Мобилография уроки: Уроки мобилографии — первые шаги. Что важно учесть?

Содержание

Уроки мобилографии — первые шаги. Что важно учесть?

Каждый, наверное, видел, как делает свои первые шаги ребёнок. Он испуган, не уверен, и в любой момент может упасть, хотя, на первый взгляд, и совершает те же действия, что и взрослый человек. Так же дело обстоит и в сфере мобильной фотографии. С тех пор, как мобилография окончательно ворвалась в мировое сообщество – уже прошёл добрый десяток лет. Но даже сейчас, совсем нетрудно увидеть разительное отличие между снимком с камерофона, который был в руках у профессионального мобилографа, и аналогичным снимком «обычного смертного человека». Порой может даже не вериться в то, что профессионалы используют обычный мобильный телефон. И хотя, по-началу может показаться, что от фотографа только и ожидается, что выбрать подходящий момент и вовремя нажать на кнопку «затвора», но мобилография, и вправду, имеет свои особенности, не учитывая которые, довольно сложно получить хороший кадр, не говоря уже о шедевре. Поэтому давайте обратим внимание на несколько простых советов, следуя которым, каждый сможет грамотно сделать свои первые шаги в мобилографии.

1. Исследуйте настройки своего девайса

Для того, чтобы не ошибиться с настройками фотокамеры мобильного – необходимо прочитать инструкцию. Этот совет особенно актуален, если телефон только недавно куплен. Конечно, можно заметить, что на телефоне изначально уже выставлены заводские настройки, но чаще всего их придётся менять для получения высококачественных снимков. Размер фотографий можно выбрать максимальный, таким образом их разрешение станет выше. Но помните, что это может замедлить процесс записи полученных изображений на память телефона или встроенную карту памяти, поэтому лучше заранее проверить – устраивает ли вас скорость записи.

Выберите наилучшее качество изображения, при наименьшей степени компрессии (сжатия) файлов изображений, само собой это действие увеличит размер будущих фотографий. Не игнорируйте «баланс белого», хотя автоматического режима в ряде случаев может быть достаточно, но именно правильно подобранные настройки под состояние освещённости, помогут вам добиться реальной передачи цветов, какими их видите вы.

Реклама

2. Не используйте вспышку без необходимости

Встроенная вспышка мобильного телефона отличается малой мощностью, поэтому пользоваться ей бессмысленно на большом расстоянии, а на очень близком – она может засветить объект съёмки, либо его часть.  В свою очередь,  это создаст большие проблемы при обработке изображения в графическом редакторе.

Хорошее освещение – залог того, что фотография не получится слишком тёмной, при этом следует избегать чрезмерного освещения, ведь динамический диапазон мобильной матрицы, по сравнению с полноценной фотокамерой, ограничен. Это означает, что при недостатке или избытке освещения — полутени могут отобразиться грубо или вообще отсутствовать.

Помните, если после включения доступного освещения вам всё ещё мало света – вы можете использовать любые «подручные» средства: свет из окна или от монитора или, возможно, вам пригодится фонарик, направленный на любую отражающую поверхность, способную рассеять свет. Иногда можно сэкономить на свете, если сократить расстояние до объекта съёмки, либо изменить положение или угол наклона камеры. Берегите объектив телефона от прямых попаданий лучей источника освещения. И, конечно, не будет лишним, если вы подберёте нужный режим для съёмки (день/ночь, дневной свет/лампа накаливания, улица/помещение и тд..)

3. Для улучшения снимка можно использовать графический редактор

Если на вашем телефоне предусмотрена настройка контрастности или яркости, это в большинстве случаев никак не влияет на повешение уровня детализации изображения в затемнённых или засвеченных его участках. Связано это с тем, что данная функция осуществляется за счёт мобильной электроники. Более лучшим вариантом будет, если вы используете для обработки снимка графический редактор на ПК. Он отлично справится с повышением резкости и цветокоррекцией изображения. Результаты действительно могут приятно радовать.

4. «Зум» – не всегда лучшее решение

Известно, что приближение(«зум») в камере может делиться на два вида: оптическое и цифровое. И если оптическое никак не влияет на итоговое качество полученного изображения, то этого нельзя сказать о цифровом варианте. Оно происходит попросту путём обрезки изображения до границ приближённого объекта. Гораздо лучше вообще снимать без зума, после чего кадрировать изображение в графическом редакторе, который непревзойдённо выполнит эту работу.

5. Спешка – враг любого фотографа

Чем ближе камера мобильного телефона к объекту, тем больше на результате скажутся ваши неосторожные движения рукой, в которой во время съёмки вы держите камеру. В результате рискуете получить нерезкое изображение. Лучше немного поэкспериментировать с точкой съёмки и сделать пару пробных снимков, меняя расстояние до объекта, после чего выбрать более подходящий вариант.

Фотографировать движущиеся объекты с мобильного, в надежде получить именно их чёткими, тоже нельзя назвать хорошей идеей. Ввиду многочисленных конструктивных ограничений встроенной камеры мобильного телефона, скорее всего они окажутся смазанными, поэтому полноценно передать движение не удасться. Лучше попробовать поймать мгновение или паузу, когда на какое-то время движение замедляется, или даже прекращяется. Чаще всего во время движения любых объектов(транспорта, людей, животных, техники) время от времени бывают остановки и повороты. Именно тогда время фотографировать.

Позволяйте мобильной камере привыкать к меняющемуся уровню освещения и изменению расстояния до объекта, особенно, если вы наводили резкость на одном объекте, и хотите сфотографировать другой. Даже профессиональная техника нуждается в этом, только время на стабилизацию(привыкание к изменившимся обстоятельствам съёмки) уходит гораздо меньше, а у вас в руках мобильный телефон, поэтому спешить тем более не нужно, если не хотите получить искажённые цвета и нечёткость. Не стоит резким движением или рывком нажимать кнопку «затвора», это нужно делать плавно. При этом желательно, чтобы сам мобильный телефон в этот момент должен быть неподвижным.

Не будет лишним упомянуть, что данные особенности мобильной матрицы иногда успешно используются для воплощения творческих задумок и получения уникальных, эффектных кадров. То есть в момент фотографирования некоторые мобилографы специально немного смещают камеру по горизонтальной либо вертикальной плоскости, или даже вращают камерофон вокруг оси объекта. Поэтому если у вас есть желание, можете смело экспериментировать.

Но и после нажатия на «затвор» не следует спешить в тот же миг отводить камеру от объекта, иначе вы пополните список начинающих мобилографов, безвозвратно потерявших действительно хорошие кадры. А всё потому, что матрице камерофона нужно намного больше времени на считывание изображения, чем цифровому или зеркальному фотоаппарату.

И всё-таки, в основе мобилографии, как и в любых других видах фотоискусства, лежит определённое настроение, которое автор показывает в своём снимке. Таким образом прежде всего ценятся не столько параметры камеры, сколько мастерство автора настраивать и вовремя применять её функциональность для получения прекрасных, незабываемых фотографий.

Курсы видеосъемки и видеомонтажа на телефоне. Уроки мобилографии (Mobilography)

Как снимать и монтировать видео на телефон. Mobilography.

  • Научитесь снимать на телефон творческие и коммерческие ролики.
  • Освоите монтаж видеороликов. (Пре-продакшн, Продакшн, Постпродакшн)

Что такое сторимейкинг (story making) и как он работает

Представьте, что вы пришли на презентацию нового айфона. На сцену выходит Тим Кук и начинает рассказывать – «В этом году мы заметили, что люди любят фотографировать на свой смартфон. Поэтому мы задумались, как сделать снимки ещё красивее. После долгих инженерных решений мы наконец-то поняли, чего не хватает нашему айфону. Встречайте – четвёртая камера!». Это – сторителлинг.

Сторителлинг (storytelling) – это рассказ не просто о продукте, но и о том, как он был создан. По сути, человеку рассказывают историю, состоящую классически из трёх актов – завязка, кульминация, развязка.

Зритель в данном случае играет пассивную роль. Он – слушатель истории, которая, в теории, способна его увлечь, развеселить или научить чему-то новому. Ну, или убедить купить iPhone.

Сторимейкинг также завязан на истории. Однако зрителю в нём предлагается не пассивная, а активная роль. Он становится участником рассказа, событий или просто происходящего действа. При этом о контент-составляющей не нужно забывать. По сути, сторимейкинг – это не противоположность сторителлинга, а просто разновидность.

Давайте продемонстрируем на примерах. Один из самых популярных видов контента в ТикТоке – это различные челленджи. Они могут быть как весьма оригинальными, вроде перевоплощения под Absolutely Anything или с использованием монтажного трюка с зеркалом, так и довольно глупыми (взять, к примеру, «Грустный русский взгляд»). Каждый из участников челленджа бросает зрителям вызов – смогут ли они не просто повторить приём, а превзойти и сделать его более оригинальным. Хорошей демонстрацией развития такого интерактивного действа служит Adele Challenge, где не нужно было переодеваться, но требовалось проявить остроумие.

Второй пример – это функция «Дуэт» в том же ТикТоке. Совместные ролики и трансляции выглядят весьма оригинально (а также служат хорошим способом для взаимного продвижения). И вновь в историю вовлекается ещё один участник, а зрителям предлагается не только наблюдать за развитием событий, но также повторять.

Говоря об Инстаграме, нельзя не упомянуть две неплохие функции в сториз. Первая – это опросы. Людям, посмотревшим сториз, предлагается выбрать один из двух вариантов – и это решение в теории способно повлиять на контент, который они в дальнейшем увидят. Вторая – это вопросы. Зрителям предлагается задать вопрос автору сториз, а в одной из дальнейших публикаций этот самый автор даст ответ. Функция часто используется публичными личностями. Например, священник Павел Островский собирает таким образом вопросы от подписчиков – о вере, религии, церкви или просто каких-то личных делах, а потом в следующих сториз даёт на них остроумные или мудрые ответы.

Всё это – примеры сторимейкинга: вовлечения зрителей в производство контента. Они не остаются безучастными «слушателями», как в кино или театре. Они напрямую способны взаимодействовать с контент-мейкером или даже создавать собственный контент на общую тематику.

Сторимейкинг очень важен для видео в Инстаграм и ТикТок. Тому есть несколько причин:

  • 1. У вас всего 15-60 секунд. Рассказать подробную историю за это время невозможно (если, конечно, у вас не завалялось где-нибудь подборки анекдотов времён Горбачёва), а вот повеселить, впечатлить или побудить к действию – вполне можно;
  • 2. Аудитория этих сервисов любит простые, законченные действия. Им не хочется по два с половиной часа смотреть видео, чтобы потом ещё дольше думать над увиденным. Полюбовался, впечатлился, поставил лайк или оставил голос, и пошёл дальше листать ленту;
  • 3. Если действие подразумевает возможный фидбэк, то зритель, скорее всего, подпишется на вашу страницу. Ему хочется посмотреть, к чему приведут его решения и какими станут последствия;
  • 4. Наконец, это весело.

Чтобы развить в себе навыки сторимейкинга, не нужно читать долгие и унылые статьи. Для этого требуется самостоятельно пробовать. Сначала можно принимать участие в различных челленджах и флешмобах, а потом – запускать собственный. И, конечно, устраивать интерактив с аудиторией.

Как делать ролики для Инстаграм

Традиционный формат видеосъёмок не подходит для современных социальных сетей. Длинные, информативные, полные контента и спецэффектов ролики уже почти никому не интересны – им на смену пришли короткие, динамичные, с «клиповым монтажом». Это обусловлено распространением таких социальных сетей, как ТикТок, где максимальная длина видео – всего 60 секунд, или Инстаграм с его 15 секундами на клип в сториз. Кроме того, подобные ролики смотрят в вертикальном формате, а это также очень важно для понимания концепции и планов.

И при этом практически все успешные «новые блогеры» используют такой подход, как сторимейкинг. С него и начнём рассказ о том, как снимать интересные видео для Инстаграм, ТикТок и Ютуб.

Задача ролика для Инстаграм – продемонстрировать что-то очень красивое или важное. Здесь монтаж не имеет такого значения. А вот именно концепция сцены, кадра и контент – превалируют. Максимальная длительность одного клипа в сториз – 15 секунд, и за это время нужно продемонстрировать всё, что хочется или требуется.

При съёмке ролика для Инстаграм внимательно проработайте концепцию кадра. Если вы демонстрируете образ или лук для магазина одежды – пусть модель в подобранных вещах находится в свободной, пустой комнате, на открытом пространстве и так далее. Объекты в кадре не должны отвлекать внимание от центральной детали. У зрителя нет времени рассматривать, что там находится на фоне. Если какая-то деталь отвлечёт его, то, что вы хотели продемонстрировать, ускользнёт из поля зрения. А тапать по левой стороне экрана, чтобы вернуться на предыдущую страницу сториз – лень.

В последнее время в инстаграм-видео также набирает популярность моушн-дизайн. Эта компьютерная анимация также способна идеально продемонстрировать продукт, особенно если вы хотите сделать акцент на каких-либо мелочах – составляющих товара, небольших изменениях в сравнении с предыдущим поколением или просто премиальных деталях. Однако моушн-дизайн требует определённых навыков, и если у вас их нет – то лучше обратиться к профессионалам или же попробовать что-то другое.

Применять какой-либо значительный монтаж также не рекомендуется из-за особенностей UX сториз Инстаграма. Пользователь может запутаться, закончился уже клип или ещё нет. Постарайтесь обойтись без монтажа – сделайте зрителю комфортно.

Как и в случае с другими сервисами, вы можете изначально монтировать видео на компьютере, а потом через подключённый смартфон, эмулятор или веб-клиент Инстаграма заливать его на свою страницу.

Мобилография онлайн курсы мобильной фотографиии

Скачать чек-лист по мобилографии «Как сделать хорошее фото на смартфон» тут ► Смартфон – это компактная фотокамера и фоторедактор, которые всегда под рукой.

Сила любой фотографии в основном зависят не от камеры, а от творческого видения фотографа. На курсе вы узнаете как использовать смартфон на все 100% и обходить его ограничения.

В период карантина вы можете эффективно обучаться Online. Зайти в web-класс можно из любого города. Каждый из вас сможет почти индивидуально общаться с преподавателем и видеть его экран, перечитывать презентации и пересматривать самые важные видео-записи, выполнять e-тесты, задавать вопросы и делиться ссылками в чате. Мы умеем объяснять сложные вещи просто и интересно. Вы узнаете основные принципы фотографии, хитрые мобильные лайфхаки и нестандартные приемы съемки.

Вы научитесь:

  • работать в профессиональных режимах своей фотокамеры и осмысленно менять настройки
  • выбирать правильный ракурс и использовать еще 20 правил композиции сильных кадров
  • снимать пейзажи, портреты, еду, уличные и другие объекты, а также объекты в движении;
  • снимать в сложных условиях освещения;
  • быстро и качественно обрабатывать ваши снимки.

Для обучения вам необходимо иметь смартфон с рабочей камерой и установить бесплатные программы обработки фото Snapseed, Lightroom и SNOW. Рекомендуем платный TouchRetouch

* Места без предоплаты не бронируются. * Минимальное количество людей в группе — 7 Некоторые уроки курса могут меняться местами, это никак не влияет на усвоение знаний , друзья!

Группа запускается по набору — ориентировочный старт 21 сентября. График: Пн, Ср, Пт с 19:00 до 21:30

Стоимость: 2500 грн.  за 6 уроков

Записаться • Оплатить

Урок 1. PRO кнопки у камер Xiaomi, Samsung, iPhone и Huawei и др.  

  • Самостоятельно прочитай статью Как делать крутые фото на смартфон: нужные кнопки и функции►
  • Мелкие шумные матрицы и искажающие  объективы – недостатки смартфона, которые побеждены стэкингом?
  • Нам нужно больше. Размер фотографии в пикселях, в сантиментах
  • Отложенная съемка.
  • Gps-данные фото. 
  • Диапазон светочувствительности вашей камеры – ISO
  • Зачем нужен баланс белого.
  • Обзор дополнительных аксессуаров: штатив, крепеж телефона, шаровая головка, отражатель, LED-светильники.
  • Практическая часть и домашняя работа.

Урок 2. Экспозиция – количество света в кадре. Светопись форм

  • Три кита экспозиции.
  • Длинная и короткая выдержка. Боке диафрагмы. 
  • Как менять настройки при заморозке и размытии объектов.
  • Фокусировка – основные ошибки.
  • Угол обзора объектива.
  • Экспокоррекция – светлее, темнее.
  • Длинная выдержка как инструмент создания художественных эффектов.
  • Типология света. Объем и формы
  • Практическая часть и домашняя работа.

Урок 3. 20 правил композиции в мобилографии.

  • Три важных контраста фотографии: тоновый, цветовой, текстурный
  • Ракурсы, планы, точка съемки. Учимся избегать плоских фотографий.
  • Правило диагоналей. Учимся управлять вниманием зрителя и создавать динамику в кадре.
  • Ритм. Перспектива. Как указать на смысловой центр.
  • Цветовой круг Иттена – шпаргалка для удачной работы с цветом.
  • Иллюстративный просмотр фоторабот мастеров фотографии. Совместный анализ
  • Архитектура и пейзаж: геометрия кадра.
  • Скачай «20 Золотых Правил Композиции» pdf чек-лист ►

Урок 4. Свет при съемке художественного портрета. 

  • Основные режимы камеры: какой для какого вида съемки.
  • Портрет без искажений: модель, beauty, селфи. Отложенный спуск
  • Золотой час. Мягкий и жесткий свет.
  • Использование отражателя.
  • Композиционные приемы для передачи эмоций. Серийная съемка
  • Вечерняя съемка. Закаты и рассветы.

