-возбужденном состоянии.

STED-микроскопия также может использовать широкий спектр существующих флуоресцентных зондов, поскольку все флуорофоры могут подвергаться стимулированной эмиссии (http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/STED_Dyes.html). На практике красители, фотостабильные при сильном истощающем свете, такие как Atto 647N, Atto 590 и Atto 565, обеспечивают более высокое разрешение. Также использовались флуоресцентные белки, такие как усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP) и цитрин. Однако многоцветная визуализация с помощью STED менее гибка по сравнению с обычной флуоресцентной микроскопией. Для изображения одного флуорофора STED-микроскопия требует двух лазеров на противоположных концах спектров поглощения и излучения флуорофора для возбуждения и истощения соответственно. Таким образом, количество цветов, которые могут вписаться в диапазон спектра от видимого до ближнего ИК, ограничено, и до сих пор одновременно отображалось не более двух цветов (Donnert et al., 2007; Schmidt et al., 2008). показано двухцветное STED-изображение митохондриального белка внешней мембраны TOM20 и матричного белка HSP70, полученное с использованием последнего подхода (Schmidt et al., 2008).

Трехмерное изображение

Истощение в STED-микроскопии создается путем введения модулятора пространственного света в лазерный луч до того, как он попадет в микроскоп. Поскольку кольцеобразный рисунок в плоскости xy улучшает латеральное разрешение, рисунок с двумя максимумами вдоль оси z улучшает аксиальное разрешение (Hell, 2003). Наложение этих двух паттернов улучшает разрешение как в латеральном, так и в осевом направлениях (Harke et al., 2008), позволяя получать трехмерные (3D) изображения со сверхвысоким разрешением с разрешением по оси z, примерно в 2,5 раза превышающим разрешение по оси xy. Впоследствии был реализован isoSTED с паттерном истощения z, созданным двумя противоположными объективами с использованием конфигурации 4Pi, с достижением разрешения до ~ 30 нм во всех трех измерениях, как показано на трехмерных изображениях митохондрий, как показано в (Schmidt et al. ., 2008, 2009). Недавно STED-микроскопия также была продемонстрирована с двухфотонным возбуждением, позволяющим получать изображения сверхвысокого разрешения глубоко в образцах тканей (Ding et al., 2009; Moneron and Hell, 2009).

В SIM трехмерный рисунок освещения может быть создан путем интерференции трех световых лучей возбуждения. Как и аналог 2D, 3D SIM может удвоить разрешение во всех трех измерениях, в результате чего разрешение составляет ~100 нм в латеральном направлении и ~300 нм в осевом направлении (Gustafsson et al. , 2008; Schermelleh et al., 2008). . показывает такое трехмерное SIM-изображение ядра. Эту трехмерную схему освещения можно дополнительно комбинировать с I ⁵ M с использованием двух противоположных объективов для достижения изотропного разрешения ~100 нм во всех трех измерениях (Gustafsson et al., 2008). 3D SSIM еще не реализован.

Live Imaging

Для визуализации динамических событий в живых системах решающее значение имеет временное разрешение. Во всех методах визуализации существует внутренний компромисс между пространственным и временным разрешением. Этот компромисс лучше всего можно понять из теории выборки Найквиста. В случае STED-микроскопии, которая получает изображение путем сканирования фокального пятна по образцу, критерий Найквиста требует, чтобы размер шага сканирования был меньше половины желаемого разрешения. Затем временное разрешение определяется временем интегрирования на шаг сканирования, размером шага сканирования и размером поля изображения. Лучшее пространственное разрешение требует меньшего размера шага сканирования и, следовательно, большего времени для получения одного и того же поля зрения.

Таким образом, для достижения высокого временного разрешения можно использовать небольшое поле зрения и относительно большое пространственное разрешение. Например, STED-изображение с впечатляющей скоростью видео (28 кадров в секунду) с пространственным разрешением 62 нм было продемонстрировано в поле зрения ~ 5 мкм ² , что позволяет отслеживать движение отдельных синаптических пузырьков в дендритном шипике ( Вестфаль и др., 2007). В последнее время замена традиционных импульсных лазеров в STED-микроскопии лазерами с непрерывным излучением позволяет значительно ускорить сканирование и, следовательно, повысить временное разрешение (Willig et al., 2007). Используя эту схему, ~70 мкм 9Для получения изображения эндоплазматического ретикулума 0054 2 потребовалось всего 0,19 с (Moneron et al., 2010).

Для изучения очень быстрых процессов микроскопию STED можно комбинировать с флуоресцентной корреляционной спектроскопией (FCS). FCS традиционно используется с конфокальной микроскопией для исследования движения или динамики молекул путем наблюдения за флуктуациями флуоресцентного сигнала. Меньшая область обнаружения в STED позволяет FCS исследовать динамику на гораздо меньшем масштабе длины. Действительно, STED-FCS использовался для мониторинга динамики диффузии с микросекундным временным разрешением и на масштабе длины всего 20 нм (Eggeling et al., 2009).).

SIM получает изображение путем сканирования шаблона освещения, покрывающего все поле изображения. Таким образом, время получения изображения SIM ограничено тем, насколько быстро может модулироваться картина освещения и насколько быстро камера может считывать снимок. Для 2D SIM, который требует девяти различных шаблонов освещения для реконструкции изображения с повышенным разрешением, было продемонстрировано временное разрешение ~ 0,1 с для визуализации живых клеток (Kner et al., 2009). Таким образом, SIM отлично подходит для приложений с живыми клетками, которым требуется большое поле обзора, но не очень высокое пространственное разрешение. Хотя визуализация живых клеток еще не была продемонстрирована с помощью SSIM, можно было бы ожидать, что он будет иметь более высокое пространственное разрешение за счет более низкого временного разрешения по сравнению с SIM, поскольку для реконструкции изображения SSIM требуется больше шаблонов освещения (Gustafsson, 2005). ).

Высокоточная локализация одиночных молекул

По сути, молекулярная сборка определяется координатами каждой из ее составляющих. Следовательно, если бы мы могли отобразить каждую молекулу по отдельности и определить ее положение с высокой точностью, мы могли бы реконструировать изображение сборки с высоким разрешением. После 20 лет развития в области визуализации одиночных молекул (Moerner, 2007) одиночные флуорофоры теперь регулярно выявляются в различных модальностях визуализации, таких как эпифлуоресценция, полное внутреннее отражение, конфокальная и многофотонная микроскопия.

Как только каждый флуоресцентный зонд в образце может быть изображен отдельно, его положение может быть определено с высокой точностью путем нахождения центра изображения одиночной молекулы (Thompson et al. , 2002; Yildiz et al., 2003). Неопределенность в определении положения молекулы (то есть точности локализации) масштабируется примерно обратным квадратным корнем из числа фотонов, обнаруженных молекулой. Его можно аппроксимировать выражением a‒≈∆∕N, где ∆ обозначает ширину дифракционно-ограниченной функции рассеяния точки, а N — количество зарегистрированных фотонов (Thompson et al., 2002). Для ярких флуоресцентных красителей от одной молекулы можно зарегистрировать около миллиона фотонов, что обеспечивает точность локализации ≤ 1 нм (Pertsinidis et al., 2010; Yildiz et al., 2003). Относительное положение нескольких флуорофоров также можно определить, используя различные цвета излучения (Churchman et al., 2005; Lacoste et al., 2000; van Oijen et al., 1998), последовательное фотообесцвечивание отдельных флуорофоров (Gordon et al. al., 2004; Qu et al., 2004), или стохастическое мерцание квантовых точек (Lagerholm et al., 2006; Lidke et al., 2005).

В литературе точность локализации часто указывается как стандартное отклонение нескольких измерений локализации одного объекта, тогда как стандартное отклонение и полная ширина на половине максимума (= 2,35 × стандартное отклонение для распределения Гаусса) использовались как меры разрешения. В этом учебнике мы используем полную ширину на половине максимума для описания разрешения, потому что это лучше иллюстрирует самое близкое разрешимое разделение между объектами.

Стохастическое переключение обеспечивает визуализацию сверхвысокого разрешения

Возможность локализации отдельной молекулы не означает непосредственного получения изображения сверхвысокого разрешения флуоресцентно меченного биологического образца, который может содержать тысячи флуорофоров внутри дифракционно-ограниченной области. Флуоресцентное излучение этих молекул будет настолько сильно перекрываться, что общее изображение будет выглядеть как совершенно невыразительное пятно. На первый взгляд может показаться невозможным различить эти молекулы по отдельности. Однако, если флуоресцентное излучение этих молекул регулируется таким образом, что в каждый момент времени излучается только одна молекула, отдельные молекулы могут быть отображены и локализованы. Эта идея лежит в основе недавно разработанного метода визуализации со сверхвысоким разрешением, названного STORM (Rust et al. , 2006), PALM (Betzig et al., 2006) и FPALM (Hess et al., 2006).

В этом методе фотопереключаемые (или фотоактивируемые) флуорофоры используются для временного контроля излучения. Эти флуорофоры могут быть преобразованы между флуоресцентным (или «включенным») состоянием и темным (или «выключенным») состоянием или состояниями, которые флуоресцируют на разных длинах волн. Следовательно, когда на образец воздействует активирующий свет достаточно низкой интенсивности, только случайное, редкое подмножество флуорофоров активируется во включенное состояние в любое время, что позволяет отображать эти молекулы индивидуально, точно локализовать, а затем деактивировать путем переключения. до обратимого темного состояния или постоянного обесцвечивания. Итерация этого процесса — активация, визуализация и деактивация — затем позволяет нанести на карту расположение многих флуорофоров и построить изображение с высоким разрешением на основе этих локализаций (2), либо с синхронизированной активацией (Betzig et al. , 2006; Hess et al. , 2006; Rust et al., 2006) или с асинхронной активацией (Egner et al., 2007). В этом случае разрешение изображения больше не ограничивается дифракцией, а определяется тем, насколько точно локализован каждый флуорофор. Используя этот подход, было достигнуто разрешение бокового изображения до ~ 20 нм (Rust et al., 2006).