Урок 5. Предметная съемка

  • «Портреты» предметов.
  • Знакомимся с предметной фотографией.
  • Сборка и съемка Flat Lay композиции.
  • Естественный свет. Из чего состоит и на что обратить внимание.
  • Особенности использования отражателей в предметке.
  • Настройки камеры и крепление смартфона.
  • Lifehack: как держать телефон при съемке, как чистить объектива
  • Домашнее задание: собрать и снять одну Flat Lay композицию.

Урок 6. Обработка фото в редакторе SnapSeed

  • Google Photo – фото хостинг, облако для хранения, редактирования, обмена фотографиями и видео.
  • 9 основных ошибок мобилографии, которые следует исправлять на фото
  • Ретушь портрета. Три спасительных контраста.
  • Обзор инструментов Snapseed – бесплатное, мощное и интуитивно понятное приложение для обработки фото “на ходу”. 
  • Оттенки кожи, яркость фона, контраст на фото и тонирование снимка.
  • SNOW и Lightroom – рассмотрим если успеем. Вручение дипломов.
  • Домашнее задание: взять свою фото с прошлых уроков и обработать в SnapSeed, обращая внимание на тоновый, цветовой и текстурный контрасты.

 

ТОП 10 правил мобильной фотографии

1. Помните о настройках камеры смартфона. Откажитесь от усредненных, заводских настроек и установите максимальное разрешение для ваших фотографии, подберите нужный баланс белого.

2. Следите за тем, чтобы оптика вашего телефона была чистой при съемке. Наш телефон, а вернее его камера кардинально отличается от объективов фотокамер. Хотя бы тем, что у последних есть крышечка – надежная защита от пыли, отпечатков пальцев. Поэтому, перед съёмкой, протирайте камеру вашего телефона. И тогда картинка не будет размытой.

3. Не пользуйтесь вспышкой смартфона. «Вспышка мобильного телефона» – это громко сказано. Это просто светодиодный фонарик. Поэтому отключите вспышку и забудьте о ней! Но иногда использование «фонарика» даёт очень неплохой результат.

4. Не используйте зум (приближение). Это снижает качество снимка. Лучше снять кадр, а потом, в фоторедакторе, обрезать изображение до нужного уровня.

5. Статика. Снимайте преимущественно статику. Объект в движении – сложная задача для смартфона. Очень хорошо, если есть возможность снимать с опоры. Идеально если, есть монопод. Так вы избегаете размытости, шевелёнки снимка. Или старайтесь поймать момент паузы в движении.

6. Отключите звуки камеры. Не привлекайте к себе внимания! Старайтесь быть незаметными! Снимая людей на улице имитируйте видеосъемку.

7. Включите режим наложения сетки и следите за композицией и горизонтом. Располагайте объект в сетке по правилу третей и композиция кадра станет лучше.

8. Размер кадра. Не старайтесь угодить Инстаграмму, снимая только в квадратах. Снимайте на максимум. Всегда можно обрезать лишнее в редакторе фотографий.

9. Экспозиция. Установите замер экспозиции, тяпнув пальцем на светлые области сюжета. Камера сразу затемнит ваш кадр! Лучше снять в недосвете и не потерять детали в светks[ зонах. Темные места осветлим программно. Если же тапнуть на самом темном участке, ваш кадр станет светлее. Вам решать.

10. Пост-обработка фотографий обязательна в силу ограничений оптики и чувствительности камеры. Загрузите сторонние программы с Play Market (для Android) или с App Store (для IOS). Они более функциональны по сравнению со встроенными и имеют огромные наборы не только инструментов, но и фильтров. Подробнее о программах – на 5 уроках курса

► Понравилась статья? Сохрани себе.

 

Фотографии выпускников фотокурса Мобилография

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА Внеурочного курса Я умею снимать на телефон. Курс «Мобилография»

Некоммерческое общеобразовательное частное учреждение
«Рязанский Свободный лицей»

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА

Внеурочного курса

Я умею снимать на телефон. Курс «Мобилография»

Уровень обучения (класс)  начальное общее образование, среднее общее образование
2-6 классы

Количество часов  8 ч

Направленность: техническая

Учитель Горшкова Александра Михайловна

Год составления программы – 2019

г. РЯЗАНЬ

Пояснительная записка

В последние годы фотография развивается все интенсивнее, входит в каждый дом.
И действительно, невозможно сегодня представить современное общество без
фотографии: она широко используется в журналистике, с ее помощью ведется 
летопись страны и каждой семьи.

Мобилография – разновидность фотографического искусства, при котором в качестве инструмента используются электронные приборы со встроенной цифровой фотокамерой, первоначально не предназначенные для профессиональной фотосъемки, такие как мобильные телефоны, карманные персональные компьютеры и тому подобное.

Данная программа позволяет многим детям найти свое место в жизни, развить в себе способности творческого самовыражения или просто заняться интересным и полезным делом. Она рассчитана на самый широкий круг воспитанников без каких-либо ограничений.

Основным методом работы модуля должен быть практический показ приемов фотосъемки на телефон.

При выполнении работ следует максимально использовать личную инициативу учащихся, с тем, чтобы поощрять творческую мысль, самостоятельные поиски интересных и современных тем.

Специфика модуля позволяет развивать такие черты характера, как усидчивость, собранность, целеустремленность, коммуникабельность. Занятие фотографией помогает им обрести уверенность, почувствовать свою ценность, найти свое место.

Рабочая программа по мультипликации разработана согласно требованиям следующих нормативных документов:

  • Федеральный Закон «Об образовании в Российской Федерации» от 29.12.2012 № 273-ФЗ.

  • Концепция развития дополнительного образования детей (утверждена распоряжением Правительства РФ от 04.09.2014 № 1726-р).

  • СанПин к устройству, содержанию и организации режима работы образовательных организаций дополнительного образования детей (утверждено постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 04. 07.2014 № 41)

  • Порядок организации и осуществления образовательной деятельности по дополнительным общеобразовательным программам (утвержден приказом Министерства образования и науки РФ от 29.08.2013 № 1008).

  • Стратегия развития воспитания в Российской Федерации на период до 2025 года (утверждена Распоряжением Правительства Российской Федерации от 29 мая 2015 г. N 996-р)

Данная программа имеет художественную и техническую направленность.

Программа направлена на:

  • формирование и развитие творческих способностей обучающихся;

  • удовлетворение индивидуальных потребностей в техническом развитии;

  • развитие и поддержку детей, проявивших интерес и определенные способности к фотографическому творчеству.

Цели и задачи кружка

  • Привлечь детей к занятию фотографией.

  • Подготовка учащихся к выставкам и конкурсам.

  • Укрепление дружбы между учащимися.

Режим работы:

 Возраст обучающихся:

Ожидаемые результаты:

К концу обучения в данном модуле учащиеся должны уметь получать резкие фотоснимки без грубых композиционных ошибок. Важный результат – желание ребят продолжать обучение и совершенствовать свое мастерство.

Содержание модуля

  1. Фотография. Как фотографировать на телефон.

Теория: краткая история фотографии, средства фотосъемки, камера на телефоне

Практика: делать фото на телефон, работать в парах

  1. Правила композиции. Свет и тень в кадре.

Теория: правило третей, свет, тень, игра света и тени

Практика: создать серию фотографий с игрой света и тени, работать в парах

  1. Ракурс съемки. Смысловой центр. Освещенность.

Теория: ракурс съемки или меняем «угол зрения», смысловой центр – главный объект съемки, свет в кадре – экспозиция, переэкспонированный кадр, недоэкспонированный кадр

Практика: умышленное создание переэкспонированных и недоэкспонированных фотографий

  1. Режим съемки. Стили изображений.

Теория: режим съемки (спортивный, портретный, пейзажный и другие), стили изображения (черно-белое изображение, изображение в стиле «сепия»)

Практика: попробовать работу камеры с различными режимами и стилями съемки

  1. Практика. Натюрморт.

Практика: составить натюрморт, сфотографировать его с разных ракурсов, работать в парах

  1. Практика. Пейзаж.

Практика: сделать серию пейзажных фотографий

  1. Практика. Архитектура.

Практика: сделать серию фотографий зданий и элементов архитектуры района, города

  1. Практика. Портрет.

Практика: сделать фото друзей, обучающихся на курсе «Мобилографии», родственников, учителей, одноклассников, работать в парах

Тематическое планирование

Тема

Кол-во часов

Фотография. Как фотографировать на телефон

1

Правила композиции. Свет и тень в кадре

1

Ракурс съемки. Смысловой центр. Освещенность

1

Режимы съемки. Стили изображений

1

Практика. Натюрморт

1

Практика. Пейзаж

1

Практика. Архитектура

1

Практика. Портрет

1

Материально-техническое обеспечение:

— индивидуальный телефон (или фотоаппарат) учащегося.

МОБИЛОГРАФИЯ

МАТЕРИАЛ К СТЕНДОВОМУ ДОКЛАДУ

ПО ТЕМЕ «МОБИЛОГРАФИЯ»

/data/files/v1513238666. jpg (0x0)

  В современном мире фотография уже перестала быть уделом исключительно профессионалов, вооруженных мощными зеркальными фотоаппаратами и обладающих недюжинным мастерством. Наша повседневная жизнь состоит из множества скоротечных событий, скрытых моментов времени, которые можно запечатлеть на камеру мобильного телефона и затем поделиться впечатлениями от сделанных фотографий со своими друзьями.

   Сегодня к фотографическому искусству могут приобщиться все желающие. Примером этого может служить совершенно новый жанр фотоискусства под названием мобилография.

Мобилография как разновидность фотоискусства

   Мобилография — разновидность фотографического искусства, при котором в качестве инструмента используются электронные приборы со встроенной цифровой фотокамерой, первоначально не предназначенные для профессиональной фотосъемки, такие как мобильные телефоны, планшеты, компасы, бинокли, зажигалки и тому подобное.

   Отличительная особенность жанра — запечатление трудновоспроизводимых ситуаций и «цифровой стиль» из-за низкой разрешающей способности камеры.

   Основная прелесть мобилографии заключается в том, чтобы получить эмоционально окрашенные кадры, вызывающие у человека определенные чувства и эмоции. Фотографии, сделанные с помощью мобильного телефона, позволяют передать одиночество, радость, счастливые мгновенья, любовь, переживания и ненависть. Такие фотографии отличаются искренностью.

  Мобилография не является конкурентом традиционной фотографии, где качество и правильно выстроенная композиция возводятся в главные критерии оценки фотоизображения. Она лишь соседствует с классической фотографией и развивается параллельно с ней, вбирая в себя различные техники получения и обработки фотоизображений.

Мобильные приложения для обработки фотографий

«PRISMA»

    ПЛЮСЫ

    МИНУСЫ

    Отличный набор всевозможных фильтров.

    Хороший выбор специальных эффектов. Возможность загрузки дополнительных наборов с фильтрами.

    Быстрая скорость работы при хорошем подключении к сети.

    Простая и удобная реализация современного интерфейса.

      Возможны подтормаживания при обработке фото.

      Редкие сбои при произведении репоста в Instagram.

      Некоторые спецэффекты, могут портить исходное качество изображения.

        «PICSART»

          ПЛЮСЫ

          МИНУСЫ

          Удобный и простой интерфейс.

          Огромная «редакторская» база с возможностью бесплатного пополнения.

          Постоянные обновления.

          Создание собственных альбомов и поддержка большинства социальных сетей: Facebook, Tweeter, Instagram и Google+.

            Постоянное наличие всплывающей рекламы.

            Для приобретения Vip-эффектов придется раскошелиться.

              «МАГИЯ ФОТОКОЛЛАЖ»

                ПЛЮСЫ

                МИНУСЫ

                Плюсов нет, сплошные минусы.

                  Варианты рамок практически ничем не отличаются, только формой.

                  Выбор фото только 10, не больше и не меньше.

                  Нет возможности выбора переднего плана из фотографий.

                    «PIP Camera»

                      ПЛЮСЫ

                      МИНУСЫ

                      Интересные, необычные картинки.

                      Можно сделать фото прямо в картинке либо выбрать из готовых фотографий.

                      Простота использования.

                        Небольшой выбор картинок.

                          «PHOTO COLLAGE»

                            ПЛЮСЫ

                            МИНУСЫ

                            Большое количество всевозможных рамок.

                            Есть функция – автоколлаж.

                            Возможность самостоятельно выбирать количество фотографий.

                            Возможность центровать фото.

                              Дополнительные рамки – платные.

                              В функции «Автоколлаж» можно выбрать только 6 фото, не больше и не меньше.

                                Советы

                                • Исследуйте настройки своего девайса. Заводские настройки придётся менять для получения высококачественных снимков.
                                • Не используйте вспышку без необходимости. Пользоваться встроенной вспышкой бессмысленно, она может засветить объект съёмки, либо его часть. 
                                • Для улучшения снимка используйте графический редактор. Если на вашем телефоне предусмотрена настройка контрастности или яркости, это никак не влияет на повышение уровня изображения.
                                • «Зум» – не всегда лучшее решение. Гораздо лучше снимать без зума, после чего кадрировать изображение в графическом редакторе.
                                • Спешка – враг любого фотографа. Чем ближе камера мобильного телефона к объекту, тем больше на результате скажутся ваши неосторожные движения рукой. В результате — нерезкое изображение.

                                Выводы

                                   Мобилография нашла свое место в повседневной жизни. Фотографию, снятую, например, на смартфон, лучше обработать с помощью мобильных приложений для фотографий. Неспешно, с чувством, если хотите хороших результатов.

                                       Произведение искусства – результат упорного труда. А желание творить обязательно приведет к результату, только для этого нужно приложить немалые усилия.


                                 

                                Курсы мобилографии Алматы

                                УЧАСТВОВАТЬ

                                2 мобилографа

                                • Выполняй домашние задания по урокам
                                • Получай баллы за выполненные задания от кураторов

                                Выполняй задания

                                и выигрывай
                                крутые призы!

                                Выиграй поездку в Индию, Индонезию или Таиланд для съемок бэкстейджа новой части фильма «Бизнес по-казахски»

                                Поездка со съемочной командой фильма «Бизнес по-казахски»

                                10 мобилографов

                                • Выбери подходящий тариф и удобный способ оплаты
                                • Пройди 56 онлайн уроков

                                Пройди курс

                                • По итогам баллов спикеры выберут топ самых лучших выпускников

                                Попади в ТОП-20

                                стартер-пак мобилографа

                                + бонус

                                СТАБИЛИЗАТОР

                                iPhone 13

                                МИКРОФОН

                                Получи возможность стать личным мобилографом Нурлана Коянбаева

                                Контракт с Нурланом Коянбаевым

                                1 мобилограф

                                Стань мобилографом для звезд казахстанского шоубизнеса

                                Проекты со звездами Казахстана

                                О курсе

                                Практические домашние задания

                                Старт курса — 8 июля

                                Бессрочный доступ к платформе

                                Длительность — 1 месяц

                                Работы в портфолио

                                Доступ к закрытым чатам

                                26 онлайн-уроков

                                Поддержка от кураторов

                                Тарифы

                                СТАНДАРТ

                                50 990тг. 
                                12 990 тг.

                                ✓ Общий чат курса

                                ✓ Доступ к 26 урокам на 3 месяца

                                ✓ Доступ к 3 дневному практикуму

                                ✓ Раздаточные материалы

                                ✓ Канал для вдохновение и повышение насмотренности

                                ✓ Доступ к приложению, где можно найти проекты

                                ✓ Сертификат об окончаний курса

                                ✓ Каналы для поиска вдохновения и развития насмотренности

                                KASPI РАССРОЧКА / RED

                                оплатить

                                ПРО

                                100 990тг.
                                19 990 тг.

                                Участие в розыгрыше призов

                                ✓ Доступ к 26 урокам на 6 месяцев

                                ✓ Доступ к 3х дневному практикуму

                                ✓ Раздаточные материалы

                                ✓ Канал для вдохновения и повышения насмотренности

                                ✓ Доступ к приложению, где можно найти проекты

                                ✓ Общий чат курса

                                ✓ Бессрочный доступ к более 50 бонусным урокам

                                ✓ Индивидуальная проверка домашних заданий кураторами

                                ✓ Групповой чат с кураторами

                                ✓ Доступ к закрытому чату с актуальными вакансиями

                                ✓ Возможность к получению диплома об окончании курса

                                KASPI РАССРОЧКА / RED

                                оплатить

                                ПРЕМИУМ

                                200 990тг.
                                49 990 тг.

                                ✓ Участие в розыгрыше призов

                                ✓ Доступ к 26 урокам на 12 месяцев

                                ✓ Доступ к 3х дневному практикуму

                                ✓ Раздаточные материалы

                                ✓ Канал для вдохновения и повышения насмотренности

                                ✓ Доступ к приложению, где можно найти проекты

                                ✓ Бессрочный доступ к более 50 бонусным урокам

                                ✓ Индивидуальная проверка домашних заданий кураторами

                                ✓ Общий чат курса

                                ✓ Групповой чат с кураторами

                                ✓ Доступ к закрытому чату с актуальными вакансиями

                                ✓ Возможность к получению диплома об окончании курса

                                ✓ Помощь в трудоустройстве

                                ✓ Участие в воркшопах для практики и создания портфолио

                                ✓ Участие в съемках в составе продакшн команды

                                ✓ Возможность трудоустройства в команду школы мобилографии

                                KASPI РАССРОЧКА / RED

                                оплатить

                                Оставьте заявку и мы вам перезвоним

                                НУЖНА ПОМОЩЬ?

                                Программа

                                • Вводной урок
                                • Полезные инструменты, для удобного прохождения курса
                                • Как будет проходить отбор на розыгрыш призов?
                                • Композиция
                                • Техники съемок
                                • Приложение “FilmicPro”
                                • Виды объективов в телефоне и форматы видео
                                • Q&A (вопрос/ответ)
                                • Домашнее задание №1
                                • Монтаж через приложение “Videoleap”
                                • Sound design (звуковые эффекты)
                                • Цветокоррекция
                                • CINEMATIC TITLES (субтитры)
                                • Q&A (вопрос/ответ)
                                • Домашнее задание №2
                                • Принципы выстраивания света
                                • Виды техники по построению света в киношном стиле
                                • Как правильно выставить свет в домашних условиях?
                                • Q&A (вопрос/ответ)
                                • Домашнее задание №3
                                • Этапы съемок: Pre-production, Production, Post-production
                                • Где искать идеи?
                                • Сценарий для видео
                                • Раскадровка кадра
                                • Как снимать на хромакее? Использование футажей и масок
                                • Q&A (вопрос/ответ)
                                • Домашнее задание №4
                                • Мышление мобилографа
                                • Полезные инструменты для работы
                                • Позиционирование и продвижение личного бренда
                                • SMM
                                • Как найти первых клиентов?
                                • Домашнее задание №5
                                • Подготовка к дипломной работе
                                • Продакшн
                                • Защита дипломной работы

                                О спикере

                                Асхат Шыналиев

                                Mobile filmmaker

                                • Бывший бухгалтер с 10 стажем, который снимает клипы для звезд на смартфон
                                • Основатель первой школы по мобильной съемке MOB ARMY SCHOOL
                                • Выступал спикером для 250 ведущих бизнесменов Казахстана
                                • Через объектив смартфона заработал 60 млн. тг.
                                • Обучил мобилографии более 20 000 студентов

                                Остались вопросы?

                                Для начала работы подойдет абсолютно любой смартфон. Конечно, с айфоном будет удобнее. А если вы выиграете поездку с Нурланом Коянбаевым и будете снимать бэкстейдж, то бонусом вам достанется новенький Apple Iphone 13.

                                Да, конечно. Несмотря на то, что курс будет длиться всего месяц, мы включили туда самый необходимый объём теории, а также рассказываем обо всех фишках мобильной съёмки. Всего этого будет достаточно, чтобы к концу курса собрать портфолио и найти своих первых клиентов.

                                Курс будет проходить полностью онлайн. Значит, ты сможешь получить обучение находясь в любой точке нашей страны и с любого устройства (телефона, планшета или ноутбука) в удобное для тебя время.

                                Курс будет на русском и казахском языках. Выбери язык на платформе и урок будет на том же языке.

                                Обучение будет проходить на нашей платформе-сайте и в приложение. Вы можете сами выбрать удобное для вас место обучения. После оплаты вы получите туда доступ. В течении обучения, вы сможете смотреть уроки, возвращаться к предыдущим урокам, загружать свои работы в рамках домашних заданий, а также видеть свой рейтинг.

                                Дата начала курса — 8 июля. Продолжительность курса — 1 месяц

                                Обратную связь смогут получать все студенты, которые приобретут тариф “ПРО” или тариф “ПРЕМИУМ”.

                                В розыгрыше призов участвуют те, кто купил тариф “ПРО” или тариф “Премиум”. В нашем розыгрыше призов нет рандома, вы получаете призы за ваши навыки и креативность. Поэтому, самое главное учиться, выполнять домашние задания, сдавать их в срок и проявлять максимальную креативность.

                                Да, конечно. По условиям участия, если вы выиграете поездку, то все расходы будут покрыты компанией.

                                Курс делится на 3 тарифа:

                                1. Стандарт — 12 990 тг.
                                2. Про — 19 990 тг.
                                3. Премиум — 49 990 тг.

                                ПОДРОБНЕЕ О ТАРИФАХ

                                Да, если вы хотите попасть в число 20ти лучших студентов и попасть в съемочную команду Нурлана Коянбаева, то конечно обязательно. В остальных случаях, мы всё же рекомендуем вам всё же делать домашние задания, так как в отдельных видео мы рассказываем и показываем как делать видео, а вам останется только отработать эти навыки и получить потрясающие видео.

                                Да, конечно. У нас нет возрастных ограничений.

                                Сертификат получат все студенты курса. А студенты тарифов “ПРО” и “ПРЕМИУМ”, при успешной защите дипломной работы получат диплом.

                                Оставьте заявку и мы вам перезвоним

                                НУЖНА ПОМОЩЬ?

                                • Условия участия
                                • Публичная оферта
                                • Политика обработки данных

                                Запись на курс

                                STMTE.ORG – ОБУЧЕНИЕ Пожилые люди для 22-го века в технологическом образовании

                                Стандарт

                                Технологии в сознании некоторых пожилых людей рассматриваются как проблемы. Другие пожилые люди рассматривают технологии как решение. Независимо от того, рассматривается ли это как проблема или решение, технологии никуда не денутся.

                                Обращаясь к своим технологическим потребностям и желаниям, вы должны быть честными с самими собой. Вы знаете, как многому может научиться ваш разум. Вам даже нужно знать, как бросить вызов вашему уровню комфорта и упрямства?

                                Когда вы расслабитесь и проявите терпение, выходя за пределы своей зоны комфорта, вы попадете в такие места, как мобильография.

                                Мобилография, если подумать, это использование камеры вашего телефона для фотографирования.

                                Однако мобильография идет намного глубже. Мобилография играет жизненно важную роль в использовании большинства ваших повседневных приложений. Независимо от того, настраиваете ли вы новую учетную запись через одно из своих приложений, для которого требуется профиль, или делитесь с кем-то файлом Dropbox.

                                Мобилография очень полезна.

                                Есть несколько моментов, которые следует усвоить, понимая технологию обучения мобилографии.

                                Первым пунктом мобилографии является то, как она используется в обмене текстовыми сообщениями.

                                Мобилография посредством обмена текстовыми сообщениями зависит от того, как вы фотографируете и как редактируете свои фотографии. Обязательно посетите нашу страницу в Facebook и канал на YouTube, чтобы узнать больше.

                                Вторая точка мобилографии — по электронной почте.

                                Всякий раз, когда вы прикрепляете фотографию или даже размещаете изображение в тексте своего электронного письма. Вы используете мобилографию. Теперь вы можете получить рекламное объявление по электронной почте от вашего любимого магазина с несколькими фотографиями продуктов для продажи.

                                Третья точка мобильности — социальные сети.

                                Facebook — идеальное место, где можно применить свои навыки мобилографии. Вы можете загрузить изображение из своей галереи прямо на Facebook. Facebook также упростил процесс фотографирования во время использования их службы социальной сети. Просмотрите наши уроки и зайдите на Facebook и используйте свои навыки мобильографии в социальных сетях.

                                Мобилография – быстро развивающееся направление. Как Senior вы должны убедиться, что понимаете, как использовать эти навыки. Будь то текстовые сообщения, электронная почта или социальные сети. Ваша камера теперь стала вашим любимым журналом или телешоу. Будет ли ваш голос услышан в такое прекрасное время технологий?

                                • Свидание 25 октября 2016 г.
                                • Теги Пожилые люди, Пожилые люди и мобильные телефоны, Пожилые люди изучают технологии, технологии, технологическое образование
                                Стандарт

                                Мы всегда слышим фразу, что терпение — это добродетель. Но так ли это? Как терпение позволяет нам быть добродетельными или даже побеждать, когда дело доходит до освоения нашей технологии?

                                Ответы просты. Тем не менее, требуется много практики с самим собой и вашими технологиями.

                                Когда вы осваиваете новую модную технологию, которая работает большую часть времени. Есть пара моментов, которые нужно помнить.

                                Во-первых, помните, что это компьютер.

                                Компьютеры ломаются, зависают, делают ошибки и, самое главное, забывают или пропускают то, что вы только что сказали. Сказав это, вы должны проявить терпение. Или же вы будете принимать больше нервно-паралитических препаратов, чем предписано, LOL.

                                Еще один момент, который следует принять во внимание, — это использование большего количества приложений, напрямую подключенных к Интернету.

                                Использование приложений быстрого доступа уменьшит уровень разочарования. Прикосновение к приложению устраняет дополнительные шаги, связанные с выходом в Интернет, переходом в Google, Bing, Yahoo или там, где вы вводите поисковые запросы, такие как Target, Facebook и даже ABC. Есть даже традиционный http://www.target.com….. Понятно? Использование приложений является большим преимуществом.

                                Последний способ развить терпение — это смеяться.

                                Я имею в виду смех над собой, когда вы теряетесь в использовании своих технологий. Смейтесь, когда узнаете что-то новое о своей технологии. И последнее, но не менее важное: посмеяться, когда вам нужно зайти к одному из ваших операторов связи в магазинах на сайте, чтобы проверить, исправить, очистить и обновить вашу технологию. Смех высвобождает уровень терпения, который приносит удовольствие, хорошо выглядит и полезен для вашего сердца.

                                1. Это компьютер

                                2. Использовать больше приложений

                                3. Смеяться

                                Будучи старшим технологом, проявляя терпение по мере того, как вы получаете доступ ко все большему количеству технологий, образование будет поддерживать вас как жизненно важный ресурсный инструмент на вашем жизненном пути.

                                 

                                • Свидание 25 октября 2016 г.
                                • Теги Пожилые люди, Пожилые люди и мобильные телефоны, Технологии обучения пожилых людей
                                Стандарт

                                Сегодня Старшие технологи могут слушать любимые радиостанции, где бы они ни находились. Технологии прошли долгий путь со времен традиционных аналоговых радиоприемников. Я даже помню время, когда мы сидели перед деревянной коробкой, из которой играла моя любимая сотня лучших.

                                Радио работает на всех видах техники. Будь то ваш iPhone, Android или ноутбук — радио здесь, и оно звучит очень хорошо.

                                Музыку или новости можно слушать через такие приложения, как Pandora, Google Music, iHeartRadio и Sirius XM.

                                Готовы ли вы слушать и контролировать свой эфир? Итак, вот несколько простых шагов, которые помогут вам начать поиски радио.

                                Простой шаг № 1

                                Перейти в App Store ваших технологий

                                Простой шаг № 2

                                Введите ПОИСК «радиостанция» (Вы также можете ввести одно из трех приложений для радиостанций, упомянутых выше)

                                Экран приложения пользователя iPhone и iPad: см. выше

                                Технология Android будет иметь 1 из 2 экранов для ПОИСКА

                                Простой шаг #3

                                Выберите радиостанцию ​​

                                Простой шаг #4

                                Нажмите, чтобы ПОЛУЧИТЬ или УСТАНОВИТЬ

                                Простой шаг #5

                                Дождитесь завершения загрузки приложения радио Нажмите «ОТКРЫТЬ» или нажмите на ЗНАЧОК музыкального приложения (находится на главном экране или пролистайте главный экран, пока не найдете его). музыкальный исполнитель по выбору

                                Простой шаг #8

                                Нажмите, чтобы включить музыкальные станции КНОПКА ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ

                                Простой шаг #9

                                Увеличьте громкость – расслабьтесь – наслаждайтесь музыкой

                                досягаемость ваших кончиков фигуры. Вас больше не заставят сидеть и слушать музыку, которая вам не нравится. Вы можете быть своим собственным диск-жокеем. Эй, вы даже можете использовать свои навыки, чтобы создать настроение для семейного собрания или даже романтической ночи. Выбор за вами.

                                 

                                 

                                 

                                 

                                • Свидание 19 сентября 2016 г.
                                • Теги Пожилые люди, пожилые люди и мобильные телефоны, технологии обучения пожилых людей, технологии
                                Стандарт

                                Вам не терпелось сделать еще один шаг и сделать что-то новое на своем мобильном устройстве? Вы видели, как другие члены вашей семьи или профессионалы делают удивительные вещи на своих мобильных устройствах, нажимая на несколько изображений (значков) и слов? Что ж, я здесь, чтобы укрепить вашу силу, чтобы продолжить и сделать кран.

                                С приводом от давления

                                Делать отвод с приводом от давления гораздо хуже в мыслях, чем на деле. Использование пальца или стилуса для касания сенсорного экрана, чтобы испытать еще одну часть вашего путешествия в области технологий, является обязательным. Часто пожилые люди боятся прикасаться к значкам своего интернет-браузера.

                                Например, показанные ниже

                                Многие пожилые люди тоже видели эти значки. Но смотрите на них или проведите пальцем вправо мимо них.

                                Сверху вниз ваш календарь; для вас, чтобы нажимать на эти важные даты / встречи, ваши часы; для вас, чтобы установить сигналы тревоги и напоминания для важных моментов, чтобы проснуться или быть готовым, ваш GPS; для вас, чтобы добраться туда, куда вы идете, или найти дорогу домой, потому что вы забыли, где вы, где и последний телефон. Вы знаете, для чего это используется.

                                6 шагов к уверенности в себе

                                К этому моменту вы уже должны уловить мою мысль. Укрепить уверенность в себе как пожилому человеку легко, как раз-два-три. Вот 6 пунктов, которые помогут вам двигаться вперед.

                                1. Улыбайтесь каждый раз, когда нажимаете значок на мобильном устройстве
                                2. Перестаньте думать об ошибке при использовании мобильного устройства
                                3. Смейтесь, когда вы где-то оказались и забыли, как вы туда попали
                                4. Каждый день нажимайте на новый значок на мобильном устройстве
                                5. Расскажите одному из своих друзей о чем-то новом, что вы узнали о своем мобильном устройстве
                                6. Напомните себе, что Египет не был построен за одну ночь, позвольте мне быть терпеливым с самим собой

                                Возвращаясь к этим 6 шагам по укреплению уверенности, вы еще больше расширите свои возможности для изучения «новой технологии». Поверьте мне, я работаю с пожилыми людьми вот уже 3 года, проводя обучающие семинары и семинары по педагогике. Каждый шаг, который делает один из моих старших техников, приближает их к преодолению стигмы, наложенной на пожилых людей, — цифровой неграмотности. Я здесь, чтобы отправиться в это путешествие вместе с вами. Поверьте мне, вы не в группе сами по себе. Поверьте мне.

                                 

                                • Свидание 1 июня 2016 г.
                                • Теги Пожилые люди, Пожилые люди и мобильные телефоны, Технологии обучения пожилых людей
                                Стандарт

                                Когда вы слышите термин «мобильное устройство», что вам приходит на ум? Это машина или что-то, что вы можете взять с собой, что как-то поможет вам?

                                В данном случае мобильными устройствами являются i Phones, i Pads, планшеты, android, трекеры и ноутбуки.

                                Пожилые люди используют свои телефоны очень традиционными и нетрадиционными способами. Обучая пожилых людей, как пользоваться своим доктором медицины, многие открыто признались, что пользуются своими телефонами только как обычным домашним или стационарным телефоном. Тем не менее, некоторые из крупных операторов мобильной связи ведут переговоры об удалении всей опции стационарной связи. Это делает еще более важным, чтобы пожилые люди изучали нетрадиционные способы использования своих MD.

                                Вот 5 шагов, которые помогут вам использовать мобильное устройство:

                                1. Найдите магазин приложений.

                                Магазин приложений — это веб-сайт или ЗНАЧОК, на котором вы можете искать и находить игры любого типа, программное обеспечение (например, Microsoft Office или Google Docs), инструменты для здоровья, фитнес, упражнения для умственной тренировки или все, что вы можете придумать. Для пользователя Apple ваша AS — это магазин приложений.

                                Для пользователей Android вашей AS является Google Play.

                                2. Загрузите приложение или 2.

                                Загрузка (GET-INSTALL) APP из вашего AS будет автоматически сохранена на экране вашего MD для быстрого и легкого доступа.

                                3. Используйте ПРИЛОЖЕНИЯ.

                                Нажимать на ЗНАЧОК ПРИЛОЖЕНИЯ один или два раза в неделю — очень хорошая идея. Использование ваших приложений для увеличения умственной нагрузки для вашего мозга в пожилом возрасте, это психически здорово. Некоторые приложения позволяют вам общаться со своими сверстниками, играя в такие игры, как Letter Rush. Эти типы приложений помогают гарантировать, что вы «занимаетесь социальными сетями», как упоминается в Министерстве высоких технологий; Mastering Your Mobile Devices доступно на http://www.amazon.com

                                4. Снимайте видео

                                Пожилые люди могут увидеть много захватывающих и забавных вещей, которые другие хотели бы увидеть. В следующий раз, когда что-то случится, ДОСТАВЬТЕ ТЕЛЕФОН. Коснитесь значка камеры. Переключите его на значок кинокамеры. Нажмите красную кнопку записи и запечатлейте этот удивительный момент.

                                5. Делитесь видео

                                Теперь, когда вы использовали свой MD, чтобы запечатлеть опыт в режиме реального времени, ПОДЕЛИТЕСЬ ЕГО. ЕСЛИ ваше видео не длиннее 10 секунд, электронное письмо (Перейдите к значку ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА — откройте значок ЭЛЕКТРОННОЙ ПОЧТЫ — укажите, кому будет отправлено электронное письмо — прикрепите ваше видео в качестве вложения — НАЖМИТЕ «Отправить»), оно будет отправлено тому, кто, по вашему мнению, получит удовольствие от использования вашей видеосъемки. навык. Вы также можете поделиться своим видео, отправив его в текстовом сообщении или загрузив на Facebook. Теперь, если вы действительно смелы, вы можете поделиться этим на YouTube.

                                Пожилые люди, использующие свои мобильные устройства, иногда пугают, расстраивают и сбивают с толку. Но, и я имею в виду, но. Когда ты делаешь это медленно. Выполняя одно использование за раз, прежде чем вы это узнаете, вы будете делиться, скачивать, загружать и создавать видео. Я слышу, чтобы помочь вам учиться и получать удовольствие от ваших MD.

                                Свяжитесь с Denguhlanga Julia Kapilango: 313-265-0529 или [email protected] . Подпишитесь на Twitter @sr_techs

                                 

                                • Свидание 18 мая 2016 г.
                                • Теги Пожилые люди, Пожилые люди и мобильные телефоны, Технологии обучения пожилых людей
                                Стандарт

                                1. Выберите MD, исходя из возможности видеть, что вы делаете.