Открыть в отдельном окне

Флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением с переключением одиночных молекул

(A) Этот подход со сверхвысоким разрешением использует фотопереключение флуорофоров для временного разделения изображений одиночных молекул, которые перекрываются в пространстве. В любой момент во время получения изображения только немногочисленное подмножество флуорофоров активируется до состояния флуоресценции, что позволяет отображать эти молекулы по отдельности и, таким образом, локализовать. После нескольких итераций процессов активации и визуализации изображение со сверхвысоким разрешением строится на основе локализации многих флуорофоров.

(B) 3D-изображения, полученные с использованием метода астигматизма с цилиндрической линзой. (Два крайних левых столбца) Обычное изображение покрытых клатрином ямок в клетках млекопитающих, иммуноокрашенных против клатрина, по сравнению с соответствующим трехмерным изображением со сверхвысоким разрешением, показывающим поперечное сечение xy вблизи плазматической мембраны. (В центре) Увеличенные изображения со сверхвысоким разрешением одиночной ямки, покрытой клатрином, в системе бесклеточного восстановления с проекцией xy (вверху), поперечным сечением xy в нижней части ямки (в центре) и перекрестием xz секция, прорезающая середину ямы (дно). (Два крайних правых столбца) Составное трехмерное изображение клатрина (зеленый), динамина (голубой) и белка домена F-BAR FBP17 (красный) в бесклеточной системе. Здесь показано суперположение 59изображения клатрина и FBP17, выровненные по центру областей, покрытых клатрином (слева), и наложение 96 изображений динамин-FBP17, выровненных по центру пятна динамина (справа). Клатрин помечен непосредственно, тогда как динамин и FBP17 помечены иммуномечением. Из Huang et al., 2008 и Wu et al., 2010. Перепечатано с разрешения AAAS.

(C) Трехмерные изображения, полученные с использованием метода интерферометрии с противоположными объективами. (Вверху) xy проекция плазматической мембраны клетки, экспрессирующей фотоактивируемый флуоресцентный белок Eos. Цвет точек локализации кодирует их координаты z. (Внизу) xz поперечное сечение прямоугольной области на верхней панели. Изображения адаптированы из Shtengel et al., 2009 г..

(D) Сравнение изображений STORM/(F)PALM покрытых клатрином ямок, иммуноокрашенных фотопереключаемым красителем Alexa647 (зеленый) или помеченных флуоресцентным белком mEos2 (красный).

Хотя фотопереключение предлагает наиболее универсальную стратегию для достижения временного контроля, необходимого для изображений сверхвысокого разрешения, другие стратегии также могут обеспечить аналогичный контроль в определенных биологических образцах, например, за счет связывания и диссоциации флуоресцентных молекул (Sharonov and Hochstrasser, 2006). . Можно получить разрешение изображения субдифракционного предела, даже если условие изображения одиночной молекулы не выполняется строго. Когда плотность флуорофоров не слишком высока, так что временные колебания соседних пикселей отчетливы, можно использовать корреляционный анализ более высокого порядка временных колебаний отдельных пикселей для существенного улучшения разрешения изображения (Dertinger et al., 2009).).

Флуоресцентные зонды

Требования STORM/(F)PALM налагают несколько ограничений на флуоресцентные зонды. Во-первых, зонды должны иметь флуоресцентное состояние, излучающее свет в определенном диапазоне длин волн, и «темное» состояние, не излучающее свет в этом диапазоне длин волн. Во-вторых, для достижения высокой точности локализации зонды должны излучать большое количество фотонов перед тем, как погаснуть. В-третьих, поскольку только один флуорофор активируется в дифракционно-ограниченной области в любой момент времени, а подавляющее большинство флуорофоров остается в темном состоянии, эмиссия в темном состоянии должна быть минимальной для обеспечения высокоточной локализации активированной молекулы. Наконец, поскольку все переключаемые флуорофоры могут спонтанно активироваться тепловой энергией или визуализирующим лазером (в отличие от активационного лазера), эта спонтанная активация может привести к включению более одного флуорофора в области, ограниченной дифракцией, даже без активационного света, что предотвращает обнаружение одиночных молекул. Следовательно, также желательна низкая скорость спонтанной активации.

Несмотря на эти требования, для визуализации STORM/(F)PALM использовалось большое количество переключаемых флуорофоров (Huang et al., 2009; Patterson et al., 2010). Эти зонды варьируются от органических красителей до флуоресцентных белков (таблица S1 доступна в Интернете), что позволяет маркировать биологические образцы различными методами. Чтобы предоставить читателям общие рекомендации по выбору подходящего флуорофора, мы описываем преимущества и недостатки нескольких переключаемых флуорофоров в дополнительной информации.

Для конкретных экспериментов решение об использовании красителей или флуоресцентных белков зависит от множества факторов, которые обычно применимы ко всем методам флуоресцентной визуализации. Что касается мечения, флуоресцентные белки кодируются генетически, что позволяет легко метить белки в живых клетках флуоресцентными белками. Однако красители более универсальны для мечения различных видов молекул, включая белки, нуклеиновые кислоты, олигосахариды и даже небольшие молекулы. Мечение клеточных белков красителями обычно достигается с помощью иммунофлуоресценции, которая позволяет метить эндогенно экспрессируемые белки, но запрещает большинство приложений для визуализации живых клеток. Что касается оптических свойств, то красители обычно имеют значительно более высокий выход фотонов, что обеспечивает более высокое разрешение изображения, чем у флуоресцентных белков (14). Однако при чрезвычайно высоком разрешении изображения большой размер антитела (10–15 нм) может ограничивать разрешение изображения при использовании иммунофлуоресцентной маркировки. Таким образом, недавно разработанные гибридные системы слияния представляют собой многообещающее решение, которое сочетает в себе достоинства как генетического кодирования, так и превосходных флуоресцентных свойств органических красителей (Fernández-Suárez and Ting, 2008). В этих подходах интересующий белок сливают с маркерным белком или пептидом, который, в свою очередь, проявляет специфическую реактивность или сродство к флуоресцентным красителям с определенными реакционноспособными группами.

3D-визуализация

Путем определения положения отдельных молекул во всех трех измерениях микроскопия сверхвысокого разрешения, основанная на переключении отдельных молекул, может быть расширена до 3D. В первой реализации этого подхода используется простая оптическая схема, в которой используются преимущества астигматизма, при котором световые волны в перпендикулярных направлениях имеют разные фокусные точки. В частности, в тракт визуализации вставляется цилиндрическая линза, так что форма изображения одиночной молекулы становится эллиптической. Это позволяет определить осевое положение молекулы по эллиптичности и боковое положение по центральному положению изображения (Huang et al., 2008). показаны 3D-изображения покрытых клатрином ямок, полученные с помощью этого подхода, разрешающие наноморфологию этих структур (Huang et al. , 2008). В других реализациях использовались различные методы трехмерной локализации, такие как захват расфокусированных изображений в двух разных фокальных плоскостях (Juette et al., 2008), проектирование PSF в форме двойной спирали (Pavani et al., 2009).) и использование зеркала для проецирования осевого вида в латеральном направлении (Tang et al., 2010). При использовании этих методов сообщалось об осевом разрешении 40–70 нм.

Наибольшее аксиальное разрешение в 3D STORM/(F)PALM достигается за счет интерферометрии с использованием двух противоположных объективов аналогично микроскопии 4Pi, и I ⁵ M. показывает четкое разделение вентральной и дорсальной плазматической мембраны в тонком выпячивание клетки с использованием этого метода, демонстрирующее разрешение по оси z 10 нм (Shtengel et al., 2009).). Глубина изображения этого подхода относительно мала по сравнению с подходами подбора PSF, описанными в предыдущем абзаце, но сканирование образца может увеличить глубину изображения всех этих подходов. На практике глубина изображения ограничена сферическими аберрациями из-за несоответствия показателей преломления, рассеяния мутными образцами и фоном с высокой флуоресценцией, возникающим в толстых образцах. Комбинация одномолекулярного переключения с двухфотонным возбуждением/активацией обеспечивает многообещающее решение последних двух проблем (Fölling et al., 2008; Vaziri et al., 2008).

Визуализация живых клеток

Как и в случае STED и SIM, при визуализации STORM/(F)PALM также существует компромисс между пространственным и временным разрешением. В этом случае изображение восстанавливается по локализациям одиночных молекул. При указании пространственного разрешения следует учитывать разрешение Найквиста (определяемое как удвоенное среднее расстояние между соседними локализациями) в дополнение к точности локализации (Shroff et al., 2008). Это соображение эффективно ограничивает временное разрешение временем, необходимым для сбора достаточного количества локализаций, чтобы получить желаемое разрешение Найквиста.

Временное разрешение 25–60 с на кадр было получено при визуализации комплексов фокальной адгезии, меченных флуоресцентным белком Eos (EosFP), с разрешением Найквиста 60–70 нм (Shroff et al., 2008). Аналогичное пространственное и временное разрешение было достигнуто при изучении структуры цитоскелета бактерий с использованием усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP) (Biteen et al., 2008). Эта относительно низкая скорость визуализации частично связана с медленным переключением флуоресцентных белков в темновые состояния, а также с уменьшением выхода фотонов при высоких интенсивностях возбуждения. Использование более ярких и быстро переключающихся органических красителей потенциально может увеличить скорость визуализации. Различные красители были объединены с системами гибридного слияния для получения изображений сверхвысокого разрешения живых клеток (Lee et al., 2010; Testa et al., 2010; Wombacher et al., 2010). Пространственно-временное разрешение, которое может быть достигнуто с помощью фотопереключаемых красителей, еще не охарактеризовано критериями Найквиста.

Фотоактивация также была элегантно объединена с отслеживанием отдельных частиц для визуализации динамических событий живых клеток (Hess et al., 2007; Manley et al., 2008). В отличие от обычных экспериментов по отслеживанию отдельных молекул, которые требуют низкой плотности молекул-мишеней, использование фотопереключаемых зондов позволяет метить и отслеживать высокую плотность молекул-мишеней. Хотя накопление большого количества локализаций, необходимых для определения структуры с высоким разрешением, все еще может занять значительное время, движение и динамика молекул внутри структур могут быть получены с миллисекундным временным разрешением по этим следам одиночных молекул. . Этот режим визуализации значительно расширяет возможности динамической визуализации одиночных молекул.