                                Я все время вижу, как пожилые люди делают большие попытки использовать мобильные устройства, на которых они почти ничего не видят. В конце концов это приводит к разочарованию. Это всегда имеет тенденцию препятствовать пожилым гражданам использовать свои мобильные устройства. Пожилые люди, как правило, только звонят по телефону. Выберите правильное мобильное устройство. Пожалуйста, не позволяйте стоимости остановить вас. Есть много способов приобрести мобильные устройства, которым может быть от года до трех лет. Эти мобильные устройства, которые вы предоставляете вам лучший пользовательский опыт.

                                2. Регулярно посещайте курсы по изучению медицины.

                                Я слышу, как пожилые люди рассказывают истории о том, как они получили новые мобильные устройства. Они открыто признаются друг другу, что имеют малейшее представление о том, что делать. Некоторым помогают их дети и внуки. Однако терпение и доступность в конечном итоге уходят далеко. ЭТО важно, что вы идете куда-нибудь, чтобы учиться. Найдите поместную церковь, в которой есть высшее технологическое служение. Пожилые люди должны продолжать быть социально активными с точки зрения технологий.

                                3. Практика 

                                Нет смысла изучать что-то новое на своем мобильном устройстве без намерения его использовать. Многие из моих учеников применяют на практике то, чему научились. Некоторые начали маркетинг в социальных сетях. Другие связались со своей семьей и друзьями через свои мобильные устройства. У меня есть ученица, которая использует свое мобильное устройство, чтобы заказать изысканные блюда у местного шеф-повара. Шеф-повар использует приложение для социальных сетей, чтобы размещать блюда дня и недели на своей странице. Она может видеть свой выбор в меню и есть здоровую пищу.

                                4. Группы сверстников

                                Наши студенты старших технических курсов очень открыты для помощи друг другу. Это происходит не только через их мобильные устройства. Это происходит и в их повседневной жизни. Находить время для общения и общения с пожилыми гражданами — это здорово, что улучшает их собственную жизнь. Исследования показывают, что чем больше вы общаетесь, используя технологии и физически активны, тем дольше вы проживете.

                                Никогда не говорите, что вы слишком заняты, чтобы изучать эту новую технологию! Потратьте время на активную мобильную работу с вашими устройствами. Наши мудрые студенты старших курсов министерства технологий всегда говорят: «Если вы не используете это. Вы его потеряете». В наше время нет смысла иметь мобильное устройство и не использовать его на полную мощность.

                                Свяжитесь с Denguhlanga Julia Kapilango: 313-265-0529 или [email protected] . Подпишитесь на Twitter @IAMSrTechz.

                                 

                                 

                                • Свидание 10 мая 2016 г.
                                • Теги Технология обучения пожилых людей

                                цифровое повествование – Шейлинн Фарнсворт

                                sfarnsworth

                                Этот пост в блоге является частью Глобального поиска образования CM Rubin World, который каждый месяц задает вопрос ведущим педагогам для размышлений и обмена. Вопрос этого месяца: «Руководство Top Global Teacher Blogger о том, что нового в технологиях. Какие инструменты edtech значительно поддержали/улучшили обучение в вашем классе за последние несколько лет?»

                                Камера часто является самым мощным приложением на любом устройстве для записи, редактирования и обмена знаниями, а нынешний ландшафт цифрового повествования предоставляет пользователям инновационные способы обмена. В поколении селфи и историй в Snapchat неудивительно, что мобилография проникла в классную комнату. Изображения позволяют учащимся фиксировать свое обучение и делиться своими историями со своего телефона. Телефонные приложения добавляют творческий элемент к этим изображениям с помощью редактирования фотографий, типографики, создания GIF, одновременно делясь ими по одному изображению за раз или объединяя их в несколько изображений.

                                Благодаря множеству доступных опций я предлагаю вам мои любимые БЕСПЛАТНЫЕ (в основном) приложения, которые я использую как лично, так и в классе. Большинство приложений доступны как для устройств Android, так и для iOS.

                                Приложения для редактирования фотографий

                                • Snapseed — фоторедактор, созданный Google. Snapseed, доступный как для устройств iOS, так и для устройств Android, является моим любимым и наиболее полным фоторедактором. Настраивайте изображения, применяйте фильтры, изгибайте и вращайте, чтобы изменить перспективу; возможности безграничны.
                                • Prisma — позволяет пользователям превращать свои фотографии в произведения искусства на основе стилей известных художников, орнаментов и узоров. Доступно как для устройств iOS, так и для Android. Prisma бесплатна и часто используется в классе для редактирования изображений, чтобы лица учащихся были неузнаваемы.
                                • Pixlr — приложение для редактирования фотографий, которое позволяет пользователям использовать комбинацию эффектов, фильтров и наложений. Доступный как для iOS, так и для Android, Pixlr бесплатен, а также доступен в виде приложения для браузера Chrome!
                                • Lively — приложение Lively, доступное только для устройств iOS, идеально подходит для создания картинок, видео или различных кадров из Live Photos от Apple. Я использовал это приложение несколько раз, чтобы сделать идеальный кадр из живой фотографии, когда мои глаза были открыты и не закрыты!

                                Типографика

                                • Word Swag — одно из немногих приложений, за которые я плачу. Это быстрый способ добавить текст к изображениям за считанные секунды. Он доступен как для iOS, так и для Android. Создавайте уникальные текстовые макеты, которые превращают любое изображение в публикацию, которой можно поделиться!
                                • Adobe Spark Post — позволяет пользователям создавать красиво оформленную графику. Шаблоны, цветовые палитры, размеры позволяют пользователям настраивать изображения. Это бесплатное приложение является одним из моих любимых и позволяет вам поделиться своим сообщением с соответствующей эстетикой. Доступно для iOS и скоро будет доступно для пользователей Android!

                                Новое: Google недавно выпустил 3 новых приложения для работы с изображениями для телефонов: Storyboard, Selfissimo, Scrubbies в рамках « appsexperiments : удобные и полезные возможности мобильной фотографии, основанные на экспериментальных технологиях». Недавно я добавил эти приложения на свой телефон и с нетерпением жду возможности изучить их возможности. Storyboard доступен только на устройствах Android, Selfissimo доступен как на iOS, так и на Android, а Scrubbies доступен только на iOS.

                                gifs

                                • Motion Stills — изначально приложение для iOS, Motion Stills стабилизирует живое фото Apple и позволяет просматривать его как зацикленный gif или видео. Теперь Motion Stills доступен для Android и включает в себя механизм захвата, который мгновенно преобразует его в просматриваемые клипы (так называемые живые фотографии).
                                • Цикл или отскок — оживляет ваши Apple Live Photos. Оживите точный момент на фотографии и, просто проведя пальцем вверх, превратите снимок в короткий клип, идеально подходящий для анимации и GIF-файлов. Соединитесь с Giphy (см. ниже) и создавайте и делитесь своими собственными GIF-файлами.
                                • Giphy — Giphy не только имеет обширную библиотеку гифок, но и позволяет создавать свои собственные. Кроме того, это веб-интерфейс, что означает, что приложение не требуется, но доступно на любом смартфоне. Фантастическая особенность этой опции заключается в том, что в сочетании с Live Photos in loop / bounce или Motion Stills вы можете создавать свои собственные GIF, сохранять и делиться ими со своего телефона. (Изображение для этого поста было сделано таким образом.) Добавьте текст, эффекты и наклейки, чтобы настроить свой gif!
                                • Boomerang — созданный Instagram, захватывает короткие клипы и автоматически зацикливает их. Занимая 10 секунд видео, творчество Boomerang зацикливается туда-сюда. Поделитесь в Instagram или сохраните в фотопленке. Boomerang доступен как для iOS, так и для Android.

                                Обмен   (Существует множество способов обмена изображениями и цифровыми историями. Вот некоторые из них, которые следует учитывать, и многие из них имеют встроенные фильтры и параметры редактирования для творческого обмена.)

                                • Истории Instagram – поделиться изображения и видео с вашими подписчиками или хэштегом. Истории исчезают из ленты вашего профиля через 24 часа, если вы не добавите их в качестве основных моментов. Возьмите или загрузите изображение, чтобы добавить его в свою историю. Пользователи могут редактировать, добавлять текст, создавать покадровую анимацию и т. д., а также добавлять их в свои истории, чтобы делиться ими в течение дня.
                                • Facebook Stories — короткие, созданные пользователями фото и видео, которые можно просматривать определенное количество раз и которые исчезают через 24 часа. Вы можете захватывать и делиться прямо из приложения. Истории Facebook также имеют параметры редактирования, наложения и фильтры. Пользователи также могут поделиться своей историей с основной лентой после завершения.
                                • Snapchat Stories — это набор снимков, воспроизводимых один за другим. Истории могут просматриваться кем угодно, они длятся 24 часа и исчезают. Есть возможность скачать Snapchat Stories, чтобы сохранить и поделиться небольшим видео. Snapchat был создателем Stories, а Instagram и Facebook быстро последовали его примеру. Загружайте свои собственные изображения или делайте снимки с помощью Snapchat и добавляйте текст, фильтры или создавайте собственные фильтры для своей школы или мероприятия. Групповые истории и истории Geo позволяют нескольким пользователям добавлять снимки!

                                Смартфон превратил миллионы пользователей в фотографов, каждый из которых имеет разный уровень знаний и художественный талант. Использовать изображения, чтобы рассказать свою историю или продемонстрировать понимание, можно не только с помощью изображений, но и с помощью красивых изображений с намерением, просто загрузив приложение. Я хотел бы услышать ваши любимые приложения для мобилографии или как вы используете их в своем классе!

                                #edchat, Android, камера, CM Rubin World, Сотрудничество, общение, цифровое повествование, edchat, Образование, Google, изображения, iOS, Медиаграмотность, мобильография, приложения для телефона, рассказывание историй, студенты, Учитель Adobe spark, Android, бумеранг, цифровая грамотность, цифровое повествование, редактор, edtech, образование, Facebook, фильтры, gif, giphy, Google, изображения, Instagram, iOS, живые фотографии, lively, мобильография, движущиеся кадры, телефон, телефонные приложения, pixlr , prisma, scrabbies, selfissimo, Snapchat, snapseed, раскадровка, типографика, словесная добыча Оставить комментарий

                                sfarnsworth

                                 

                                Эта запись в блоге является частью CM Rubin World Global Search for Education , в рамках которой ежемесячно задаются вопросы ведущим педагогам для размышлений и обмена. Вопрос этого месяца: «Как мы развиваем эмпатию в наших учениках? Какую роль педагоги играют в воспитании добрых и сострадательных учеников?»

                                 

                                Вскоре после Рождества в мой класс английского для первокурсников записался новый ученик. Он был тихим, говорил на ломаном английском и имел лицо человека вдвое старше себя. Бурим вместе со своей матерью и сестрой бежал из раздираемой войной Боснии в поисках лучшего места для жизни. Один без бомб, смерти и насилия; и он, к счастью для всех нас, оказался в маленьком городке Айова. Его одноклассники не имели ни малейшего представления о жизни, которую Бурим называл нормальной в течение последних пятнадцати лет. Они проснулись в мирных домах с едой на столе, прежде чем они уехали на своей новой машине, чтобы проехать 5 миль до школы. Как учитель, я изо всех сил пытался найти лучший способ наладить отношения в классе между беженцами и учениками со Среднего Запада. Я не хотел, чтобы они сочувствовали Буриму, переживая за то, что он стал свидетелем того, как его брата убили на его глазах, избегая пуль и бомб, защищая свою мать в юном возрасте; вместо этого я хотел, чтобы у студентов было сочувствие нашему новому однокласснику. Я хотел, чтобы они чувствовали себя С Буримом.

                                ____________________________________________________________

                                «Я хочу, чтобы ученики были не только лучшими в мире , но и лучшими ДЛЯ мира» (Эрин Олсон). В среднем человек проводит около 15% своей жизни в школе с классов K-12, это около 12 лет учителей, классных комнат, обучения и тестов. Но школа — это гораздо больше, чем содержание, обучение включает в себя развитие ребенка в целом, и, если учесть приведенную выше цитату, на учителей возложена тяжелая задача. Нам поручено не только обучать детей грамоте, математике и естественным наукам; но также и развитие навыков эмоционального интеллекта, необходимых для создания продуктивных взрослых и сострадательных граждан.

                                Будучи учителем грамоты, я воспитывал в классе сострадание к Буриму и другим людям посредством чтения и письма. Рассказывание историй позволяет учащимся социально конструировать чувства и эмоции, которые позволяют нам чувствовать ВМЕСТЕ с человеком (сочувствие), а не только к человеку (сочувствие). Эмпатия и рассказывание историй переносят нас в реальность другого человека, позволяют нам понять его точку зрения, а также распознать и передать эти эмоции. Существуют бесконечные списки книг для всех возрастов, которые педагоги могут использовать в классе для развития эмпатии (великолепная книга из «Здравого смысла» находится здесь). Технологии также предоставляют нам цифровую форму повествования через изображения и видео.

                                Медиаграмотность предоставила учащимся новые способы понимания эмоций и переживаний людей, сильно отличающихся от них самих. Этот век сверхсвязей, в котором мы живем, дает возможность развивать сочувствие не только к тем, кто нам близок, но и на глобальном уровне. Сочетание элементов визуального, аудио, дизайна, изображений и видео — это мощные способы для учащихся сопереживать другим. Это вызывает обсуждение и действие. Как педагоги, мы можем использовать средства массовой информации для воспитания ребенка в целом и воспитания сострадательных и чутких граждан мира!

                                 

                                5 Videos that Foster Empathy

                                 

                                 

                                (This one was created by former students of mine, moved by empathy, wanting to изменить ситуацию)

                                Наконец, 16 интерактивных изображений, которые показывают реалии детей. (Нажмите на фон каждой фотографии)

                                Воспитание эмпатии является частью работы педагога. Не существует теста для измерения прогресса или установленного учебного плана для определения того, чему учат. Вместо этого эмпатия развивается посредством моделирования, обсуждений, чтения, письма и творчества. И, как и большинство вещей, которые нельзя измерить с помощью стандартизированного теста, эмпатия важнее в жизни и напрямую влияет на общество, в котором мы живем!

                                Я люблю, когда люди делятся со мной дополнительными ресурсами! Вот еще видео для рассмотрения

                                #edchat, убеждения, CM Rubin World, Цифровая грамотность, edchat, Благодарность, Грамотность, Медиаграмотность, Мультиграмотность, мультимедиа, Навыки, рассказывание историй, Студент, Учитель #edchat, цифровое повествование, образование, эмоции, эмпатия, EQ, медиаграмотность, повествование, студенты, обучение, обучение эмпатии, видео 1 Комментарий

                                sfarnsworth

                                В течение последних нескольких месяцев я имел удовольствие преподавать курс цифрового сторителлинга. Основное внимание уделялось тому, как учащиеся могут использовать цифровые способы для передачи своего понимания концепций, тем и проблем. Недавно обучение было на инфографике. Мы живем в визуальном мире, цифровое общение составляет большую часть ежедневного чтения. Видео, изображения и инфографика являются обычным явлением и являются примерами цифровой грамотности при чтении и письме.

                                Цифровые способы общения лучше всего изучать в классе как поджанры. При рассмотрении инфографики и того, как лучше всего научить студентов потреблять и создавать ее, ниже приведены рекомендации, которые помогут вам в этом стремлении.

                                Во-первых, начните с урока-опросника, на котором учащиеся исследуют коллекцию инфографики, которая считается высококачественной. Мне нравятся те, которые перечислены в статье под названием «11 лучших инфографик 2015 года». Студенты найдут множество дизайнов, структурных примеров, а также области содержания. Учащимся предъявлено обвинение  Выявление общих черт, наименование компонентов хорошей инфографики и обоснование утверждений. (все они соответствуют Единым основным стандартам письма).

                                Во-вторых, определите менторский «текст» (в данном случае инфографику), на который учащиеся могут ссылаться при принятии решений по собственной инфографике. Помните, что в тексте наставника есть много точек доступа, которые могут использовать ученики. Это может быть созданный учителем или учеником, а также созданный экспертом. Он не должен согласовываться с содержанием, вместо этого основное внимание уделяется навыкам и компонентам, которые учащиеся используют и демонстрируют при разработке инфографики.

                                В-третьих, хорошие писатели/дизайнеры планируют, прежде чем приступить к созданию инфографики. Раскадровка или контрольный список, содержащий компоненты инфографики, обеспечит структуру для начинающих дизайнеров. Посмотрите шаблоны Google для примеров или, что еще лучше, попросите учащихся создать свои собственные. Чем полнее их планирование, тем успешнее будет их создание инфографики.

                                Наконец, предоставьте контрольный список, содержащий 7 элементов выше, с пояснениями, примерами или другими действиями, которые позволят учащимся углубиться в различные области, создавая свои собственные знания об этом поджанре.