Несмотря на свою относительно короткую историю, флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения уже применялась во многих областях биологии и начинает оказывать влияние на многочисленные области. В этой статье для начинающих невозможно описать все эти приложения. Вместо этого мы обсудим некоторые репрезентативные примеры из области клеточной биологии, микробиологии и нейробиологии.

В области клеточной биологии

При разработке методов микроскопии сверхвысокого разрешения ряд субклеточных структур с хорошо охарактеризованными морфологическими характеристиками часто выбирался в качестве модельных систем для проверки принципа действия, включая микротрубочки, актин, покрытые клатрином ямки, митохондрии, эндоплазматический ретикулум и комплексы фокальной адгезии. Эти исследования не только продемонстрировали разрешающую способность новых методов сверхвысокого разрешения, но также продемонстрировали потенциал этих методов для визуализации молекулярных структур и взаимодействий в клетках.

Одной из особенно многообещающих областей применения методов микроскопии сверхвысокого разрешения является исследование белков плазматической мембраны и мембранных микродоменов. Эти домены, как правило, слишком малы, чтобы их можно было разрешить с помощью обычной световой микроскопии. Действительно, многие противоречия в этой области, такие как размер и время жизни липидных рафтов, связаны с отсутствием прямых наблюдений за этими микродоменами. Таким образом, микроскопия сверхвысокого разрешения предлагает мощный инструмент для решения этих споров.

Например, STED-микроскопия разрешила отдельные кластеры синтаксин 1 в клетках, что позволило количественно определить количество молекул синтаксин на кластер (~ 90) и размер кластера (50-60 нм) (Sieber et al., 2007). В сочетании с измерениями диффузии путем восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) и компьютерного моделирования STED демонстрирует, что самоассоциация синтаксинов и стерическое отталкивание полностью объясняют размер и динамику синтаксиновых кластеров. Напротив, на кластеризацию никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, возможно, влияют дополнительные механизмы, в том числе белок-белковые взаимодействия, опосредованные холестерином, и мембранно-белковые взаимодействия цитоскелета. Эти результаты объясняют наблюдение, что истощение запасов холестерина влияет как на короткодействующие (~50 нм), так и на длиннодействующие (0,5–3,5 мкм) организации никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (Kellner et al., 2007).

Динамический характер мембранных компонентов требует визуализации живых клеток с высоким временным разрешением. Отслеживание одиночных частиц с высокой плотностью с помощью фотоактивации обеспечивает мощный подход к изучению этой динамики в масштабах времени от миллисекунды до секунды. Исследования гемагглютинина гриппа (Hess et al., 2007), белка Gag ВИЧ, G-белка вируса везикулярного стоматита (VSVG) (Manley et al., 2008) и рецептора эпидермального фактора роста (Subach et al., 2009, 2010) обнаружили гетерогенную кластеризацию и диффузионное поведение этих мембранных белков. В дополнение к этому подходу с отслеживанием отдельных частиц, STED-FCS исследует диффузионное поведение молекул в пределах субдифракционного фокусного пятна с микросекундным временным разрешением. Исследования с помощью STED-FCS обнаружили, что сфинголипиды и GPI-заякоренные белки могут кратковременно (10–20 мс) захватываться ассоциированными с холестерином мембранными доменами размером <20 нм, тогда как фосфоглицеролипиды проявляют свободную диффузию (Eggeling et al., 2009).).

Визуализация сверхвысокого разрешения также позволяет визуализировать тонкие структуры внутри мембранных органелл. Например, биохимические измерения показали, что потенциалзависимые анионные каналы человека (hVDAC) в мембранах митохондрий связаны с цитозольной гексокиназой-1 (Neumann et al., 2010). Напротив, двухцветные STED-изображения митохондрий показали, что значительная часть hVDAC не локализуется совместно с пулом гексокиназы-I, связанной с митохондриями. Изображения STED также показывают, что три подтипа hVDAC существуют в отдельных доменах на внешней мембране митохондрий. IsoSTED разрешил кристы внутренней мембраны митохондрий (Schmidt et al., 2009).), предполагая возможность изучения белковых взаимодействий внутри митохондрий.

STORM/(F)PALM также позволил по-новому взглянуть на организацию белков, связанных с плазматическими мембранами и внутриклеточными мембранными органеллами. Трехмерные изображения со сверхвысоким разрешением, полученные с помощью этого подхода, выявили полусферическую форму клатриновой оболочки на зарождающихся эндоцитарных везикулах (Bates et al., 2007; Huang et al., 2008). В системе модели эндоцитоза in vitro двухцветная 3D-визуализация показала, что два трубкообразующих белка, динамин и белок домена F-BAR FBP17, имеют различное распределение вдоль канальцев мембраны, соединяющих покрытые клатрином ямки и базальную плазматическую мембрану. ). Кроме того, STORM/(F)PALM в сочетании с электронной микроскопией и обычной флуоресцентной визуализацией во времени выявили неожиданную роль FBP17 в создании эндоцитарных везикул (Wu et al., 2010). Визуализация живых клеток с помощью этого подхода также выявила интересную динамику адгезивных комплексов во время их инициации, созревания и растворения (Shroff et al. , 2008). Недавнее 3D исследование со сверхвысоким разрешением выявило мультиламинарную молекулярную архитектуру центральной области фокальной адгезии, которая соединяет интегрин и актин (Kanchanawong et al., 2010). Эта сердцевинная область состоит из интегрин-сигнального слоя, слоя передачи силы и регуляторного слоя актина (Kanchanawong et al., 2010).

Ожидается, что флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения расширит наше понимание структур внутри ядра. Высококонденсированная упаковка ДНК внутри ядра требует визуализации сверхвысокого разрешения со специфичностью белков и последовательностей нуклеиновых кислот, чего трудно достичь любыми другими способами. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения дает возможность разрешить взаимодействие между нуклеиновыми кислотами и белками внутри ядра. Например, исследования с помощью 3D SIM выявили морфологические изменения хромосом и ядерного ламина во время раннего митоза (Schermelleh et al., 2008). Кроме того, STORM/(F)PALM показал многообещающие результаты в разрешении волокон хроматина (Matsuda et al. , 2010). Мы ожидаем, что при дальнейшем улучшении разрешения изображения и мечении нуклеиновых кислот, специфичных для последовательности, с помощью FISH, ДНК / РНК-связывающих белков или аптамеров регуляция экспрессии генов может быть непосредственно визуализирована внутри ядра с использованием изображений сверхвысокого разрешения.

Это лишь несколько примеров, иллюстрирующих влияние флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения на клеточную биологию. Мы с нетерпением ждем возможности получить ответы на новые вопросы благодаря быстрому внедрению инструментов микроскопии сверхвысокого разрешения, особенно с учетом способности этого метода разрешать субклеточные структуры за пределами уровня органелл.

В микробиологии

Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения может стать инструментом визуализации, которого микробиологи давно ждали. У бактерий жизненные процессы протекают в небольшом тесном объеме ~1 мкм ³ , в котором находятся тысячи различных видов белков и РНК. Наше представление о бактериальной структуре претерпело серьезные изменения в последние годы. Теперь мы понимаем, что бактерии не просто представляют собой мешок случайно распределенных молекул, сталкивающихся друг с другом, а содержат высокоорганизованные хромосомы, динамические структуры цитоскелета и специфические субклеточные области, участвующие в процессах передачи сигналов и биосинтеза. Однако наше понимание молекулярной организации бактериальных клеток все еще примитивно.

Этот пробел в наших знаниях связан, прежде всего, с трудностью визуализации такой маленькой клетки, размер которой немногим превышает дифракционный предел оптического разрешения. Действительно, под световым микроскопом большинство структур внутри бактериальной клетки выглядят размытыми. Хотя электронная микроскопия (ЭМ) часто приходит на помощь, когда требуется высокое разрешение изображения, ее применение для визуализации бактерий довольно ограничено. Для получения молекулярно-специфического контраста с ЭМ обычно используется мечение иммунозолотом, и этот подход к мечению требует фиксации клеток и пермеабилизации. К сожалению, этот процесс фиксации и пермеабилизации нарушает структуры внутри бактерий значительно больше, чем внутри эукариотических клеток. Кроме того, живая визуализация пока невозможна с ЭМ.

Высокая молекулярная специфичность, обеспечиваемая различными подходами к флуоресцентному мечению, и совместимость флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения с живыми клетками предлагают идеальное решение проблемы визуализации бактерий. Действительно, этот подход использовался для изучения нескольких различных организаций белков в бактериальных клетках. Например, STORM/(F)PALM использовали для определения распределения белков хемотаксиса Tar рецептора, CheY и CheW в фиксированных клетках Escherichia coli (Greenfield et al., 2009).). Было обнаружено, что эти белки образуют кластеры с экспоненциально распределенными размерами. Расположение кластеров соответствовало стохастической модели самосборки, которая не требует активного транспорта. В Calobactur crescentus визуализация STORM/(F)PALM живых клеток MreB, аналога актина, выявила спиральную организацию белка (Biteen et al. , 2008). Подобный подход был также использован для изучения аппарата разделения (Par) у C. crescentus . Эти исследования показали, что ATPase ParA образует узкую, линейную полимерную структуру, которая проходит через центр тела клетки, функционируя подобно митотическим веретенам, наблюдаемым в эукариотических клетках (Ptacin et al., 2010).

Эти ранние применения изображений сверхвысокого разрешения для бактериальных клеток показали большие перспективы этого подхода. Принимая во внимание наши примитивные знания об организации хромосом и белков в бактериях, мы ожидаем, что флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения изменит микробиологию в ближайшие годы.

In Neurobiology

С тех пор, как Кахаль более века назад наблюдал окрашенные по Гольджи нейроны под световым микроскопом, мы знали, что мозг функционирует, посылая информацию от аксонов к дендритам нейронов. Следовательно, «схема соединений», подробно описывающая, как нейроны связаны друг с другом, обеспечит структурную основу для понимания функций мозга, а также его нарушений при неврологических расстройствах. Однако такая схема подключения еще не получена, кроме Caenorhabditis elegans (White et al., 1986). Почему бы и нет? Небольшой диаметр нейритов (всего несколько десятков нанометров) и высокая плотность их упаковки требуют разрешения изображения в нанометровом масштабе для отслеживания проводов. Более того, чтобы аннотировать схему соединений, нам нужно идентифицировать нейронные связи (то есть синапсы) и охарактеризовать их свойства. Эти свойства зависят от молекулярного состава синапсов и поэтому требуют визуализации с молекулярной специфичностью. На самом деле синаптическая функция управляется сложным белковым механизмом, состоящим из сотен видов белков, упакованных вместе в структуру субмикронного размера. Понимание синаптической функции и пластичности требует детальной характеристики организации и динамики этих молекул в определенных синаптических участках. Таким образом, метод картирования нейронных цепей требует молекулярно-специфического контраста, разрешения в нанометровом масштабе и, в идеале, возможности визуализации живых тканей. Этим требованиям однозначно удовлетворяет флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения.

Действительно, нейробиология является одной из первых дисциплин, в которой была применена флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения. Одной из продуктивных областей применения является изучение субнейрональных структур, таких как синапсы. Изображения STED белка активной зоны Bruchpilot в нервно-мышечном соединении у Drosophila выявили распределение в форме пончика с центром в активных зонах синапсов. Кроме того, молекулы, по-видимому, принимают предпочтительную ориентацию вдоль транссинаптической оси (Fouquet et al., 2009).; Киттель и др., 2006). Используя сходный подход, было показано, что AMPA-рецепторы имеют кольцеобразное распределение в ленточных синапсах внутренних волосковых клеток (Meyer et al., 2009). Исследования synaptotagmin, компонента компонента синаптических пузырьков, показывают, что эти белки остаются сгруппированными после экзоцитоза (Willig et al. , 2006).

STORM/(F)PALM также использовался для исследования молекулярной архитектуры синапсов. Систематическое изучение десяти пре- и постсинаптических белков в центральных синапсах ткани мозга мыши выявило ориентированную организацию пресинаптических каркасных белков фагота и пикколо; компартментальное распределение постсинаптических белков PSD95, хвостовик и Гомер; и гетерогенное распределение нейротрансмиттеров, при этом некоторые синапсы демонстрируют центрально-синаптическое, а другие — перисинаптическое распределение рецепторов (Dani et al., 2010). STORM/(F)PALM способен подсчитывать молекулы, и это свойство позволяет проводить количественный анализ состава рецепторов нейротрансмиттеров в синапсах (Dani et al., 2010). Одно недавнее исследование адаптировало отслеживание одиночных частиц высокой плотности с помощью фотоактивации для изучения динамики актина в дендритных шипах и обнаружило различные локусы усиленной полимеризации актина (Frost et al., 2010).

В дополнение к освещению субклеточных структур внутри нейронов флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения также использовалась для изучения морфологии нейронов. Прекрасные изображения STED выявили форму и динамику дендритных шипов в живых клетках (Nägerl et al., 2008). Двухфотонная STED позволила визуализировать морфологию позвоночника в образцах глубоких тканей (Ding et al., 2009). В настоящее время также ведется работа по применению изображений сверхвысокого разрешения для картирования связей нейронов.

Однако для определения полной схемы нейронных соединений может потребоваться еще более высокое разрешение, чем то, что в настоящее время возможно с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения. Хотя в настоящее время с помощью различных методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения обычно можно получить разрешение в несколько десятков нанометров, для отслеживания тонких и плотно упакованных аксонов в головном мозге, вероятно, потребуется разрешение в несколько нанометров. Изучение субнейрональных структур, таких как синапсы, также может выиграть от значительно более высокого разрешения, чем на современном уровне техники. Разрешение в несколько десятков нанометров позволяет определить организацию молекулярных ансамблей и органелл, тогда как разрешение в несколько нанометров (т. е. истинный молекулярный масштаб) позволит напрямую визуализировать взаимодействия между молекулами.

Не так давно дифракционный предел считался непреодолимым. В последние годы изобретение различных методов сверхвысокого разрешения разрушило дифракционный барьер и позволило улучшить разрешение изображений световой микроскопии на порядок по сравнению с дифракционным пределом. Фактически, все эти подходы к сверхразрешению в принципе сделали пространственное разрешение неограниченным. Тем не менее, мы считаем, что практически возможен дополнительный порядок повышения разрешения.

Стоит отметить, что помимо собственного оптического разрешения, которое часто зависит от яркости и фотостабильности флуоресцентных зондов, эффективное разрешение изображения также ограничено плотностью мечения и размером флуоресцентных меток. Таким образом, в дополнение к усовершенствованию конструкции микроскопов, разработки в области флуоресцентных зондов и химии мечения также имеют решающее значение для дальнейшего улучшения разрешения световой микроскопии. Действительно, недавние достижения в области флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения уже привели к активным исследованиям в этих областях. Мы предвидим, что вместе эти усилия позволят визуализировать живые клетки с действительно разрешением на молекулярном уровне, тем самым обеспечивая прямую визуализацию молекулярных взаимодействий и биохимических событий в живых клетках.

01

Нажмите здесь для просмотра. ^{(37K, pdf)}

Эта работа частично поддерживается стипендией Searle Scholarship, Packard Fellowship и Программой прорывных биомедицинских исследований UCSF (для B.H.) и Медицинским институтом Говарда Хьюза (награда за совместные инновации), Национальными институтами Здоровье и Благотворительный фонд Гэтсби (X.Z.). Х.З. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза.

Отказ от ответственности издателя: Это PDF-файл неотредактированной рукописи, которая была принята к публикации. В качестве услуги нашим клиентам мы предоставляем эту раннюю версию рукописи. Рукопись будет подвергнута редактированию, набору текста и рецензированию полученного доказательства, прежде чем она будет опубликована в ее окончательной цитируемой форме. Обратите внимание, что в процессе производства могут быть обнаружены ошибки, которые могут повлиять на содержание, и все правовые оговорки, применимые к журналу, относятся к нему.

Дополнительная информация Дополнительная информация включает расширенное обсуждение и одну таблицу. Ее можно найти вместе с этой статьей в Интернете по адресу *bxs.