                                1. Тема: При выборе темы необходимо указать вариант Student-Choice. Помните, мы работаем над навыками и компонентами звездной инфографики, которые они могут использовать с этого дня, а не над контентом! Тема должна быть актуальной, привлекательной, а также такой, которая в настоящее время не является инфографикой, которую они могут копировать в Google.
                                2. Аудитория и цель: определение аудитории и цели коммуникации обеспечивает линзу, через которую можно смотреть при обмене информацией. Как и во всех видах общения, навыки, которые учащиеся используют для демонстрации своего понимания с помощью инфографики, можно перенести в несколько цифровых и текстовых режимов.
                                3. Структура: Инфографика имеет структуру, подобную той, которую читатель может заметить в документальной литературе. Описание, сравнение и противопоставление, порядок, последовательность, хронология, причина и следствие — вот некоторые из способов, которые учащиеся могут учитывать при структурировании своей информации и потока.
                                4. Зацепка: Хорошая инфографика имеет броский заголовок или изображение, которые «цепляют» зрителя с первого взгляда. Студенты должны определить это не только в примерах наставника, но и как навык, который можно перенести на все формы общения. Необходимо время, чтобы попрактиковаться в этом навыке!
                                5. Баланс: в инфографике соблюдается баланс между текстом, изображениями, значками и пустым пространством. Краткая коммуникация с помощью слов, фраз и изображений демонстрирует владение информацией, а также элементами дизайна.
                                6. Дизайн: Есть много разных направлений инфографики при анализе элементов дизайна; начните с основ и стройте оттуда. Обратите внимание на цветовые схемы, шрифты и изображения. Как они продвигают или отвлекают от сообщения? Сайт Coolors для тех из нас, кто ничего не смыслит в выборе цвета, предлагает возможные варианты для пользователей. При выборе шрифтов Школа дизайна Canva предоставляет примеры и аргументы.
                                7. Источники: Наконец, когда учащиеся ссылаются на свои источники, они не только повышают доверие к себе при предоставлении данных, поддержки и т. д., но и демонстрируют хорошее цифровое гражданство, избегая плагиата и признавая авторские права.

                                Моя любовь к инфографике пробудилась благодаря преподаванию этого курса. Это позволяет мне сочетать мои увлечения грамотностью и технологиями. Обучение цифровой грамотности и способы, связанные с ним как с поджанром, предоставляют преподавателям и учащимся доступ к чтению, просмотру и созданию собственных! Вот несколько сайтов для поддержки создания инфографики:

                                Google Draw

                                Canva

                                Piktochart

                                Easelly 

                                , Грамотность, Мультиграмотность, чтение, Навыки, рассказывание историй, Стратегии, Студент, студенты, Учитель, преподавание, Технология #iaedchat, Canva, Коммуникация, Цифровая грамотность, Цифровое повествование, Образование, Google Draw, Инфографика, Мультиграмотность, мультимодальность, Пикточарт, чтение, Студент, Студенты, Учитель, учителя, Письмо Оставить комментарий

                                sfarnsworth

                                Какой сигнал посылается нашим ученикам, если мы публикуем только Pretty?

                                — 𝚂𝚑𝚊𝚎𝚕𝚢𝚗𝚗 𝙵𝚊𝚛𝚗𝚜𝚠𝚘𝚛𝚝𝚑 (@shfarnsworth) 16 ноября 2014

                                В среднем я хожу по коридорам пяти школ в неделю. Будь то поддержка административной группы, работающей над планом улучшения школы, или помощь учителю в организации новых блоггеров в ее 9-м классе английского языка; как только я прохожу через двери, я намеренно останавливаюсь и замечаю свое окружение. Приветствия учащихся и взрослых, настенные рисунки, выбор цвета в комнатах, чистота в местах общего пользования и множество других сенсорных сигналов бессознательно наводняют мое подсознание, создавая моментальный снимок климата, культуры и ценностей, разделяемых взрослыми и студенты в здании.

                                Трофеи и баннеры чемпионата штата, украшающие вход, символизируют гордость за спорт, традиции и достижения. Вдохновляющие цитаты, плакаты с количеством персонажей и календарь дней рождения способствуют сообществу и отношениям. В то время как во многих школах демонстрируется комбинация ценностей, единственное, что я почти никогда не вижу, — это мышление учащихся, или, точнее, процесс .

                                Готовые изделия обычно украшают стены классных комнат и холлов здания. Как правило, унифицированы по размеру и цвету. Стихи перенесены на белую бумагу, набраны черной тушью и свисают с потолка на равной по длине леске. Уникальная художественная работа, прикрепленная к черной бумаге и систематически выложенная на липкой ленте с расстоянием между ними 1 дюйм. Как преподаватели, мы знаем, что демонстрация работы учащихся важна, но как люди мы также хотим, чтобы она хорошо выглядела. О чем мы не задумываемся, так это о сигналах, которые она посылает нашим ученикам = работа должна быть красивой, чтобы заслужить место на стене. Я тоже виноват в этом. Я помню, как мой студент-репетитор переписал цитаты из Шекспира, которые нравились ученикам, на коричневой бумаге, чтобы они выглядели лучше, все одним почерком и на одной бумаге. Чего я не учел, так это сообщения, которое оно отправило ученикам на следующий день, когда они вошли в класс и увидели, что «их» цитату заменили на «более красивую».

                                Обучение беспорядочно , и когда я размышляю, я понимаю, что упустил смысл всего задания. Дело не в акростихе, выложенном на зеленой бумаге и равномерно развешанном по всей стене, что было поводом для празднования; это был процесс ! Сбор идей и изображений, организация мыслей, кропотливое редактирование и пересмотр как в одиночку, так и с партнером, чтобы выбрать идеальное слово. Подсчет слогов на пальцах, обращение к словарям рифм и друг другу в ритмических целях. Последнее стихотворение не было целью; вместо этого научиться думать и писать как поэт было ; но нигде в классе вы не видели усвоенных и усвоенных уроков.

                                Демонстрация студенческих работ важна, но еще важнее подчеркивать студенческие мысли. Включите мышление, связанное с созданием конечного продукта. Покажите ошибки, сотрудничество, празднование и творчество! Пусть ученики станут свидетелями ценности, которую вы придаете их процессу, а не ученика с лучшим почерком или самым ярким блеском. Покажите всем, кто входит в двери вашей школы, будь то физически или виртуально, что мы празднуем обучение!

                                AIW, Сотрудничество, Образование, Элементарный, Грамотность, математика, Студент, Учитель, Убеждения учителей, Технология, Мастерская письма AIW, убеждения, сотрудничество, общение, цифровое повествование, обучение, процесс, чтение, студент, учитель, технология, мышление, письмо 1 Комментарий

                                sfarnsworth

                                AIW: использование технологий в рамках AIW Framework               Сообщение №2

                                Последующий пост в связи с продвижением AIW …

                                Критерии 1: Конструирование знаний

                                Акцент на когнитивной сложности, обучение для понимания, что, в свою очередь, повышает интеллектуальную строгость учащихся. Избегая простого повторения предоставленной информации, Конструирование знаний при разработке задач и обучении заставляет учащихся организовывать, интерпретировать, анализировать, синтезировать или оценивать информацию, касающуюся концепций, тем, теорий или проблем.

                                Включение технологий в образовательный дизайн предоставляет возможности, доступ к инструментам и множеству ресурсов, помогающих учащимся в собственном конструировании знаний. Традиционное запоминание информации, повторение определений и правил или применение ранее изученных процедур не связаны с информацией, которая необходима для преобразования и значимой демонстрации обучения. Ниже перечислены краткие примеры, за которыми следуют инструменты.

                                Организовать – пример – определение структуры текста: При выявлении структуры, связанной с тем или иным жанром в литературе, учащиеся определяют качества, характерные для каждого жанра, и обосновывают выбор автором жанра по отношению к предполагаемому смыслу. Как только достигнуто соглашение об идентификаторах для конкретных жанров, учащиеся строят свои собственные знания, организуя фрагменты текстов из множества областей.  Инструменты: Google документ/рисунок, планшет, pinterest, instagram, хэштеги и твиттер, таблицы, bubbl.us, exploreatree 

                                Анализ – пример – исследовательские навыки: Важным набором навыков, которыми должны овладеть учащиеся, является навигация в море ресурсов, доступных в Интернете, и умение различать их для определения надежных и релевантных ресурсов. После моделирования и некоторой практики путем постепенного освобождения от ответственности учащиеся находят источники и тщательно их анализируют. Используя инструменты аннотации, учащиеся могут определить, проанализировать, выразить и обосновать то, что делает источник надежным и актуальным. В качестве бонуса, моя коллекция ресурсов MLA для помощи в подобных мероприятиях – ЗДЕСЬ    Инструменты: Google Docs, Jing, Diigo, Awesome Screenshot, Sharedcopy

                                Интерпретация — Пример — Точка зрения: Определение точки зрения из текста, изображения, видеоклипа и т. д. способствует пониманию задуманного автором сообщение. Рассмотрим тему войны. Создавая знания из данного источника, внимательные читатели используют различные методы, чтобы помочь понять смысл сообщения. Определение точки зрения, времени, места и т. д. рисует более ясную картину в сознании учащихся. С какой военной стороны находится эта точка обзора? Это сейчас или отражение годы спустя? Сообщение от солдата, генерала, родителя, брата или сестры? Учащийся формирует собственное знание концепции или темы, создавая сообщение с точки зрения, отличной от данной части .  Технологии предоставляют учащимся множество различных возможностей для трансформации и демонстрации своего понимания. Видео, мультфильмы, комиксы, плакаты, подкасты — все это варианты, которые учащиеся могут использовать во время создания. Инструменты: Мультимедийная продукция – Youtube, Podcast, fodey.com (создатель газет), Smore, Stripgenerator, iBook Author, Bookemon

                                Оценка/обработка – презентация Google, скринкаст, prezi, powtoon, колода хайку, публикация слайдов, ведение блога

                                AIW, Сотрудничество, Образование, Грамотность, Студент, Учитель, Технология AIW, приложения, Аутентичная интеллектуальная работа, CoK, Сотрудничество, Коммуникация, Подключенный педагог, Конструирование знаний, Конструктивизм, Цифровое повествование, Образование, Вовлечение, Исследование, Грамотность, Студент, Учитель, технологии, Письмо Оставить комментарий


                                Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial 4. 0 International License.

                                Следуйте за мной в Твиттере

                                Мои твиты

                                Instagram: Technoliteracies

                                Изображения из Instagram не найдены.

                                Подписаться на блог по электронной почте

                                Введите адрес электронной почты, чтобы подписаться на этот блог и получать уведомления о новых сообщениях по электронной почте.

                                Адрес электронной почты

                                Присоединиться к 16 135 другим подписчикам

                                Какой мобильный фоторедактор вам подходит?

                                Главная Обзоры Gear Lightroom

                                13 комментариев

                                Я думаю, единственное, что изменило фотографию больше, чем изобретение цифровых камер, — это постоянно растущее участие фотографии и социальных сетей. Такие сайты, как Instagram, Twitter и Tumblr, являются идеальными платформами для обмена не только вашей работой, но и закулисными изображениями и другим контентом, который привлекает интерес к вашему бренду. Сегодня проще, чем когда-либо, воспользоваться этим. Мобильные приложения изменили не только форму отрасли, но и то, как фотографы могут работать. Такие приложения, как Snapseed, VSCO и Lightroom Mobile, позволили начинающим художникам или даже тем, кто спешит, относительно легко создавать невероятный контент.

                                Почти у каждого крупного производителя камер есть хотя бы одна модель со встроенными функциями Wi-Fi. Это позволяет пользователям отправлять изображения прямо на свои телефоны, даже не касаясь компьютера. Оттуда доступны бесчисленные варианты завершения изображения. Мой фаворит и, на мой взгляд, самый функциональный — это Snapseed (iOS | Android). Еще несколько недель назад мои повседневные изображения с моей Sony a6000 по-прежнему импортировались в Capture One, редактировались, экспортировались и отправлялись мне по электронной почте, чтобы получить их в Instagram. Для изображений, которые не попадали в мое портфолио, мне казалось, что это требует больших усилий. Продав свой Sony a7II, я забыл о мобильных платформах для редактирования, потому что мой Nikon не использует преимущества передачи по Wi-Fi без отдельного ключа. Недавно, в свободное время, снимая несколько продуктов, я обнаружил настоящую мощь мобильных приложений для редактирования. Я использовал в основном Snapseed для этих изображений, так как в нем есть некоторые инструменты, которые оказались полезными для этой конкретной съемки.

                                Это редактирование состояло из некоторых корректировок тона, увеличения четкости, лечения пыли и повышения резкости. В программе есть даже базовая функция осветления и затемнения, которая отлично подходит для добавления локального контраста к бутылке и стеклу по мере необходимости. В то время как Snapseed теперь поддерживает необработанные файлы на Android, приложение Sony не поддерживает передачу необработанных файлов через Wi-Fi. Snapseed оказался на удивление способным, даже со сжатым JPEG. Однако такие приложения, как Snapseed, могут оказаться менее полезными при работе с экспозициями, которые смещены на несколько ступеней в любом направлении. Хотя он может творить чудеса за несколько остановок, он не справляется с восстановлением теней или светлых участков при неудачной экспозиции. Это не удивительно и даже не сильно беспокоит, но об этом следует знать.

                                Я сделал два других изображения в стиле продукта, которые я также прогнал через Snapseed с довольно похожими результатами. Я обнаружил, что Snapseed хорошо работает практически со всеми жанрами фотографии. При работе с пейзажами следует помнить об ограниченных возможностях фиксации высококонтрастных сцен. Даже фильтр искусственного HDR дает более приятные результаты, чем такие программы, как Photomatix и Lightroom со встроенным HDR-процессором, который был недавно добавлен (по моему опыту).

                                Давайте посмотрим на VSCO (iOS | Android). Это приложение, возможно, произвело революцию в мобильном редактировании. Хотя возможности VSCO более ограничены, чем Snapseed, он по-прежнему позволяет настраивать тон, зернистость и цвет. VSCO также делает пресеты для настольной версии Lightroom, и, насколько я могу судить, приложение достигает примерно такого же эффекта, хотя и с большей возней. Интерфейс прост; вы начинаете с выбора фильтра (или без фильтра), а затем переходите к набору ползунков, очень похожему на Instagram, в нижней части кадра. В VSCO ползунки имеют настройки от -6 до +6, хотя это может заставить вас чувствовать, что у вас меньше контроля, тогда вам напоминают о простоте приложения.

                                VSCO также включает собственную платформу социальных сетей. В то время как Instagram, вероятно, является окончательным выходом изображения для большинства мобильных фотографов, VSCO может стать еще одним местом для демонстрации работы. Однако он не кажется таким изысканным, как Instagram. Страница VSCO в социальных сетях больше похожа на веб-сайт, на котором можно просматривать изображения, но нельзя комментировать или «лайкать» изображение. Таким образом, VSCO может стать более профессиональным способом организации вашей работы.

                                И последнее, но не менее важное: Lightroom Mobile (iOS | Android). С того момента, как я впервые скачал и использовал его, у меня были к нему отношения любви/ненависти. Синхронизация вашей настольной библиотеки с вашей мобильной библиотекой — отличная функция, которая держит вашу работу с вами для демонстрации или вдохновения. К сожалению, функция синхронизации не всегда была самой гладкой, а иногда просто не работала. Кроме того, небольшая проблема заключается в том, что кнопки кажутся довольно чувствительными в отношении того, где вы можете нажимать их, чтобы получить желаемый эффект, однако это моя единственная другая жалоба. Кроме того, мобильная версия Lightroom отточена и проста в использовании. Когда вы открываете фотографию, внизу появляется небольшой интерфейс, в котором отображаются функции редактирования. Вверху можно просмотреть данные EXIF ​​с фотографии, даже если фотография была отправлена ​​на устройство по Wi-Fi. Это, безусловно, приятный штрих, который не обязательно демонстрируется с другими мобильными редакторами.

                                Еще одна функция Lightroom Mobile — корректировка кривых. Я всегда предпочитал работать с кривыми из-за моего рабочего процесса, состоящего из Capture One и Photoshop. Панель «Основные» в Lightroom Mobile такая же, как и в настольной версии. У вас есть те же настройки (черный и белый, баланс белого, температура, оттенок, экспозиция, контрастность, подсветка, тень, белый, черный, четкость, яркость и насыщенность) в том же порядке. Если вы привыкли к Lightroom на своем настольном компьютере или ноутбуке, переход на мобильную версию будет довольно интуитивно понятным и плавным.

                                Adobe была достаточно любезна, чтобы перенести одну из самых больших функций Lightroom на мобильные устройства: каталогизацию. Это самое большое преимущество Lightroom Mobile перед Snapseed и VSCO. В Snapseed нет абсолютно ничего. Хотя он создает папку «Snapseed» в вашем приложении для фотографий, в нем нет ничего встроенного и, конечно же, ничего, что помогло бы хранить все вместе по дате или работе. VSCO, по крайней мере, предлагает некоторую каталогизацию в приложении; однако в нем по-прежнему отсутствует какой-либо реальный метод организации, который я считаю полезным. Он просто объединяет все в папку под названием «Библиотека». Его единственная форма организации заключается в том, что фотографии упорядочены по времени их импорта. Мобильный Lightroom дает отличные результаты, но кажется, что он нуждается в серьезном пересмотре, прежде чем станет достаточно оптимизированным. В некоторых ситуациях он кажется немного медленнее и неуклюже из-за чувствительности кнопок и медленной загрузки в каталоге/редакторе.

                                Для начинающих фотографов с ограниченным финансированием Snapseed предлагает больше возможностей, чем любая другая программа. Хотя организация в приложении полностью отсутствует, я считаю, что приложение обеспечивает более приятный опыт. Для меня отлично подходит папка с фотографиями под названием «Snapseed». Для других они могут захотеть работать с Lightroom Mobile для прекрасной системы организации, датирования и каталогизации, которую они создали. Если немного поработать, я думаю, что синхронизация по Wi-Fi может стать выдающейся функцией. На данный момент он слишком ненадежен для меня, чтобы использовать его часто. Честно говоря, VSCO слишком похож на встроенный редактор Lightroom и Instagram, чтобы я мог его регулярно использовать. Он не предлагает ничего, что отличало бы его от других. Snapseed кажется наиболее функциональным и собранным. Различные функции хорошо разделены и помечены, так что вам никогда не придется гадать, где что находится. Хотя некоторые функции и фильтры банальны и непривлекательны с эстетической точки зрения, все в верхней части селектора инструментов хорошо продумано и полезно. Естественно, многое из этого субъективно. Как и производители камер, все они производят одинаковое изображение. Разница в ощущениях и пользовательском интерфейсе. Независимо от того, с каким приложением вы решите работать, вы сможете создать блестящую работу, которая может даже оказаться в вашем портфолио, когда вы начнете. Фотография все больше и больше связывается с нашим мобильным, виртуальным миром, нравится нам это или нет.