• Аббат Э. Beitrage zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Арка Микроскоп Анат. 1873; 9: 413–420. [Google Scholar]
• Бейтс М., Хуанг Б. , Демпси Г.Т., Чжуан Х. Многоцветная визуализация сверхвысокого разрешения с фотопереключаемыми флуоресцентными зондами. Наука. 2007; 317:1749–1753. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Бетциг Э., Льюис А., Харотунян А., Исааксон М., Крачмер Э. Сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля (NSOM) — Разработка и биофизические приложения. Биофиз. Дж. 1986; 49: 269–279. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, Lindwasser OW, Olenych S, Bonifacino JS, Davidson MW, Lippincott-Schwartz J, Hess HF. Визуализация внутриклеточных флуоресцентных белков с нанометровым разрешением. Наука. 2006; 313:1642–1645. [PubMed] [Академия Google]
• Битин Дж.С., Томпсон М.А., Целентис Н.К., Боуман Г.Р., Шапиро Л., Мёрнер В.Е. Визуализация сверхвысокого разрешения в живых клетках Caulobacter crescentus с использованием фотопереключаемого EYFP. Нац. Методы. 2008; 5: 947–949. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bretschneider S, Eggeling C, Hell SW. Преодоление дифракционного барьера в флуоресцентной микроскопии с помощью оптического стеллажа. физ. Преподобный Летт. 2007;98:218103. [PubMed] [Google Scholar]
• Черчмен Л.С., Октен З., Рок Р.С., Доусон Дж.Ф., Спудич Дж.А. Колокализация отдельных молекул Cy3 и Cy5 с высоким разрешением, прикрепленных к макромолекулам, измеряет внутримолекулярные расстояния во времени. проц. Натл. акад. науч. США. 2005;102:1419–1423. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dani A, Huang B, Bergan J, Dulac C, Zhuang X. Изображение химических синапсов в головном мозге со сверхвысоким разрешением. Нейрон. 2010; 68: 843–856. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Dertinger T, Colyer R, Iyer G, Weiss S, Enderlein J. Быстрое, без фона, трехмерное изображение оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI) Proc. Натл. акад. науч. США. 2009;106:22287–22292. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ding JB, Takasaki KT, Sabatini BL. Визуализация сверхразрешения в срезах головного мозга с использованием двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии со стимулированным излучением. Нейрон. 2009 г.;63:429–437. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Donnert G, Keller J, Wurm CA, Rizzoli SO, Westphal V, Schönle A, Jahn R, Jakobs S, Eggeling C, Hell SW. Двухцветная флуоресцентная наноскопия в дальней зоне. Биофиз. Дж. 2007; 92: L67–L69. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Эггелинг С., Рингеманн С., Медда Р., Шварцманн Г., Сандхофф К., Полякова С., Белов В.Н., Хайн Б., фон Миддендорф С., Шенле А., Хелл С.В. Прямое наблюдение за наномасштабной динамикой мембранных липидов в живой клетке. Природа. 2009 г.;457:1159–1162. [PubMed] [Google Scholar]
• Egner A, Geisler C, von Middendorff C, Bock H, Wenzel D, Medda R, Andresen M, Stiel AC, Jakobs S, Eggeling C, et al. Флуоресцентная наноскопия в целых клетках путем асинхронной локализации фотопереключающихся излучателей. Биофиз. Дж. 2007; 93:3285–3290. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Fernández-Suárez M, Ting AY. Флуоресцентные зонды для визуализации живых клеток со сверхвысоким разрешением. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 2008; 9: 929–943. [PubMed] [Академия Google]
• Фёллинг Дж., Белов В., Ридель Д., Шёнле А., Эгнер А., Эггелинг С., Босси М., Хелл С.В. Флуоресцентная наноскопия с оптическим разделением путем двухфотонного молекулярного переключения с использованием лазеров непрерывного действия. ХимФизХим. 2008; 9: 321–326. [PubMed] [Google Scholar]
• Фуке В., Овальд Д., Вихманн С., Мертель С., Депнер Х., Дайба М., Халлерманн С., Киттель Р.Дж., Эймер С., Зигрист С.Дж. Созревание сборки активной зоны у Drosophila Bruchpilot. Дж. Клеточная биология. 2009; 186: 129–145. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Фрост Н.А., Шрофф Х., Конг Х., Бетциг Э., Бланпиед Т.А. Одномолекулярная дискриминация дискретных перисинаптических и распределенных участков сборки актиновых филаментов внутри дендритных шипиков. Нейрон. 2010;67:86–99. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гипманс Б.Н., Адамс С.Р., Эллисман М.Х., Цзянь Р. Ю. Набор флуоресцентных инструментов для оценки местоположения и функции белка. Наука. 2006; 312: 217–224. [PubMed] [Google Scholar]
• Gordon MP, Ha T, Selvin PR. Визуализация одиночных молекул с высоким разрешением и фотообесцвечиванием. проц. Натл. акад. науч. США. 2004; 101:6462–6465. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Greenfield D, McEvoy AL, Shroff H, Crooks GE, Wingreen NS, Betzig E, Liphardt J. Самоорганизация сети хемотаксиса Escherichia coli, полученная с помощью световой микроскопии сверхвысокого разрешения. PLoS биол. 2009;7:e1000137. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Gustafsson MGL. Превышение предела бокового разрешения в два раза с помощью микроскопии со структурированным освещением. Дж. Микроск. 2000; 198:82–87. [PubMed] [Google Scholar]
• Gustafsson MGL. Нелинейная микроскопия со структурированным освещением: широкопольная флуоресцентная визуализация с теоретически неограниченным разрешением. проц. Натл. акад. науч. США. 2005; 102:13081–13086. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Густафссон М.Г.Л., Агард Д.А., Седат Дж.В. Семикратное улучшение осевого разрешения в 3D широкопольной микроскопии с использованием двух объективов. проц. ШПАЙ. 1995; 2412: 147–156. [Google Scholar]
• Gustafsson MGL, Shao L, Carlton PM, Wang CJR, Голубовская IN, Cande WZ, Agard DA, Sedat JW. Удвоение трехмерного разрешения в широкопольной флуоресцентной микроскопии за счет структурированного освещения. Биофиз. Дж. 2008; 94:4957–4970. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Harke B, Ullal CK, Keller J, Hell SW. Трехмерная наноскопия коллоидных кристаллов. Нано Летт. 2008;8:1309–1313. [PubMed] [Google Scholar]
• Heintzmann R, Cremer C. Микроскопия с латеральным модулированным возбуждением: улучшение разрешения с помощью дифракционной решетки. проц. ШПАЙ. 1999; 3568: 185–196. [Google Scholar]
• Heintzmann R, Gustafsson MGL. Субдифракционное разрешение в сплошных образцах. Нац. Фотоника. 2009;3:362–364. [Google Scholar]
• Heintzmann R, Jovin TM, Cremer C. Микроскопия возбуждения с насыщенным рисунком — концепция улучшения оптического разрешения. Дж. опт. соц. Являюсь. Опт. Наука об изображении. Вис. 2002;19: 1599–1609. [PubMed] [Google Scholar]
• Hell SW. К флуоресцентной наноскопии. Нац. Биотехнолог. 2003; 21:1347–1355. [PubMed] [Google Scholar]
• Hell SW. Оптическая наноскопия дальнего поля. Наука. 2007; 316:1153–1158. [PubMed] [Google Scholar]
• Hell SW, Stelzer EHK. Фундаментальное улучшение разрешения 4Pi-конфокального флуоресцентного микроскопа с использованием 2-фотонного возбуждения. Опц. коммун. 1992; 93: 277–282. [Google Scholar]
• Hell SW, Wichmann J. Нарушение предела дифракционного разрешения с помощью стимулированного излучения: флуоресцентная микроскопия с истощением стимулированного излучения. Опц. лат. 1994;19:780–782. [PubMed] [Google Scholar]
• Hess ST, Girirajan TPK, Mason MD. Визуализация сверхвысокого разрешения с помощью флуоресцентной микроскопии локализации фотоактивации. Биофиз. Дж. 2006; 91:4258–4272. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гесс С.Т., Гулд Т.Дж., Гудхети М.В., Маас С.А., Миллс К.Д., Циммерберг Дж. Динамическое кластерное распределение гемагглютинина с разрешением 40 нм в мембранах живых клеток позволяет различать теории рафтов. проц. Натл. акад. науч. США. 2007; 104:17370–17375. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хофманн М., Эггелинг С., Якобс С., Хелл С.В. Преодоление дифракционного барьера в флуоресцентной микроскопии при низкой интенсивности света с помощью обратимо фотопереключаемых белков. проц. Натл. акад. науч. США. 2005; 102:17565–17569. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Huang B, Wang WQ, Bates M, Zhuang XW. Трехмерное изображение сверхвысокого разрешения с помощью стохастической микроскопии оптической реконструкции. Наука. 2008; 319: 810–813. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Хуан Б., Бейтс М., Чжуан X. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения. Анну. Преподобный Биохим. 2009; 78: 993–1016. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Juette MF, Gould TJ, Lessard MD, Mlodzianoski MJ, Nagpure BS, Bennett BT, Hess ST, Bewersdorf J. Трехмерная флуоресцентная микроскопия толстой кишки с разрешением менее 100 нм образцы. Нац. Методы. 2008; 5: 527–529. [PubMed] [Google Scholar]
• Kanchanawong P, Shtengel G, Pasapera AM, Ramko EB, Davidson MW, Hess HF, Waterman CM. наносклеральная архитектура клеточных адгезий на основе интегрина. Природа. 2010; 468: 580–584. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kellner RR, Baier CJ, Willig KI, Hell SW, Barrantes FJ. Наноразмерная организация никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, выявленная с помощью микроскопии истощения стимулированной эмиссии. Неврология. 2007; 144:135–143. [PubMed] [Google Scholar]
• Kittel RJ, Wichmann C, Rasse TM, Fouquet W, Schmidt M, Schmid A, Wagh DA, Pawlu C, Kellner RR, Willig KI, et al. Bruchpilot способствует сборке активной зоны, кластеризации каналов Ca2+ и высвобождению везикул. Наука. 2006; 312:1051–1054. [PubMed] [Академия Google]
• Клар Т.А., Хелл Ю.В. Субдифракционное разрешение в дальнепольной флуоресцентной микроскопии. Опц. лат. 1999; 24:954–956. [PubMed] [Google Scholar]
• Кнер П., Чхун Б.Б., Гриффис Э.Р., Виното Л., Густафссон М.Г. Видеомикроскопия живых клеток со сверхвысоким разрешением при структурированном освещении. Нац. Методы. 2009; 6: 339–342. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lacoste TD, Michalet X, Pinaud F, Chemla DS, Alivisatos AP, Weiss S. Многоцветная колокализация одиночных флуоресцентных зондов со сверхвысоким разрешением. проц. Натл. акад. науч. США. 2000;97:9461–9466. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lagerholm BC, Averett L, Weinreb GE, Jacobson K, Thompson NL. Метод анализа для измерения субмикроскопических расстояний с помощью мерцающих квантовых точек. Биофиз. Дж. 2006; 91:3050–3060. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lee HL, Lord SJ, Iwanaga S, Zhan K, Xie H, Williams JC, Wang H, Bowman GR, Goley ED, Shapiro L, et al. Визуализация целевых белков в фиксированных и живых клетках со сверхвысоким разрешением с использованием фотоактивируемых органических флуорофоров. Варенье. хим. соц. 2010;132:15099–15101. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Льюис А., Исааксон М., Харутунян А., Мюрей А. Разработка светового микроскопа с пространственным разрешением 500 Å. Ультрамикроскопия. 1984; 13: 227–231. [Google Scholar]
• Лидке К.А., Ригер Б., Джовин Т.М., Хайнцманн Р. Сверхразрешение путем локализации квантовых точек с использованием статистики мерцания. Опц. Выражать. 2005; 13:7052–7062. [PubMed] [Google Scholar]
• Lord SJ, Lee HL, Moerner WE. Спектроскопия одиночных молекул и визуализация биомолекул в живых клетках. Анальный. хим. 2010;82:2192–2203. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, Betzig E, Lippincott-Schwartz J. Картирование траекторий одиночных молекул с высокой плотностью с фотоактивируемой локализационной микроскопией . Нац. Методы. 2008; 5: 155–157. [PubMed] [Google Scholar]
• Мацуда А., Шао Л., Буланже Дж., Кервранн С., Карлтон П.М., Кнер П., Агард Д., Седат Дж.В. Конденсированная митотическая структура хромосом с нанометровым разрешением с использованием гистонов PALM и EGFP. ПЛОС ОДИН. 2010;5:e12768. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Мейер А.С., Франк Т., Химич Д., Хох Г., Ридель Д., Чапочников Н.М., Ярин Ю.М., Харке Б., Хелл С.В., Эгнер А., Мозер Т. Настройка количества, структуры и функции синапсов в улитке. Нац. Неврологи. 2009; 12:444–453. [PubMed] [Google Scholar]
• Moerner WE. Новые направления в визуализации и анализе одиночных молекул. проц. Натл. акад. науч. США. 2007; 104:12596–12602. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Moneron G, Hell SW. STED-микроскопия с двухфотонным возбуждением. Опц. Выражать. 2009 г.;17:14567–14573. [PubMed] [Google Scholar]
• Moneron G, Medda R, Hein B, Giske A, Westphal V, Hell SW. Быстрая STED-микроскопия с волоконными лазерами непрерывного действия. Опц. Выражать. 2010;18:1302–1309. [PubMed] [Google Scholar]
• Нэгерл У.В., Виллиг К.И., Хайн Б., Хелл С.В., Бонхёффер Т. Визуализация дендритных шипов живыми клетками с помощью STED-микроскопии. проц. Натл. акад. науч. США. 2008; 105:18982–18987. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Neumann D, Bückers J, Kastrup L, Hell SW, Jakobs S. Двухцветная STED-микроскопия показывает различную степень совместной локализации между гексокиназой-I и тремя изоформами VDAC человека. ПМЦ Биофиз. 2010;3:4. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Новотный Л., Хехт Б. Основы нанооптики. Издательство Кембриджского университета; Cambridge: 2006. [Google Scholar]
• Паттерсон Г., Дэвидсон М., Мэнли С., Липпинкотт-Шварц Дж. Визуализация сверхвысокого разрешения с использованием локализации одной молекулы. Анну. Преподобный физ. хим. 2010;61:345–367. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Павани С.Р., Томпсон М.А., Битин Дж.С., Лорд С. Дж., Лю Н., Твиг Р.Дж., Пистун Р., Мёрнер В.Е. Трехмерное изображение флуоресценции одной молекулы за пределами дифракционного предела с использованием функции рассеяния точки двойной спирали. проц. Натл. акад. науч. США. 2009 г.;106:2995–2999. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Перцинидис А., Чжан Ю., Чу С. Субнанометровая локализация одиночной молекулы, регистрация и измерение расстояния. Природа. 2010; 466: 647–651. [PubMed] [Google Scholar]
• Pohl DW, Denk W, Lanz M. Оптическая стетоскопия — запись изображения с разрешением lembda/20. заявл. физ. лат. 1984; 44: 651–653. [Google Scholar]
• Ptacin JL, Lee SF, Garner EC, Toro E, Eckart M, Comolli LR, Moerner WE, Shapiro L. Веретенообразный аппарат направляет сегрегацию бактериальных хромосом. Нац. Клеточная биол. 2010;12:791–798. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Qu XH, Wu D, Mets L, Scherer NF. Нанометровая множественная флуоресцентная микроскопия одиночных молекул. проц. Натл. акад. науч. США. 2004; 101:11298–11303. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Rittweger E, Han KY, Irvine SE, Eggeling C, Hell SW. STED-микроскопия выявляет центры окраски кристаллов с нанометровым разрешением. Нац. Фотон. 2009;3:144–147. [Google Scholar]
• Rust MJ, Bates M, Zhuang XW. Визуализация субдифракционного предела с помощью стохастической микроскопии оптической реконструкции (STORM) Nat. Методы. 2006;3:793–795. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Шермеллех Л., Карлтон П.М., Хаазе С., Шао Л., Виното Л., Кнер П., Берк Б., Кардосо М.С., Агард Д.А., Густафссон М.Г.Л. и др. Субдифракционная многоцветная визуализация ядерной периферии с помощью трехмерной структурированной световой микроскопии. Наука. 2008; 320:1332–1336. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW. Сферическое наноразмерное фокусное пятно распутывает внутреннюю часть клеток. Нац. Методы. 2008;5:539–544. [PubMed] [Google Scholar]
• Schmidt R, Wurm CA, Pange A, Egner A, Jakobs S, Hell SW. Митохондриальные кристы выявлены при сфокусированном свете. Нано Летт. 2009; 9: 2508–2510. [PubMed] [Google Scholar]
• Шаронов А., Хохштрассер Р.М. Широкопольная субдифракционная визуализация за счет накопленного связывания диффундирующих зондов. проц. Натл. акад. науч. США. 2006; 103:18911–18916. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shroff H, Galbraith CG, Galbraith JA, Betzig E. Микроскопия фотоактивированной локализации живых клеток динамики наноразмерной адгезии. Нац. Методы. 2008; 5: 417–423. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Shtengel G, Galbraith JA, Galbraith CG, Lippincott-Schwartz J, Gillette JM, Manley S, Sougrat R, Waterman CM, Kanchanawong P, Davidson MW, et al. Интерферометрическая флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения разрешает трехмерную клеточную ультраструктуру. проц. Натл. акад. науч. США. 2009;106:3125–3130. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sieber JJ, Willig KI, Kutzner C, Gerding-Reimers C, Harke B, Donnert G, Rammner B, Eggeling C, Hell SW, Grubmüller H, Lang T. Анатомия динамика надмолекулярного мембранного белкового кластера. Наука. 2007; 317:1072–1076. [PubMed] [Академия Google]
• Субах Ф.В., Паттерсон Г.Х., Мэнли С., Джиллетт Дж.М., Липпинкотт-Шварц Дж., Верхуша В.В. Фотоактивируемый mCherry для двухцветной флуоресцентной микроскопии высокого разрешения. Нац. Методы. 2009; 6: 153–159. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Субах Ф.В., Паттерсон Г.Х., Ренц М., Липпинкотт-Шварц Дж., Верхуша В.В. Яркий мономерный фотоактивируемый красный флуоресцентный белок для двухцветного sptPALM сверхвысокого разрешения живых клеток. Варенье. хим. соц. 2010; 132:6481–6491. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sun Y, McKenna JD, Murray JM, Остап EM, Goldman YE. Параллакс: высокоточное трехмерное отслеживание отдельных молекул с использованием разделенных изображений. Нано Летт. 2009; 9: 2676–2682. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Synge EH. Предлагаемый метод расширения микроскопического разрешения в ультрамикроскопическую область. Филос. Маг. 1928; 6: 356–362. [Google Scholar]
• Тан Дж., Акербум Дж., Вазири А., Лугер Л.Л., Шэнк К.В. Почти изотропная трехмерная оптическая наноскопия с фотоно-ограниченными хромофорами. проц. Натл. акад. науч. США. 2010;107:10068–10073. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Testa I, Wurm CA, Medda R, Rothermel E, von Middendorf C, Fölling J, Jakobs S, Schönle A, Hell SW, Eggeling C. Многоцветная флуоресцентная наноскопия в фиксированных и живых клетках путем возбуждения обычных флуорофоров с одной длиной волны. Биофиз. Дж. 2010; 99: 2686–2694. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Thompson RE, Larson DR, Webb WW. Точный нанометровый анализ локализации отдельных флуоресцентных зондов. Биофиз. Дж. 2002; 82: 2775–2783. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• ван Ойен А. М., Колер Дж., Шмидт Дж., Мюллер М., Бракенхофф Г.Дж. Трехмерное сверхвысокое разрешение за счет спектрально-селективной визуализации. хим. физ. лат. 1998; 292:183–187. [Google Scholar]
• Вазири А., Танг Дж., Шрофф Х., Шэнк К.В. Многослойная трехмерная визуализация сверхвысокого разрешения толстых биологических образцов. проц. Натл. акад. науч. США. 2008;105:20221–20226. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Westphal V, Lauterbach MA, Di Nicola A, Hell SW. Динамическая флуоресцентная наноскопия в дальней зоне. Нью-Джерси Phys. 2007;9:10. [Google Scholar]
• Уайт Дж. Г., Саутгейт Э., Томсон Дж. Н., Бреннер С. Структура брюшного нервного шнура Caenorhabditis elegans. Филос. Транс. Р. Соц. Лонд. Б. биол. науч. 1986; 275: 327–348. [PubMed] [Google Scholar]
• Willig KI, Rizzoli SO, Westphal V, Jahn R, Hell SW. STED-микроскопия показывает, что синаптотагмин остается сгруппированным после экзоцитоза синаптических пузырьков. Природа. 2006; 440:935–939. [PubMed] [Google Scholar]
• Willig KI, Harke B, Medda R, Hell SW. STED-микроскопия с пучками непрерывных волн. Нац. Методы. 2007;4:915–918. [PubMed] [Google Scholar]
• Wombacher R, Heidbreder M, van de Linde S, Sheetz MP, Heilemann M, Cornish VW, Sauer M. Визуализация живых клеток со сверхвысоким разрешением с использованием конъюгатов триметоприма. Нац. Методы. 2010;7:717–719. [PubMed] [Google Scholar]
• Wu M, Huang B, Graham M, Raimondi A, Heuser JE, Zhuang X, De Camilli P. Связь между клатрин-зависимым эндоцитарным почкованием и F-BAR-зависимым тубулированием в бесклеточном система. Нац. Клеточная биол. 2010; 12:902–908. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Xie XS, Choi PJ, Li GW, Lee NK, Lia G. Одномолекулярный подход к молекулярной биологии в живых бактериальных клетках. Анну. Преподобный Биофиз. 2008; 37: 417–444. [PubMed] [Google Scholar]
• Yildiz A, Forkey JN, McKinney SA, Ha T, Goldman YE, Selvin PR. Миозин V ходит рука об руку: изображение одного флуорофора с локализацией 1,5 нм. Наука. 2003; 300:2061–2065. [PubMed] [Google Scholar]
• Zipfel WR, Williams RM, Webb WW. Нелинейная магия: многофотонная микроскопия в биологических науках. Нац. Биотехнолог. 2003;21:1369–1377. [PubMed] [Академия Google]

M4) Как дифракция ограничивает оптическое разрешение микроскопа

Предыдущая статья Вернуться к темам Следующая статья




Доктор Курт Торн (UCSF) начинает это видео iBiology с исторического резюме работы Эрнста Аббе (1840-1905), который формализовал определение разрешения в 1873 году после проведения новаторского эксперимента, известного как Abbe Дифракционный эксперимент. Доктор Торн описывает эксперимент, в котором образец, теоретически представленный как дифракционная решетка с повторяющимся узором из темных и светлых линий, расположенных близко друг к другу. Начиная примерно с 7:00, доктор Торн проводит must-see эксперимент, в котором микроскоп собирается из оптических компонентов и раскладывается на световом столе. Он использует светоделитель и две камеры, чтобы показать (поочередно) изображение, сформированное трубчатой ​​линзой, и изображение в задней фокальной плоскости — плоскости Фурье — объектива. Проводя эксперимент с различными образцами, а затем показывая эффект простой фильтрации на плоскости Фурье, он конкретизирует вышеупомянутые абстрактные концепции в сознании зрителя.

Применяя закон Брэгга, получаем, что угол дифракции определяется уравнением dSin(β) = λ, где d — шаг дифракционной решетки, β — угол дифракции, λ — длина волны света. Для более тонкой дифракционной картины угол дифракции увеличивается, и если угол больше α, максимального угла, который может быть собран объективом, то информация о полосах не будет получена. Все, что мы увидим, это свет 0-го порядка, прошедший через образец. Это означает, что если β > α, то изображение не формируется.

---

Предельный случай можно получить, установив угол дифракции равным наибольшему углу, который может быть собран объективом. Отсюда Аббе смог вывести предел разрешения микроскопа, определяемый уравнением dSin(α) = λ. Показатель преломления «n» применяется для учета различных сред, а предел разрешения улучшается дополнительно в 2 раза, поскольку мы не ограничены осевым освещением, но имеется полный диапазон углов для освещения образца. .