                                Как вы используете мобильные редакторы? Есть ли у них какие-либо другие приложения, которые вы предпочитаете?

                                Темы:

                                Apps

                                Gear

                                Lightroom

                                Mobile

                                Мнение

                                после производства

                                Обзоры

                                Социальные медиа

                                Программное обеспечение

                                Spencer Sookaugh — это жизнь, и изображенный фотограф, обнаруженный в колумб. а также сотрудник Midwest Photo Exchange. Он твердо верит в полиграфию, пленочную и цифровую съемку, а также в силу фотографии. Он также снимает пейзажи в свободное время.

                                Отчет о рекламе — Премиум-размещение

                                1 Ярмарка округа Марин Стандартная страница 1 Отдел 30 — Подразделение фотографии для юниоров Класс 1 для юниоров — черно-белая фотография (5–8 лет) 1-е место Кэти Шутцендорф, Сан-Франциско, Калифорния Академия ворот, 2-е место Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H 3-й Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H Класс 2 — Цветная печать (5-8 лет) 1-й Аедан Бардул Сан-Рафаэль, Калифорния Сен-Рафаэль 1-й Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H 1-й Кэти Шутцендорф Сан-Франциско, CA Gate Academy 1-е место Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H 2-е место Аедан Бардул Сан-Рафаэль, Калифорния Сен-Рафаэль 2-е место Коул Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальная школа 2-е место Коул Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальная школа 2-е место Изабелла Меллор Новато, Калифорния Леди Лоретто 2-е место Грейс Муресан, Сан-Рафаэль, Калифорния, Академия GATE, 2-й Кэмпбелл-Стоутон, Сан-Ансельмо, Калифорния, Уэйд Томас, 3-й, Кейт Блумлинг, Корте-Мадера, Калифорния, MCDS, 3-й, Коул Гибсон, Сан-Рафаэль, Калифорния, Начальная школа Вальесито, 3-й, Джони Рэй Муресан, Сан-Рафаэль, Калифорния, Академия GATE, 3-й, Джордан Шомер Ро. сс, 3-й класс школы Калифорния Росс Джордан Шомер Росс, 3 класс школы Калифорния Росс — черно-белый (9-12 лет) 1-й Майя Тиснер Фэйрфакс, Калифорния Марин Домашняя школа 1-й Калеб Ховард Олбани, Калифорния Олбани Средний 2-й Морган Кархарт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 2-й Габриэль Фаутс Новато, Калифорния Марин Уолдорф 2-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 3-й Кристина Мердик Сан-Рафаэль , CA Mark Day School 3rd Leo Schutzendorf San Francisco, CA Gate Academy Class 4 — Color Print (9-12 лет) 1st Maya Tisner Fairfax, CA Marin Homeschool 1st Maya Tisner Fairfax, CA Marin Homeschool 1st Bradain Bello Santa Rosa, CA Sequoia Elementary 1-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Начальная школа Вальесито 1-й Сьерра-Грин Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Калеб Ховард Олбани, Калифорния Олбани Средний 1-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 1-й Джори Курш Кентфилд, Калифорния Школа Марин Горизонт 1-й Джори Курш Кентфилд, Калифорния Marin Horizon School 1st Кэтрин Лизаррага Сан-Ансельмо, Калифорния Уайтхилл Миддл

                                2 Стандартная ярмарка округа Марин Страница 2 Класс 4 — цветная печать (9–12 лет) — 1-й Мэтью Масиас Новато, Калифорния, Синалоа Средний 1-й Мэтью Масиас Новато, Калифорния, Синалоа Средний 1-й Лахлан Макларен Тибурон, Калифорния, Элементарная школа Бель-Эйр, 1-й Сара Мардесич, Сан Рафаэль, Калифорния Марин Уолдорф 1-й Ула МакПретл Новато, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Мэгги Нельсон Сан-Ансельмо, Калифорния Уайт Хилл Средний 1-й Изабель Соннет Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 1-й Аннабель Теперсон Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 1-й Аннабель Теперсон Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 1-й Ванесса Вольф Новато, Калифорния Марин Монтессори 1-й Сьерра-Грин Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Сет Саммерс Гринбрей, Калифорния Начальная школа Басич 2-й Бенджамин Ходжсон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Лорен Бэкон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Кристина Чейз Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Александра Коу Росс, Калифорния Домашняя школа 2-й Александра Коу Росс, Калифорния Домашняя школа 2-й Рейн Конти Корте Мадера, Калифорния Холл Средний 2 Рейн Конти Корте Мадера, Калифорния Холл Средний 2 Рейн Конти Корте Мадера, Калифорния Холл Миддл 2-й Габриэль Футс Новато, Калифорния Марин Уолдорф 2-й Габриэль Футс Новато, Калифорния Марин Уолдорф 2-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Элементарная школа 2-й Елена Гнатек Фэрфакс, Калифорния Путь Чартер 2-й София Каклеас Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 2-й Джори Курш Кентфилд, Калифорния Школа Marin Horizon 2 место Джордан Лойенбергер Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 2 место Сара Мардесич Сан Рафаэль, Калифорния Марин Уолдорф 2 место Кристина Мердик Сан Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 2 место Лорен Петтиджон Сан Рафаэль, Калифорния Миллер Крик Средний 2 место Лорен Петтиджон Сан Рафаэль, Калифорния Миллер Крик Миддл 2-й София Санти Сан-Рафаэль, Калифорния Ст. Изабелла 2-й София Санти Сан-Рафаэль, Калифорния Ст. Изабелла 2-й София Санти Сан-Рафаэль, Калифорния Ст. Изабелла 2-й Лео Шутцендорф Сан-Франциско, Калифорния Академия Ворот 2-й Жасмин Шитье Новато, CA Novato Charter 2-й Аннабель Теперсон Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 2-й Сарра Уилкс Новато, Калифорния Брандейс Гилель День 2 Сарра Уилкс Новато, Калифорния Брандейс Гилель День 2 Сарра Уилкс Новато, Калифорния Брандейс Хилл Эль День 2-й Ванесса Вольф Новато, Калифорния Марин Монтессори 2-й Эйлид Райт Фэрфакс, Калифорния Уайт Хилл

                                3 Стандартная ярмарка округа Марин Страница 3 Класс 4 — Цветная печать (9–12 лет) — 2-е место Кэти Шепардсон Новато, Калифорния Добрый пастырь Лютеранское среднее 2-е место Майя Тиснер Фэйрфакс, Калифорния Домашняя школа Марин 2-е место Елена Гнатек Фэрфакс, Калифорния Устав путевок 2-е место Эмелин Пужоль Сан-Рафаэль, Калифорния Le Lycée 2nd Emeline Pujol Сан-Рафаэль, CA Le Lycée 2nd Cristina Murdick Сан-Рафаэль, CA Mark Day School 2nd Алешка МакПретл Новато, CA Mark’s Day School 2nd Алешка МакПретл Новато, CA Mark’s Day School 2nd Изабель Соннет Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 2-й Коул Саммерс Гринбрэй, Калифорния Кент Средний 3-й Лорен Бэкон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Тейлор Бэкон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Тейлор Бэкон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Браден Белло Санта-Роза, Калифорния Sequoia Elementary 3-й Браден Белло Санта-Роза, Калифорния Начальная школа Секвойя 3-го Майя Будвиг Новато, Калифорния Марк Дневная школа 3-го Майя Будвиг Новато, Калифорния Марк Дневная школа 3-го Майя Бадвиг Новато, Калифорния Марк Дневная школа 3-го Уиллоу Бускаглия Новато, Калифорния Богоматерь Лор etto 3-й Кристина Чейз Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Коннор Кастро Новато, Калифорния Синалоа 3-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Начальная школа Вальесито 3-й Сьерра-Грин Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Макс Гутьеррес Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Райли Холроан Сан-Рафаэль, Калифорния Тамалпаис 3-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 3-й София Каклеас Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 3-й София Каклеас Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 3-й Аойф Кинан Сан-Франциско, Калифорния The New Village School 3-й Лахлан Макларен Тибурон, Калифорния Бель-Эйр Начальная школа 3-й Ула Макпретл Новато, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Лорен Петтиджон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Марко Ванони Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито 3-й Марко Ванони Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито 3-й Молли Винс Сан-Рафаэль, Калифорния 3-й Майя Тиснер Фэрфакс, Калифорния Марин Домашнее обучение 3-й Елена Гнатек Фэрфакс, Калифорния Устав Pathways 3-й Эмелин Пухоль Сан-Рафаэль, Калифорния Ле-Лице 3-й Кристина Мердик Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа Почетное упоминание Хлоя Батлер Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа Почетное упоминание Морган Кархарт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Почетное упоминание Ила Финн Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик

                                4 Ярмарка округа Марин Стандарт Стр. 4 Класс 5 — черно-белые (13–15 лет) 1-й Каллен О’Брайен Фэйрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 1-й Кая Боттмейер Новато, Калифорния Марин Монтессори Дж. Х. 1-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 1-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 1-й Николас Бюхерт Брэнсон ’18 2-й Фрэнки Берта Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Оливия Бускалья Новато, Калифорния Школа искусств Марин 2-й София Чиапеллоне Сан Рафаэль, Калифорния Сент-Изабелла 2-й Молли Феррис Милл-Вэлли, Калифорния MVMS 2-й Эдан Ламбрайт Сан-Франциско, Калифорния Городская школа 2-й Лилиана Лойенбергер Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 2-й Кэтрин Лизаррага Сан-Ансельмо, Калифорния Уайтхилл Средний 2-й Джулия Мошардт Новато, Калифорния Добрый Пастырь Средний 2-й Джози Майер Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 2-й Наоми Уотсон Сан-Ансельмо, Калифорния Гринвуд 2-й Ричард Боллини Брэнсон ’18 2-й Ева Дэвис Брэнсон ’18 2-й Дэймон Зубер Брэнсон ’18 2-й Гриффин Нг Брэнсон ’18 3-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 3-й Кэтрин Гутьеррес Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Эмили Больница Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 3-й Ханна Флауэр Брэнсон ’18 3-й Брукс Хоффман Брэнсон ’18 3-й Адриан Табасси Брэнсон ’18 3-й Кэтрин Бернхардт Новато, Школа искусств Марин, Калифорния, 6-й класс – цветная печать (13–15 лет) 1-й Маккензи Слэгл Сан-Ансельмо, Калифорния Школа Уайт-Хилл 1-й Маккензи Слэгл Сан-Ансельмо, Калифорния Школа Уайт-Хилл 1-й Каллен О’Брайен Фэрфакс, Калифорния Уайт Hill Middle 1st Kaya Bottmeyer Novato, CA Марин Монтессори Дж. Х. 1-й Джонни Криббин Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 1-й Наталия Диксон Корте-Мадера, Калифорния Редвуд 1-й Молли Феррис Милл-Вэлли, Калифорния MVMS 1-й Джулия Маушардт Новато, Калифорния Добрый пастырь Миддл 1-й Мэдлин МакЭлрой Новато, Калифорния Тринити-академия 1-й Мэдлин МакЭлрой Новато, Калифорния Тринити-академия 1-й Джошуа Ментинг Ларкспер, Калифорния Холл Миддл 1-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 1-й Кьян Уокер Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 1-й Киан Уокер Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H

                                5 Marin County Fair Standard Страница 5 Класс 6 — Цветная печать (13–15 лет) — 2-й Кензо Алвитт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Кензо Алвитт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Фрэнки Берта Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Оливия Бланц Никасио, Калифорния Школа Никасио 2-й Морган Бут Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Джейк Борхес Плезантон, Калифорния Урожайный парк 2-й Оливия Бускалья Новато, Калифорния Школа искусств Марин 2-й Кейтлин Чоу-Исе Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Кейтлин Чоу-Исе Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Тимила Кларк-Шреста Тибурон, Калифорния Редвуд Хай 2-й Тейлор Конти Корте Мадера, Калифорния Редвуд Хай 2-й Джонни Криббин Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 2-й Джонни Криббин Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 2-й Наталья Диксон Корте Мадера, Калифорния Редвуд 2-й Бренна Галлахер Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Николь Гесс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Миддл 2-й Найлс Хелмс Новато, Калифорния Джим Бриджер 2-й Эдан Ламбрайт Сан-Франциско, Калифорния Городская школа 2-й Эдан Ламбрайт Сан-Франциско, Калифорния Городская школа 2-й Тринити Лэндис Новато, Калифорния Синалоа/Индиан-Вэлли 2-й Габриэлла Луккези Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Джулия Маушард Новато, Калифорния Добрый пастырь Средний 2-й Джози Майер Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 2-й Мадлен МакЭлрой Новато, Калифорния Академия Тринити 2-й Джошуа Ментинг Ларкспер, Калифорния Зал, средний 2-й Джошуа Ментинг Ларкспер, Калифорния, Холл, средний 2-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин, старшая школа, 2-я Эмили Оспиталь Новато, Калифорния, Сан-Марин, старшая школа, 2-й Киан Уокер, Сан-Ансельмо, Калифорния, Никасио, 4-й 2-й Кристин Уотридж, Корте Мадера, Калифорния Редвуд Старшая 2-я Наоми Уотсон Сан-Ансельмо, Калифорния Гринвуд 2-я Мадлен Верц Новато, Калифорния Сан-Хосе Средняя 2-я Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3 апреля Адельман Тибурон, Калифорния Дель Мар Средняя 3-я Морган Бут Новато, Калифорния Синалоа Средняя 3-я Кейтлин Чоу -Исэ Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Старшая 3-я Тейлор Конти Корте Мадера, Калифорния Редвуд Старшая 3-я Тейлор Конти Корте Мадера, Калифорния Редвуд Старшая 3-я Наталья Диксон Корте Мадера, Калифорния Редвуд 3-я Ноа Фенн Новато, Калифорния Домашняя школа 3-й Ноа Фенн Новато, Калифорния Домашняя школа 3-й Ной Фенн Новато, Калифорния Домашняя школа

                                6 Marin County Fair Standard Страница 6 Класс 6 — Цветная печать (13–15 лет) — 3-й Ноа Фенн Новато, Калифорния Домашняя школа 3-й Ноа Фенн Новато, Калифорния Домашняя школа 3-й Николь Гесс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 3-й Кэтрин Гутьеррес Сан-Рафаэль, Калифорния Mark Day School 3-й Найлс Хелмс Новато, Калифорния Джим Бриджер 3-й Найлс Хелмс Новато, Калифорния Джим Бриджер 3-й Корина Клейн Фэрфакс, Калифорния Уайт Хилл Средний 3-й Корина Клейн Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 3-й Тринити Лэндис Новато, Калифорния Синалоа/Индиан-Вэлли 3-й Тринити Лэндис Новато, Калифорния Синалоа/Индиан-Вэлли 3-й Джози Шоу Новато, Калифорния Новато Чартер 3-й Мадлен Верц Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 3-й Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Коби Пири Брэнсон ‘ 17 Класс 7 — Черное и белое (16–18 лет) 1-е место Кимберли ДеРозьерс, Сан-Ансельмо, Калифорния Школа Марин 1-е место, Крис Перани, Сан-Рафаэль, Калифорния, старшая школа Терра Линда, 1-е место, Крис Перани, Сан-Рафаэль, Калифорния, старшая школа Терра Линда, 1-е место, Криста Шмитт, Сан-Рафаэль, Калифорния. Сан-Рафаэль Хай 1-я Грейс-Стрит Расен Вудакр, Калифорния Школа Дрейка 2 место Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 2 место Николь Шмитт Сан Рафаэль, Калифорния Школа Сан Рафаэль 2 место Пейдж Станко Новато, Калифорния Хэнфорд Хай, Ричленд, Вашингтон 2 место Грейс Стрэзен Вудакр, Калифорния Школа Дрейка 2 место Оливия Тирнауэр Сан Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 2-й Джейкоб Вебер Новато, Калифорния Школа Марин 2-й Сидней Уэстли Брэнсон ’17 3-й Элодия Эррера Сан-Ансельмо, Калифорния Школа сэра Фрэнсиса Дрейка 3-й Джордан Забек-Хилл Сан-Рафаэль, Калифорния Клирлейк Хай 3-й Кристофер Мазерсилл Брэнсон ’18 3 место Алек Ритч Брэнсон ’18 Почетное упоминание Виктория Леман Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Высокий класс 8 — черно-белый, саморазвитие (13-18 лет) 1 место Кая Боттмейер Новато, Калифорния Марин Монтессори Дж.Х. 1 место Мариангела Моралес Брэнсон ’17 2 место Джейкоб Вебер Новато, Калифорния The Marin School 2 место Меган Термон Брэнсон ’17 3 место Тимила Кларк-Шреста Тибурон, Калифорния Редвуд High Class 9- Цветная печать (16–18 лет) 1-е место Кимберли ДеРозьерс Сан-Ансельмо, Калифорния The Marin School