Другое понимание заключается в том, что дифракция в образце говорит нам кое-что о размере объектов в поле зрения, а интерференция между дифрагированными лучами создает изображение образца. Доктор Торн передает это понимание в виде знаменитой цитаты Аббе: « Изображение, полученное под микроскопом, представляет собой интерференционный эффект явления дифракции ».

---

В этом видеоролике iBiology профессор Джефф Лихтман (Гарвардский университет) описывает явление дифракции, чрезвычайно важное понятие, поскольку именно дифракция ограничивает оптическое разрешение световых микроскопов.

---

Опираясь на концепцию дифракции, которая была описана в предыдущем видеоролике iBiology, профессор Джефф Лихтман (Гарвардский университет) объясняет, что для точечного объекта в фокальной плоскости (например, бесконечно малого флуоресцентного шарика) функция рассеяния точки ( PSF) — это результирующее распределение света в плоскости изображения и вблизи нее. Далее он объясняет влияние ранее описанной концепции числовой апертуры на PSF и то, как это связано с оптическим разрешением.

---

В этой лекции по iBiology профессор Лихтман использует ранее объясненные концепции дифракции, числовой апертуры и PSF и достигает конечного результата: оптического разрешения. Насколько близко могут быть две точки в плоскости образца и при этом они могут быть разрешены как отдельные точки на изображении. Мы узнаем о критерии Рэлея и о том, что он различен для плоскостей XY и XZ микроскопа. Наш главный вывод заключается в том, что чем выше числовая апертура, тем меньше критерий Рэлея и тем лучше разрешение. Затем профессор Лихтман показывает последовательность изображений, снятых камерами с разным шагом пикселей, что дает наглядное представление о том, почему выборки в плоскости изображения должно быть достаточно для разрешения изображения. Это можно определить количественно, применив критерий Найквиста к пространственной выборке в плоскости изображения, что приводит к верхнему пределу размера пикселя датчика изображения, который используется вместе с микроскопом.

---

In the following table, “R” represents the Rayleigh Criterion for the diffraction-limited spot size: R = 1.22λ/(2NA)

Objective	R @550nm	On imager plane	Max pixel size (Nyquist limit)
40X/0.75NA	0.45µm	0.45 x 40 = 18µm	9µm
4X/0.13NA	2.58µm	2,58 x 4 = 10,32 мкм	5,16 мкм

Использование числовой апертуры объектива микроскопа для оценки максимального размера пикселя, ограниченного Найквистом

Приведенный выше метод можно использовать для оценки характеристик камеры и системы микроскопа. , если известны соответствующие параметры камеры и объектива микроскопа. В таблице ниже мы показываем предельное разрешение (в мкм) и поле зрения для нескольких коммерчески доступных объективов микроскопа при использовании с камерой 2048 x 2048 с пикселями 6,5 мкм: это включает неохлаждаемые камеры sCMOS, такие как pco. panda 4.2 , pco.panda 4.2bi и pco.panda 4.2bi uv . Эта таблица также относится к охлаждаемым камерам sCMOS, таким как камеры pco.edge 4.2 , pco.edge 4.2bi и pco.edge 4.2bi uv .

Параметры камеры
оптический Формат	#мегапикселей	#H пикселей	#V пикселей	Размер пикселя (мкм)	Размер H (мм)	Размер V (мм)	Диагональ (мм)
18,8 мм	4. 2	2048	2048	6,5	13.31	13.31	18,83
Коммерчески доступные объективы
Цель: Mag/NA	1X\0. 03NA	2X\0.1NA	4X\0,13 NA	10X\0,26NA	20X\0.5NA	40X\0.75NA	60X\0,85NA	100X\1. 4NA
Мин. размер объекта (мкм)	11.18	3,36	2,58	1,29	0,67	0,45	0,39	0,24
Максимальный размер пикселя (ум)	5,59	3,36	5. 16	6.45	6.70	9.00	11.70	12.00
FN (мм)	22	22	22	22	22	22	22	22
ВД (мм)	8	56,3	17,2	16	2. 1	16	0,66	0,31-0,4
нет данных	0,03	0,1	0,13	0,26	0,5	0,75	0,85	1,4
Увеличение	1	2	4	10	20	40	60	100
Расчетная производительность комбинации камеры и объектива
(*) Ограничение Разрешение (мкм)	13	6,5	3,25	1. 3	0,67	0,45	0,39	0,24
Виньетирование?	№	№	№	№	№	№	№	№
FOV (Г x В) мм	13,31 х 13,31	6,66 х 6,66	3,33 х 3,33	1,33 х 1,33	0,67 х 0,67	0,33 х 0,33	0,22 х 0,22	0,13 х 0,13
FOV (диагональ) мм	18,83	9. 42	4,71	1,88	0,94	0,47	0,31	0,19
Пожалуйста, свяжитесь с нашими экспертами по визуализации для получения помощи в выборе комбинации камеры и объектива, которая соответствует вашим требованиям к FOV и разрешению на длинах волн для конкретного приложения.
1) минимальный размер элемента оценивается с использованием критериев Рэлея при λ = 550 нм; его можно пересчитать для других длин волн. R = 1,22*λ/(2NA)
2) Максимальный размер пикселя оценивается путем применения критериев Найквиста к минимальному размеру объекта, поскольку он появляется на плоскости имидж-сканера. Максимальный размер пикселя = R*увеличение/2·
3) Комбинации камеры и объектива, которые соответствуют критериям Найквиста и, следовательно, имеют ограничения по дифракции, обозначаются предельным разрешением, выделенным зеленым шрифтом. (*)
4) Значения рабочего расстояния (WD) и номер поля (FN) показаны только для справки. Фактические значения могут отличаться.
5) Виньетирование, затемнение изображения по углам, может наблюдаться, если Диагональ тепловизора больше, чем номер поля объектива.

---

Доктор Дженнифер Уотерс (директор Центра обработки изображений Nikon Гарвардской медицинской школы) дает дополнительную информацию по теме числовой апертуры (ЧА). Числовая апертура имеет решающее значение, поскольку она ограничивает как разрешение, так и яркость изображения, получаемого с микроскопа. Она начинает с критериев Рэлея, показывая, как числовая апертура влияет на разрешение, а затем показывает физические свойства, влияющие на числовую апертуру. Это приводит к информативному обсуждению преимуществ более высокой числовой апертуры.

---

Функция рассеяния точки (PSF) микроскопа является основой для многих практических и теоретических концепций световой микроскопии, как базовых, так и продвинутых. В видео д-р Дженнифер Уотерс определяет ФРТ микроскопа, а затем показывает, как оно связано с разрешающей способностью микроскопа. Далее она поясняет, что ФРТ является результатом дифракции и интерференции: эта концепция конкретизируется в видео с помощью анимации и примеров. Это видео также очень полезно для интеграции в сознании зрителя концепции PSF с известным критерием Рэлея. Доктор Уотерс также помогает зрителям связать PSF с реальным миром: например, (цитируя Vogel et al, Science, 2006) можно уместить ~ 3 миллиона молекул GFP в максимумы PSF типичного объектива с высокой числовой апертурой!

Она сравнивает процесс свертки каждого точечного источника в выборке с ФРТ как «нанесение ФРТ на каждый точечный источник в выборке». Аналогия, которую она использует, состоит в том, что PSF похож на кисть определенного размера, используемую для создания оптического изображения из всех точечных источников изображения. По этой причине объекты на изображении образца с ограничением дифракции никогда не будут казаться меньше ФРТ. Это ясно видно как на анимированных изображениях, так и на реальных примерах изображений флуоресцентной микроскопии.

Теоретические пределы разрешения (в нм) объектива 1,4 NA. Показаны значения бокового и осевого разрешения.

---

В этом видео iBiology д-р Бо Хуанг (UCSF) объясняет концепцию преобразования Фурье и связывает ее с работой объектива микроскопа. Он показывает, как задняя фокальная плоскость объектива обеспечивает преобразование Фурье, и использует эту информацию для получения уравнения для дифракционного предела.

---

Предыдущая статья Вернуться к темам Следующая статья

Лучи с ограничением дифракции, объяснение в RP Photonics Encyclopedia; качество луча, Гауссовы лучи

«> Главная	Викторина	Руководство покупателя
Поиск	Категории	Глоссарий	Реклама

Прожектор фотоники

«> Учебники

Показать статьи A-Z

Примечание: поле поиска по ключевому слову статьи и некоторые другие функции сайта требуют Javascript, который, однако, отключен в вашем браузере.

Обратитесь в RP Photonics за советом о том, как измерить качество луча вашего лазерного источника или как его оптимизировать, т.е. благодаря усовершенствованной конструкции резонатора.

Лазерный пучок называется дифракционно-ограниченным , если его способность фокусироваться в маленькие пятна максимально высока для данной длины волны, ограниченной только неизбежной дифракцией. Другими словами, его качество луча идеально.

Точнее, идеальное качество луча означает, что перетяжка луча с заданным радиусом луча, генерируемая из луча путем фокусировки, например. с криволинейным зеркалом, связан с минимально возможным углом расходимости луча. Что именно это означает, зависит от определения радиуса луча и расходимости луча. Если для определения обеих величин используются вторые моменты, минимальное произведение параметров луча достигается для гауссова луча, который имеет не только гауссовский профиль интенсивности, но и плоские волновые фронты в перетяжке луча (фокусе луча).

Лазер, работающий на одной поперечной моде резонатора, обычно имеет выходной сигнал, ограниченный дифракцией, поскольку эта единственная мода обычно является основной модой резонатора, и ее форма обычно близка к гауссовой. Неидеальное качество луча может быть вызвано внутрирезонаторными искажениями луча, т.е. в усиливающей среде, что может либо деформировать основную моду, либо (чаще) вызывать поперечную многомодовую работу. Отметим, что качество пучка лазера зависит не только от силы внутрирезонаторных искажений, но и от некоторых деталей конструкции резонатора; оптимизация последнего может иметь важное значение для достижения выхода, ограниченного дифракцией.