                                7 Рекламный отчет Ярмарки округа Марин — Стандартное размещение премиум-класса, стр. 7 Класс 9 — Цветная печать (16-18 лет) — 1-е место Крис Перани, Сан-Рафаэль , Калифорния Терра Линда Хай 1-й Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 1-й Криста Шмитт Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 1-й Николь Шмитт Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 1-й Оливия Тирнауэр Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 1-й Линнеа Золецци Брэнсон ’17 1-й Грейс Уилкинс Брэнсон ’16 1-й Мик Уолтон Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Марин 2-й София Мехиди Новато, Калифорния Школа Сан-Марин 2-й Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 2-й Джейкоб Вебер Новато, Калифорния Школа Марин 2-й Гриффин Бахарах Брэнсон ’17 2-й Майки Хиригойен Брэнсон ’17 2-й Дэвид Нихаус Брэнсон ’17 2-й Оливия Вайзел Брэнсон ’17 2-й Джин Дэвис Брэнсон ’16 2-й Джеффри Колтофф Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Марин 3-й Лукас Калбертсон Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 3-й Изабель Дагган Милл Вэлли, Калифорния Дома школа 3-й Изабель Дагган Милл-Вэлли, Калифорния Домашняя школа 3-й Элодия Эррера Сан-Ансельмо, Калифорния Школа сэра Фрэнсиса Дрейка 3-й Линдси Лоудер Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 3-й Анна Норман-Викнер Сан-Рафаэль, Калифорния TL 3-й Анна Норман-Викнер Сан-Рафаэль, Калифорния TL 3-е место Анна Норман-Викнер Сан-Рафаэль, Калифорния, TL 3-е место Грейс Стрейсен Вудакр, Калифорния Школа Дрейка 3-е место Джоанмари Суонсон Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 3-е место Оливия Тирнауэр Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 3-е место Спенсер Смид Брэнсон ’17 3-е место Жанна Фаваро Сан-Рафаэль , CA The Marin School Почетное упоминание Victoria Lehman San Rafael, CA Terra Linda High Honored Mention Victoria Lehman San Rafael, CA Terra Linda High Elodia Herrera San Anselmo, CA Sir Francis Drake High Class 10 — Creative/Manipulated/Polaroid Transfer (13–18) лет) 1-й Каллен О’Брайен Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 1-й Лукас Калбертсон Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 1-й Кимберли ДеРозьерс Сан-Ансельмо, Калифорния Школа Марин 1-й Корина Кляйн Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 1-й Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Тер ra Линда Хай 1-й Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 1-й Джейкоб Вебер Новато, Калифорния Школа Марин 1-й Жанна Фаваро Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Марин

                                8 Ярмарка округа Марин Стандарт Страница 8 Класс 10 – Креатив/Манипулирование/Перенос Polaroid (13–18 лет) – 1-е место Хосе Чи Сан-Рафаэль, Калифорния, Старшая школа Сан-Рафаэля 1-е место, Анника Гринуолт, Сан-Рафаэль, Калифорния, Старшая школа Сан-Рафаэля, 1-е место, Эллисон Грибенс, Сан-Рафаэль , Калифорния Средняя школа Сан-Рафаэль 1-й Кэтрин Бернхардт Новато, Калифорния Школа искусств Марин 2-й Фрэнки Берта Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Руби Кларк Пойнт Рейес Ста, Калифорния Школа Уэст-Марин 2-й Тесса Герулд Милл-Вэлли, Калифорния Миллер-Вэлли Средний 2-й Тесса Герольд Милл Вэлли, Калифорния Милл Вэлли Средний 2-й Доминик Луккези Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 2-й Крис Перани Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 2-й Итан Террелл Брэнсон ’16 2-й Мишель Чан Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Марин 2-й Сара Робертсон Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Александра Дюран-Эспарса Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Бьянка Моралес Ларкспур, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Мэгги Пуллинджер Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Роза Кастильо Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Соня Сондхейм Сан-Раф Аэль, Калифорния Школа Сан-Рафаэль 2-й Энди Гарсия Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Сан-Рафаэль 2-й Кэмерон Стюарт Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Сан-Рафаэль 2-й Дженнифер Гарсия Сан-Рафаэль, Калифорния Школа Сан-Рафаэль 2-й Якелин Мальдонадо 2-й Лука Берарди SRHS 3-й апрель Адельман Тибурон, Калифорния Дель Мар Средний 3-й Оливия Бускалья Новато, Калифорния Школа искусств Марин 3-й Руби Кларк Пойнт Рейес Ста, Калифорния Вест-Марин Школа 3-й Молли Феррис Милл-Вэлли, Калифорния MVMS 3-й Тесса Героулд Милл-Вэлли, Калифорния Милл-Вэлли Средний 3-й Эндрю Купер Сан-Рафаэль, Калифорния Почетное упоминание школы Марин Виктория Леман Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Высокое почетное упоминание Виктория Леман Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай Лучший на выставке — (5-8 лет) Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H Best of Show — (9-12 лет) Maya Tisner Fairfax, CA Marin Homeschool Best of Show — (13-15 лет) Naomi Michaelis Novato, CA San Marin High Best of Show — Black & White (16-18 лет) Grace Strasen Woodacre, CA Drake High Best Шоу — Саморазвитие Черно-белое (16-18 лет) Кая Боттмейер Новато, Калифорния Марин Монтессори Дж. Х.

                                9 Marin County Fair Standard Стр. 9 Лучшее шоу — Цвет (16–18 лет) Кимберли ДеРозьерс Сан-Ансельмо, Калифорния The Marin School Лучшее шоу — Креативный/Манипулированный/Поляроидный перенос (16–18 лет) Джейкоб Вебер Новато, Калифорния Премия имени Чарли Барбони от Marin School Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H Майя Тиснер Фэрфакс, Калифорния Marin Homeschool Кая Боттмейер Новато, Калифорния Марин Монтессори Дж. Х. Кимберли ДеРозьерс Сан-Ансельмо, Калифорния Школа Марин Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай Грейс Стрейсен Вудакр, Калифорния Школа Дрейка Джейкоб Вебер Новато, Калифорния Премия Зана Морриса школы Марин (9-12 лет) Maya Tisner Fairfax, CA Marin Homeschool Special Award Callen O’Brien Fairfax, CA White Hill Middle Caleb Howard Albany, CA Albany Middle Chris Perani San Rafael, CA Terra Linda High Chris Perani San Rafael, CA Terra Linda High Division Mobilography Годы обучения 1-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальный 1-й Джордан Маклафлин Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 1-й Коул Саммерс Гринбрей, Калифорния Кент Средний 1-й Коул Саммерс Гринбрэй, Калифорния Кент Средний 2-й София Арройо Лагунитас, Калифорния Лагунитас Школьный округ 2-й Эллери Барнс Милл Вэлли , Калифорния Эдна Магуайр 2-й Колин Эванс Новато, Калифорния Марк Дневная школа 2-й Елена Гнатек Фэрфакс, Калифорния Pathways Charter 2-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Мэтью Масиас Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Брин Роулз Тибурон, Калифорния Бель-Эйр 3-й Уиллоу Бускалья Новато, Калифорния Богоматерь Лоретто 3-й Морган Кархарт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 3-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 3-й Джордан Маклафлин Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 3-й Брин Роулз Тибурон, Калифорния Бель-Эйр Почетное упоминание Морган Кархарт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик

                                10 Marin County Fair Standard Страница 10 Годы класса 1-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 1-й Джонни Криббин Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 1-й Аннали Джейкобс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 1-й Аннали Джейкобс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 1-й Джулия Мошардт Новато, Калифорния Добрый Пастырь Средний 1-й Рэйчел Мецгер Сан-Рафаэль, Калифорния Марин SEL 2-й Фрэнки Берта Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 2-й Кейтлин Чоу-Исе Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Рафаэль Хай 2-й Руби Кларк Пойнт Рейес Ста, Калифорния Школа Вест-Марин, 2-я школа Колин Дэвис, Сан-Рафаэль, Калифорния Школа залива Сан-Франциско, 2-я Аннали Джейкобс, Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон, средняя школа, 2-я Молли Мэдден, Сан-Рафаэль, Калифорния, Миллер-Крик, вторая школа, Мадлен МакЭлрой Новато, Калифорния, Академия Тринити, 2-я школа, Рэйчел Мецгер Сан-Рафаэль, Калифорния Марин SEL 2-й Рэйчел Мецгер Сан-Рафаэль, Калифорния Марин SEL 2-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 2-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 3-й Оливия Бускалья Новато, Калифорния Марин Школа Искусство 3-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 3-й Эйдан Эванс Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 3-й Молли Феррис Милл-Вэлли, Калифорния MVMS 3-й Тесса Героулд Милл-Вэлли, Калифорния Милл-Вэлли Средний 3-й Тесса Героулд Милл-Вэлли, Калифорния Милл-Вэлли Средний 3-й Тесса Герольд Милл Вэлли, Калифорния Милл Вэлли Средний 3-й Молли Мэдден Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Молли Мэдден Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Джулия Мошардт Новато, Калифорния Добрый Пастырь Средний 3-й Джулия Мошардт Новато, Калифорния Добрый Пастырь Средний 3-й Джози Шоу Новато, Калифорния Новато Чартер 3-й Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Mark Day School Класс 1-й Лукас Калбертсон Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 1-й Лукас Калбертсон Сан-Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай 2-й Анна Норман-Викнер Сан-Рафаэль, Калифорния TL 3-й Анна Норман -Wikner San Rafael, CA TL 3nd Anna Norman-Wikner San Rafael, CA TL Class 15 — Creative / Manipulated (13-18 лет) 2nd Josie Mayer Fairfax, CA White Hill Middle Best Of Show — Mobilography Wylie Cassinelli San Anselmo, CA SirФрэнсис Дрейк

                                11 Marin County Fair Standard Страница 11 Подразделение Снимок класса My Pet Class, годы 1-й Джесамин да Кунья Сан-Рафаэль, Калифорния Коулман 1-й Ханна Ходжсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальная школа 1-й Эмиль Левенталь Олбани, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Палома Расс Вудакр, Калифорния Никасио 4-H 1-й Джордан Шомер Росс, Калифорния Школа Росс 2-й Холли Бернштейн Милл-Вэлли, Калифорния Школа Маунт-Тамалпаис 2-й Коул Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Начальная школа Вальесито 2-й Эммилу Ланге Сан-Франциско, Калифорния Дошкольное учреждение в горошек 2-й Сидней Ланге Сан-Франциско, Калифорния Начальная школа Саннисайд 2-й Амелия Полси Сан-Рафаэль, Калифорния Тамалпаис 4-H 2-й Джордан Шомер Росс, Калифорния Росс Класс школы 1-й Майя Тиснер Фэйрфакс, Калифорния Марин Домашняя школа 1-й Хлоя Батлер Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Рейн Конти Корте Мадера, Калифорния Холл Средний 1-й Елена Гнатек Fairfax, CA Pathways Charter 1st Reisa Paulsey San Rafael, CA Tamalpais 4-H 1st Carmen Rasella Mill Valley, CA Park School 1st Marlee Rhine Сан-Франциско, CA Presidio Hill School 1st Kate Waterfield San Ans Элмо, Калифорния Brookside School 2nd Sophia Arroyo Lagunitas, CA Lagunitas School District 2nd Ellery Barnes Mill Valley, CA Edna Maguire 2nd Morgan Carhart San Rafael, CA Miller Creek 2nd Raine Conti Corte Madera, CA Hall Middle 2nd Karson Franjieh San Rafael, CA Miller Creek 2-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальная школа 2-й Райли Холроан Сан-Рафаэль, Калифорния Тамалпаис 2-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Грейс Джейкобсон Новато, Калифорния Синалоа Средний 2-й Шарлотта Краус Тибурон, CA Gate Academy 2-й Микайла Маккалли Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон 2-й Шейли Маккалли Сан-Рафаэль, Калифорния Сан-Вэлли 2-й Джордан Маклафлин Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 2-й Алешка МакПретл Новато, Калифорния Дневная школа Марка 2-й Мэгги Нельсон Сан-Ансельмо, Калифорния Уайт-Хилл Средний 2-й Лорен Петтиджон Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Мэйпл Сильверстайн Сан Рафаэль, Калифорния Брандейс 3-й Браден Белло Санта-Роза, Калифорния Sequoia Elementary 3-й Браден Белло Санта-Роза, Калифорния Sequoia Elementary

                                12 Marin County Fair Standard Страница 12 Классы — 3-й Морган Кархарт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик 3-й Райли Холроан Сан-Рафаэль, Калифорния Тамалпаис 3-й Алана Жаклин Росс, Калифорния Домашняя школа 3-й Джордан Маклафлин Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 3-й София Санти Сан-Рафаэль , Калифорния Сент-Изабелла 3-й Ила Финн Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Почетное упоминание Лео Бергхофф Сан-Рафаэль, Калифорния Коулман Элем. Почетное упоминание Кристина Чейз Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Среднее почетное упоминание Кэт Элен Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Почетное упоминание Майя Будвиг Новато, Калифорния Mark Day School Class 1st Джулия Маушардт Новато, CA Good Shepherd Средний 1st Джулия Мошардт Новато, CA Good Shepherd Средний 1-й Киан Уокер Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 1-й Киан Уокер Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 1-й Киан Уокер Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 2-й Александра Краески Новато, Калифорния Сонома Прибрежный конный спорт 2-й Кензо Алвитт Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер Крик Средний 2-й Кайли Берри Кентфилд, Калифорния Кент Средний 2-й Николь Гесс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 2-й Аннали Джейкобс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 2-й Эдан Ламбрайт Сан-Франциско, Калифорния Городская школа 2-й Молли Мэдден Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 2-й Джози Майер Фэйрфакс, Калифорния Уайт Хилл Средний 2-й Мадлен МакЭлрой Новато, Калифорния Тринити Академия 2-й Наоми Михаэлис Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 2-й Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 3-й Оливия Бускалья Нет вато, Калифорния Школа искусств Марин 3-й Уайли Кассинелли Сан-Ансельмо, Калифорния Сэр Фрэнсис Дрейк 3-й Тесса Героулд Милл-Вэлли, Калифорния Милл-Вэлли Средний 3-й Николь Гесс Сан-Рафаэль, Калифорния Дэвидсон Средний 3-й Лилиана Лойенбергер Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 3-й Габриэлла Луккези Сан Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний 3-й Энтони Раселла Милл-Вэлли, Калифорния Миллер-Вэлли Средний 3-й Руби Гонсалес Новато, Калифорния Синалоа Средний почетный приз Каллен О’Брайен Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний почетный приз Фрэнки Берта Сан-Рафаэль, Калифорния Миллер-Крик Средний почетный приз Маккензи Стингли Милл Вэлли, Калифорния Стингли Алоха Школьный класс 1 класс Грейс Хитченс Сан-Ансельмо, Калифорния Марин Католическая школа 1 школа Николь Шмитт Сан Рафаэль, Калифорния Школа Сан Рафаэль 1 школа Джоанмари Суонсон Сан Рафаэль, Калифорния Терра Линда Хай

                                13 Marin County Fair Standard Страница 13 Годы обучения — 1-й Оливия Тирнауэр Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H 2-й Изабель Дагган Милл-Вэлли, Калифорния Домашняя школа 2-й Элодия Эррера Сан-Ансельмо, Калифорния Школа сэра Фрэнсиса Дрейка 2-й София Мехиди Новато, Калифорния Сан-Марин High 2nd Juliana Swanson San Rafael, CA Terra Linda High Best of Show — (5-8 лет) Hannah Hodgson San Rafael, CA Vallecito Elementary Best of Show — (9-12 лет) Chloe Butler San Rafael, CA Mark Day School Best of Выставка — (13-15 лет) Джулия Мошардт Новато, Калифорния Good Shepherd Middle Best of Show — (16-18 лет) Оливия Тирнауэр Сан-Ансельмо, Калифорния Никасио 4-H Zan Morris Award (9-12 лет) Хлоя Батлер Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дей Школьный отдел Снимки друзей Класс, годы 1-й Коул Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Вальесито Начальная школа 2-й Риз Маклафлин Новато, Калифорния Гамильтон Школьный класс 1-й Уиллоу Бускалья Новато, Калифорния Богоматерь Лоретто 1-й Сьерра Грин Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа 1-й Джордан Маклафлин Новато, Калифорния Сан-Хосе Средний 1-й София Санти Сан-Рафаэль, Калифорния Сент-Изабелла 2-й Дилан Гибсон Сан-Рафаэль, Калифорния Начальная школа Вальесито 2-й Райли Холроан Сан-Рафаэль, Калифорния Тамалпаис 2-й Себастьян Краус Тибурон, Калифорния Gate Academy 3-й Bradain Bello Santa Rosa, CA Sequoia Elementary 3-й Cristina Murdick San Rafael, CA Mark Day School Почетное упоминание Max Gutierrez San Rafael, CA Mark Day School Class 1-й год Александра Краески Новато, Калифорния Sonoma Coastal Equestraining 1-й Джулия Маушард Новато, Калифорния Хорошо Шеперд Средний 1-й Джози Майер Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 1-й Джози Майер Фэрфакс, Калифорния Уайт-Хилл Средний 1-й Мэдлин МакЭлрой Новато, Калифорния Тринити Академия 2-й Каллен О’Брайен Ф airfax, CA White Hill Middle 2nd Olivia Blantz Nicasio, CA Nicasio School 2nd Caitlin Chow-Ise San Rafael, CA San Rafael High

                                14 Ярмарка округа Марин Страница 14 Классы — 2-й Тимила Кларк-Шреста Тибурон, Калифорния Редвуд Хай 2-й Рэйчел Мецгер Сан-Рафаэль, Калифорния Марин SEL Почетное упоминание Кэтрин Гутьеррес Сан-Рафаэль, Калифорния Mark Day School Почетное упоминание Кэтрин Гутьеррес Сан-Рафаэль, Калифорния Mark Day School Best of Show — Снимки друзей София Санти Сан-Рафаэль, Калифорния Снимки дивизиона Сент-Изабелла — Семейные поколения Класс, годы 2-й Коул Гибсон, Сан-Рафаэль, Калифорния, Начальный класс Вальесито, 2-й Дилан Гибсон, Сан-Рафаэль, Калифорния, Начальный класс Вальесито, 2-й София Санти, Сан-Рафаэль , Калифорния Сент-Изабелла Почетное упоминание София Арройо Лагунитас, Калифорния Лагунитас Школьный округ Класс 2-й Оливия Гонсалес Новато, Калифорния Сан-Марин Хай 3-й Аллегра Диас Сан-Рафаэль, Калифорния Марк Дневная школа

                                SDS-PAGE анализ олигомеров Aβ не оправдывает себя в исследованиях болезни Альцгеймера: привлекательность для ESI-IM-MS области болезни Альцгеймера (БА).