При заданной оптической силе дифракционно-ограниченный пучок имеет наибольшую яркость.

Вопросы и комментарии от пользователей

Здесь вы можете задать вопросы и комментарии. Если они будут приняты автором, они появятся над этим абзацем вместе с ответом автора. Автор принимает решение о принятии на основе определенных критериев. По существу, вопрос должен представлять достаточно широкий интерес.

Пожалуйста, не вводите здесь личные данные; в противном случае мы бы удалили его в ближайшее время. (См. также нашу декларацию о конфиденциальности.) Если вы хотите получить личную обратную связь или консультацию от автора, свяжитесь с ним, например. по электронной почте.

Ваш вопрос или комментарий:

Проверка на спам:

  (Пожалуйста, введите сумму тринадцати и трех в виде цифр!)

Отправляя информацию, вы даете свое согласие на возможную публикацию ваших материалов на нашем веб-сайте в соответствии с нашими правилами. (Если вы позже отзовете свое согласие, мы удалим эти материалы. ) Поскольку ваши материалы сначала просматриваются автором, они могут быть опубликованы с некоторой задержкой.

См. также: качество луча, произведение параметра луча, расходимость луча, лазерные лучи, гауссовы лучи, яркость
и другие товары из категории Общая оптика

Если вы хотите разместить ссылку на эту статью на каком-либо другом ресурсе (например, на своем сайте, в социальных сетях, на дискуссионном форуме, в Википедии), вы можете получить необходимый код здесь.

HTML-ссылка на эту статью:

  
 Статья о лучах с ограничением дифракции 
 в  
 RP Photonics Encyclopedia 

С предварительным изображением (см. рамку чуть выше):

  
  alt="article"> 

Для Википедии, например. в разделе «==Внешние ссылки==»:

 * [https://www.rp-photonics.com/diffraction_limited_beams.html 
 статья "Лучи с ограничением дифракции" в Энциклопедии RP Photonics] 

Diffraction

Главная  Пожертвовать  Новый   Поиск   Галерея  Обзоры  Практики  Книги  Ссылки  Семинары  О нас  Контакт

Дифракция
© 2012 KenRockwell.com. Все права защищены.

Самый большой источник поддержки этого бесплатного веб-сайта — когда вы используете эти ссылки, когда получаете что-либо , независимо от страны, в которой вы живете. Спасибо! Кен.

 

ВВЕДЕНИЕ

Adorama платит большие деньги за ваше подержанное снаряжение. B&H Фото — Видео — Профессиональное аудио Я использую Adorama, Amazon, eBay, Ritz, B&H, Calumet, J&R и ScanCafe. Я не могу ручаться за рекламу ниже.

Дифракция потеря резкости или разрешения, вызванная фотографированием с маленькими диафрагмами. Такой же эффект смягчения возникает при фотографировании через диффузионную ткань или оконные сетки.

В любое время вы смотрите или фотографируете через маленькие отверстия, вы получаете дифракцию. косоглазие твои глаза — это дифракция! Посмотрите или сфотографируйте через экран окно или через небольшую диафрагму, и вы получите эквивалент фильтр с мягким фокусом.

См. «Резкость и диафрагма» для лучшего примера фотографий. См. мой обзор Zenitar 16mm Fisheye, где я явно показываю дрянной объектив, который полностью сводит на нет возможности Nikon 10.5mm DX fisheye из-за дифракции и различных эффектов при каждой диафрагме.

См. также этот сайт с множеством других иллюстраций.

 

МАТЕМАТИКА (на ощупь можно перейти к примерам)

См. Кривые MTF для еще лучшего технического объяснения.

Миряне думают дифракция возникает из-за того, что лучи света огибают острые края. Физики известно, что предельное разрешение определяется диаметром Эйри диск, который определяется диафрагменным числом, а также астрономами и спутником-шпионом конструкторы знают, что угловое разрешение определяется диаметром чистой диафрагмы.

Дифракция точно предсказывается как по лучу, так и по волне теория.

Теоретическая максимальное разрешение ограничено диафрагменным числом. Идеальный объектив может сделать это в идеальных условиях. Такой хороший объектив называется «дифракционно ограниченным». Несколько объективы достигают этого уровня при больших значениях диафрагмы. Большинство объективов соответствуют этим уровни на малых апертурах, потому что пределы разрешения настолько низки при f/22.

ф/	пар лески на мм
1,4	1 100
2	800
2,8	565
4	400
5,6	283
8	200
11	141
16	100
22	71
32	50
45	35
64	25
90	17
128	12

Эти предельные разрешения — разрешение, при котором контраст падает до нуля. Контраст уменьшается по мере приближения разрешения к этим цифрам. Если у вас есть система, которая разрешает только 50 л/мм, вы все равно можете увидеть потерю резкость, если вы остановите объектив до f/16, что может обеспечить разрешение 100 л/мм. Это потому, что контрастность падает при более низких разрешениях. которые система может видеть. У вас 0% контраста на пределе разрешение и около 50% контрастности при вдвое меньшем разрешении. Кривая процентного контраста в зависимости от разрешения называется передачей модуляции. Функция (МТФ). MTF похожа на кривую частотной характеристики.

Nikon D200 разрешает около 100 линий на мм. (D200 имеет около 3800 пикселей на 24 мм, или 160 пикселей на мм. Благодаря интерполяции Байера, сглаживающий фильтр во всех камерах и тот факт, что пара линий требуется и светлый, и темный пиксель, D200 разрешает около 2500 линии по горизонтали. 2500 линий / 24 мм = 100 л/мм.) Таким образом, я вижу потеря резкости в приведенных ниже примерах, начиная с f/8, с теоретическим разрешение 200 л/мм.

Большой фотографы формата может сойти с рук с маленькой апертурой, такой как f/64, потому что наша пленка настолько большой. У нас так много миллиметров по горизонтали и по вертикали что у нас еще достаточно разрешения. Конечно даже с большими форматами лучше всего снимать с максимально возможной диафрагмой. Вот почему Я исследовал и написал свой выбор часть Sharpest Aperture лет назад.

 

Кривые MTF

MTF с ограничением дифракции. F (дифракция) = 1800 / ф/стоп.

Дифракция хуже всего при малых диафрагменных числах, таких как f/22, и не является проблемой при больших диафрагменных числах, таких как f/4.

Разрешение, при котором график падает до нуля, рассчитывается как 1800/f/stop. Например, при f/18 это 100 циклов/мм, а при f/1,8 — 1000 циклов/мм.

Конечно, при больших значениях f/, таких как f/1.8, мы ограничены качеством нашего объектива, но при диафрагмировании мы ограничены дифракцией.

Если наше разрешение падает до нуля при определенном разрешении, мы не получаем ничего, кроме серого, но, что более важно, мы получаем гораздо меньший процент модуляции (резкость) при более низких разрешениях.

Например, при f/18, когда наша модуляция падает до нуля при 100 линиях на мм, она составляет всего 40% при 50 линиях на мм. Дифракция — это не прямая линия, ведущая к нулю, она чуть меньше 50% при разрешении 50%. (пояснения см. в кривых MTF.)

Камера Nikon с самым низким разрешением, моя любимая Nikon D40, имеет 3008 пикселей по горизонтали вдоль сенсора DX 23,7 мм, или 127 пикселей на мм. Для создания цикла требуется два пикселя, поэтому шаг D40 составляет 63 цикла/мм.

При диафрагме f/18 даже у идеального объектива модуляция мельчайших деталей составляет всего около 50 % даже на D40. (Могут отображаться более высокие разрешения, но только как псевдонимы. Опять же, см. Кривые MTF для пояснений.)

Вот почему изображения, сделанные при малых значениях диафрагмы, могут выглядеть такими мягкими, а камеры типа «наведи и снимай» с еще меньшими матрицами не будут иметь диафрагму меньше f/8. Фактически, компакты, которые у меня есть, которые показывают меньше, чем f / 8, делают это с фильтрами нейтральной плотности.

Вот почему у меня есть фильтр нейтральной плотности 0,9 3 ступени. Я использую его для более длительных экспозиций движущейся воды, поскольку я избегаю съемки цифровыми зеркальными фотокамерами с диафрагмой меньше f/11.

 

ПРИМЕРЫ

Это 100% Увеличение кадрирует из центров гораздо больших изображений. Эти изображения будут примерно 2 х 3 фута, если их распечатать с таким увеличением.

Я стрелял в них с моим 55 мм f/2.8 Micro на моем D200. Инженеры в лаборатории Kodak здесь, в Сан-Диего, тестировали другие образцы этого объектив на своей машине MTF и сообщил о его центральном разрешение должно быть дифракционным, ограниченным f/5.6. Это означает, что это объектив настолько хорош, насколько это возможно, и идеально подходит для этих примеров.

 

АНАЛИЗ и РЕКОМЕНДАЦИИ

Я вижу резкость снижается при f/8 или f/11. На f/32 выглядит ужасно. я вижу это на своем другие объективы тоже.

Если только вы абсолютно необходима глубина резкости, избегайте диафрагм меньше f/8 на современных цифровых зеркалках. Их разрешающая способность настолько велик, что вы смягчите свои изображения, останавливая без необходимости. Вот почему многие компактные камеры не останавливаются выше f/8.

См. также мою очень продвинутую страницу по выбору Самая острая диафрагма.

Дополнительная информация о дифракции: Кембридж в цвете.

 

Помогите мне помочь вам         наверх

Я поддерживаю свою растущую семью через этот веб-сайт, каким бы сумасшедшим он ни казался.

Самая большая помощь, когда вы используете любую из этих ссылок на Adorama, Amazon, eBay, Ritz, Calumet, J&R и ScanCafe, когда вы получаете что угодно, независимо от страны, в которой вы живете. Это вам ничего не стоит, и это самый большой источник поддержки для этого сайта и, следовательно, для моей семьи. В этих местах лучшие цены и обслуживание, поэтому я пользовался ими еще до того, как появился этот сайт. Всем рекомендую лично .

Если вы найдете это страница так же полезна, как книга, которую вам, возможно, пришлось купить, или мастер-класс, который вы, возможно, пришлось взять, не стесняйтесь помочь мне продолжать помогать всем.

No related posts.