                                Здесь мы приводим критическую оценку двух методов, используемых для этой цели, а именно электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), широко используемого в полевых условиях, и ионной подвижности в сочетании с масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением (ESI-IM-MS), новый метод с большим потенциалом для характеристики олигомеров. Чтобы оценить их эффективность, мы сначала получили чистые сшитые олигомеры Aβ40 и Aβ42 четко определенного порядка. Анализ этих образцов с помощью SDS-PAGE показал, что SDS влияет на состояние олигомеризации олигомеров Aβ42, тем самым предоставляя неверную информацию об их порядке и распределении. Напротив, ESI-IM-MS предоставил точную информацию, а также сообщил о химической природе и структуре олигомеров. Наши результаты имеют важные последствия, поскольку они бросают вызов научным парадигмам в области БА, основанным на характеристике SDS-PAGE образцов олигомера Aβ.

                                Введение

                                Олигомеры Aβ, виды, которые образуются на ранних этапах агрегации Aβ, считаются патогенной молекулярной формой Aβ в нашей эры 1 . Следовательно, они были выбраны в качестве мишени для лечения этого заболевания 2 . Тем не менее, характеристика олигомеров Aβ является сложной задачей, поскольку они гетерогенны — включают в себя ряд состояний агрегации — и потому что они формируются временно — изменяясь в зависимости от времени 3,4 . Несмотря на эти трудности, были разработаны различные подходы и методы для их характеристики 5,6,7,8,9,10,11,12 . Один из таких подходов основан на получении сшитых олигомеров с помощью реакции фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков (PICUP) и их последующем анализе с помощью SDS-PAGE (рис. 1) 5,13 . Aβ1-40 (Aβ40) и Aβ1-42 (Aβ42) представляют собой две основные формы Aβ, отличающиеся только двумя гидрофобными остатками на С-конце. Анализ сшитых PICUP образцов Aβ40 и Aβ42 с помощью SDS-PAGE показал, что Aβ40 олигомеризуется через димеры до тетрамеров, тогда как Aβ42 делает это в основном через пентамеры и гексамеры 5,13 . Поскольку было показано, что Aβ42 играет более заметную роль в AD 14,15 , анализ PICUP/SDS-PAGE привел к выводу, что пентамеры и гексамеры составляют основные строительные блоки для агрегации Aβ 5,13 .

                                Рисунок 1

                                Анализ PICUP и SDS-PAGE, по-видимому, указывает на то, что Aβ40 и Aβ42 олигомеризуются разными путями.

                                ( a ) Образцы LMW Aβ содержат мономеры в равновесии с олигомерами Aβ низкого порядка (слева). Синтетические образцы LMW_CL Aβ получают, подвергая их аналоги LMW PICUP (справа). ( b ) Характеристика распределения олигомеров LMW и LMW_CL Aβ40 и Aβ42 с помощью анализа SDS-PAGE. Образцы LMW_CL Aβ40 и Aβ42 были приготовлены с использованием двух различных соотношений Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS, а именно 1:2:5 и 1:2:40.

                                Изображение в полный размер

                                Важность пентамеров и гексамеров в агрегации Aβ стала научной парадигмой в этой области. Например, по данным Web of Science, существует шесть ключевых статей 7,8,9,16,17,18 , часто цитируемых вместе (более тысячи раз), которые составляют основу исследовательского направления под названием «Олигомеры Aβ, фибриллы и AD». Три из этих шести работ основаны непосредственно на 16,18 или косвенно 7 по результатам анализа PICUP/SDS-PAGE. Однако анализ SDS-PAGE может быть необъективным, поскольку предполагалось, что SDS влияет на состояние олигомеризации Aβ, особенно Aβ42 8,19,20 . Учитывая потенциальные артефакты SDS, очень важно оценить полезность SDS-PAGE для характеристики олигомеров Aβ, чтобы иметь критерии для пересмотра выводов, сделанных на основе его использования. Для целей этой оценки важно рассмотреть новые методы, не зависящие от SDS. ESI-IM-MS — новый метод с большим потенциалом для характеристики олигомеров 7,10,21,22,23,24 . ESI-IM-MS дает возможность разделить образцы гетерогенных олигомеров на основе различий в порядке и/или структуре олигомеров, присутствующих в образце. Кроме того, временная шкала экспериментов с ИМ (десятки мс) намного короче, чем у традиционных структурных методов (от нескольких секунд до часов), что делает их идеальными для структурной характеристики гетерогенных и динамических образцов, таких как олигомеры Aβ. Кроме того, поскольку ESI-MS позволяет сохранить многие нековалентные взаимодействия внутри комплексов 25 , даже некоторые из которых включают уменьшенную поверхность взаимодействия 26,27,28,29,30 , ESI-IM-MS становится подходящим методом для характеристики не только поперечно-сшитых олигомеров, но также и нековалентных.

                                Здесь мы приводим критическую оценку SDS-PAGE и ESI-IM-MS для характеристики олигомеров Aβ. С этой целью мы сначала разработали протокол для получения чистых сшитых PICUP (CL) олигомеров Aβ40 и Aβ42 определенного порядка. Используя эти образцы, мы однозначно установили, что SDS-PAGE приводит к артефактам при определении порядка и распределения олигомеров Aβ42. модификации и структура как ковалентно, так и нековалентно связанных олигомеров Aβ. Наши результаты имеют важные последствия, поскольку они бросают вызов предыдущим научным парадигмам в этой области, основанным на результатах, полученных с помощью SDS-PAGE характеристики олигомеров Aβ. В этом контексте мы демонстрируем, что пентамеры и гексамеры являются артефактами анализа SDS-PAGE. Более того, мы идентифицируем димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42, имеющие глобулярную структуру и не имеющие определенной вторичной структуры, как самые ранние формы, которые следует учитывать при разработке терапевтических стратегий, направленных на олигомеризацию Aβ.

                                Результаты

                                PICUP и SDS-PAGE явно указывают на то, что Aβ40 и Aβ42 олигомеризуются по разным путям

                                Следуя ранее описанным протоколам 31,32 , мы получили образцы Aβ40 и Aβ42 в их самом низком состоянии агрегации с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). . Мы называем эти образцы низкомолекулярными (LMW) Aβ40 и Aβ42 (рис. 1а), поскольку различные методы показали, что они содержат мономеры, находящиеся в быстром равновесии с олигомерами низкого порядка 31 . Чтобы заморозить это динамическое равновесие, образцы LMW Aβ сшивали с помощью PICUP 5,13 . Мы называем эти образцы LMW сшитыми (LMW_CL) Aβ40 и Aβ42 (рис. 1а). Первоначально мы использовали ранее описанные условия — комплекс Aβ/трис(бипиридил) Ru(II) (Ru(bpy) 3 2+ )/персульфат аммония (APS) в соотношении 1:2:40 — для получения LMW_CL Аβ40 и Аβ42 5,13,33 . Анализ этих образцов с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром воспроизвел предыдущие результаты, описанные в литературе (рис. 1b). Молекулярная масса несшитого LMW Aβ40 соответствовала молекулярной массе мономеров. LMW_CL Aβ40 представлял собой распределение олигомеров, характеризующееся мономерами вплоть до пентамеров, демонстрирующее уменьшение интенсивности с увеличением порядка олигомера. Несшитый Aβ42 продуцировал преимущественно три полосы, соответствующие мономерам, тримерам и тетрамерам. LMW_CL Aβ42 переходил от мономеров к тримерам, демонстрируя уменьшение интенсивности с увеличением порядка олигомеров, и как гауссово-подобное распределение, включающее от тетрамеров до октамеров, с максимумом у пентамеров и гексамеров. Эти результаты, по-видимому, подтверждают гипотезу Теплоу и соавт. о том, что Aβ40 и Aβ42 олигомеризуются разными путями 5,13 .

                                Чтобы определить гомогенность образцов LMW_CL Aβ, мы проанализировали LMW_CL Aβ40 с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления (ОФ-ВЭЖХ) и ЖХ в сочетании с МС высокого разрешения (ЖХ-МСВР). Этот анализ показал, что соотношение Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS, равное 1:2:40, приводит к различной степени окисления побочных продуктов (дополнительный рисунок S1a и таблица S1). Затем мы оптимизировали условия PICUP и обнаружили, что соотношение Aβ/Ru(bpy) 3 2+ / APS, равное 1:2:5, в значительной степени преодолело образование этих побочных продуктов (дополнительный рисунок S1b,c). Хотя оптимизированные условия привели к более низкому выходу сшитых олигомеров (рис. 1b), они использовались на протяжении всего нашего исследования, поскольку они обеспечивали химически четко определенные олигомеры CL Aβ.

                                Пентамеры и гексамеры Aβ42 являются артефактами анализа SDS-PAGE

                                Различные исследования показали, что SDS влияет на состояние олигомеризации образцов Aβ 8,19,20 . Чтобы учесть эту возможность, мы стремились определить порядок олигомеров и распределение образцов LMW_CL Aβ, используя новую стратегию, которая включала те же принципы, что и в SDS-PAGE, то есть денатурацию/дезагрегацию с последующим фракционированием по размеру, но без использования SDS. . Денатурацию/дезагрегацию осуществляли путем лиофилизации образцов LMW и LMW_CL Aβ40 и Aβ42 и последующего ресуспендирования их в 6,8 M тиоцианатном гуанидине (GdnHSCN), условия, используемые для растворения ядер бляшек 34 . Следовательно, обработка образцов LMW и LMW_CL Aβ 6,8 M GdnHSCN должна разрушить все нековалентные взаимодействия Aβ-Aβ, сохранив только ковалентные взаимодействия, образованные в ходе реакции сшивания. Фракционирование полученных олигомеров по размерам проводили с помощью SEC с использованием 10 мМ ацетата аммония при pH 8,5 в качестве буфера для элюирования. Этот буфер был выбран потому, что он предотвращал агрегацию образцов во время фракционирования SEC. После этой обработки, называемой анализом GdnHSCN-SEC, LMW Aβ40 и Aβ42 элюировались в виде одного пика (рис. 2a,b), подтверждая, что GdnHSCN нарушил все нековалентные взаимодействия и что агрегация была предотвращена во время SEC-фракционирования. Напротив, образцы LMW_CL Aβ40 и Aβ42 элюировались в виде четырех основных пиков (рис. 2c, d). Анализ ESI-MS подтвердил, что пики, элюирующиеся при 39.5, 34,7 и 32,6 мл в образцах LMW_CL Aβ40 и 38,4, 33,5 и 31,6 мл в образцах LMW_CL Aβ42 соответствовали «мономерам», димерам CL и тримерам CL Aβ40 (рис. 2e) и Aβ42 (рис. 2f) соответственно. Хотя пики, элюирующиеся при 31,3  мл в образцах LMW_CL Aβ40 (рис. 2c) и при 30,5  мл в образцах LMW_CL Aβ42 (рис. 2d), были небольшими, анализ ESI-MS выявил наличие зарядовых состояний +8 и +7, соответствующих тетрамерам. . Следует отметить, что анализ ESI-MS пиков, соответствующих «мономерам» в образцах LMW и LMW_CL Aβ, также показал, что они содержат зарядовые состояния, соответствующие нековалентным димерам и тримерам (рис. 2e,f). Эти наблюдения согласуются с предыдущими результатами, указывающими на то, что мономеры Aβ находятся в быстром равновесии с олигомерами Aβ низкого порядка (рис. 1а) 31 . В целом анализ GdnHSCN-SEC показал, что распределение олигомеров для образцов LMW_CL Aβ40 и Aβ42 было одинаковым и включало димеры, тримеры и тетрамеры (рис. 2c, d). Этот результат не согласуется с результатом, полученным при анализе тех же образцов с помощью SDS-PAGE (рис. 1b), что позволяет предположить, что SDS влияет на олигомеризацию Aβ, особенно Aβ42.

                                Рисунок 2

                                Пентамеры и гексамеры Aβ42 являются артефактами анализа SDS-PAGE.

                                Анализ GdnHSCN-SEC ( a ) LMW Aβ40, ( b ) LMW Aβ42, ( c ) LMW_CL Aβ40 и ( d ) LMW_CL Aβ42. Спектры ESI-MS, соответствующие пикам, обнаруженным после анализа GdnHSCN-SEC образцов ( e ) LMW_CL Aβ40 и ( f ) LMW_CL Aβ42. SDS-PAGE анализ выделенных димеров и тримеров CL, а также их смесей на ( г ) Aβ40 и ( ч ) Aβ42, полученных после фракционирования GdnHSCN-SEC. M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры и Hx = гексамеры. Красные стрелки указывают на олигомеры, искусственно образованные в присутствии ДСН.

                                Изображение в полный размер

                                Доступ к образцам чистого синтетического CL Aβ олигомера четко определенного порядка дал нам уникальную возможность изучить влияние SDS на олигомеризацию Aβ. Мы проанализировали изолированные димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42 КЛ, а также их смеси, полученные после GdnHSCN-SEC, методом SDS-PAGE. Димеры и тримеры CL Aβ40 работали, как и ожидалось (рис. 2g). Однако димеры CL Aβ42 работают также в виде тетрамеров, тримеры CL Aβ42 также в виде гексамеров и смеси димеров и тримеров CL Aβ42 также в виде тетрамеров, пентамеров и гексамеров (рис. 2h). Эти данные имеют два важных следствия: i) SDS отвечает за влияние на состояние олигомеризации олигомеров Aβ42. Фактически, температура и время инкубации перед анализом SDS-PAGE не повлияли на состояние олигомеризации образцов (дополнительный рисунок S2). Следовательно, SDS-PAGE не является надежным методом для характеристики порядка и распределения олигомеров Aβ, присутствующих в образце; ii) они бросают вызов широко распространенному мнению, что пентамеры и гексамеры являются основными строительными блоками для агрегации Aβ.

                                Анализ ESI-IM-MS показывает, что Aβ40 и Aβ42 преимущественно олигомеризуются через димеры и тримеры

                                Учитывая, что анализ SDS-PAGE приводит к артефактам в характеристике олигомеров Aβ, мы считаем крайне важным разработать методы, которые могут обеспечить надежные результаты. Как подробно описано во введении, ESI-IM-MS представляет собой новый метод с большим потенциалом для характеристики олигомеров, присутствующих в образце 7,10,22 , позволяющий обойти проблемы, связанные с использованием SDS 8,19,20 . Чтобы оценить возможность ESI-IM-MS для характеристики олигомеров Aβ, мы затем исследовали образцы LMW и LMW_CL Aβ40 и Aβ42 в 10   мМ ацетата аммония при pH 8,5 (рис. 3 и дополнительные рисунки S3 – S5). Мы начали анализ ESI-IM-MS, сначала назначив все пики в каждом спектре конкретным олигомерам Aβ (см. Дополнительный текст). Вкратце, назначения были выполнены на основе распределения изотопов 13 C (рис. 3b,c и дополнительные рисунки S3b,c–S5b,c), как это предлагается в литературе 10 . Всякий раз, когда разрешения было недостаточно, назначение выполнялось путем обнаружения по крайней мере двух последовательных состояний заряда для определенного олигомера Aβ (рис. 3a и дополнительные рисунки S3a – S5a). Образцы LMW и LMW_CL Aβ40 и Aβ42 варьировались преимущественно от мономеров до тримеров, хотя также были обнаружены зарядовые состояния низкой интенсивности для тетрамеров, пентамеров и гексамеров (M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры и Hx = гексамеры) (рис. 3а и дополнительные рисунки S3a – S5a). Затем мы определили распределение олигомеров в каждом образце, используя все ионы в зарядовом состоянии по всему спектру (рис. 3г). Не было никаких существенных различий между распределением олигомеров Aβ40 и Aβ42 при сравнении в образцах LMW или LMW_CL. Следовательно, мы пришли к выводу, что распределение олигомеров для Aβ40 и Aβ42 было одинаковым, состоящим в основном из димеров и тримеров, и что PICUP обеспечивает точную картину этого распределения. Примечательно, что распределение олигомеров ESI-IM-MS согласуется с анализом GdnHSCN-SEC (дополнительный рисунок S6), тем самым подтверждая надежность ESI-IM-MS для характеристики олигомеров Aβ. Кроме того, в отличие от анализа GdnHSCN-SEC, ESI-IM-MS позволяет обнаруживать олигомеры с низким содержанием, такие как пентамеры и гексамеры, и характеризовать порядок олигомеров и распределение нековалентно связанных олигомеров.

                                Рисунок 3

                                Анализ ESI-IM-MS показывает, что Aβ40 и Aβ42 олигомеризуются преимущественно через димеры и тримеры.

                                ( a ) Спектры ESI-IM-MS для LMW Aβ40. M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры и Hx = гексамеры. Число рядом с каждым агрегатным состоянием относится к зарядовому состоянию иона. Суммарный спектр m/z показан справа. Проекции спектров ESI-IM-MS на ось времени дрейфа для ( b ) m/z 2166 (M +2, D +4, Tr +6 и Te +8) и ( c ) m/z 1732 (D +5), оба обозначены стрелкой в ​​( a ). Для каждого обнаруженного пика подвижности также показан связанный с ним спектр m/z. Пики были назначены с учетом соображений, описанных в дополнительном тексте. Анализ ESI-IM-MS образцов LMW_CL Aβ40, LMW_CL Aβ42 и LMW_CL Aβ42 показан на дополнительных рисунках S3–S5 соответственно. Относительная популяция M (фиолетовый), D (оранжевый), Tr (зеленый), Te (синий), P (коричневый) и Hx (розовый) в LMW Aβ40 (пустые столбцы), LMW Aβ42 (закрашенные столбцы), LMW_CL Aβ40 ( пустые кирпичные стержни) и образцы LMW_CL Aβ42 (заполненные кирпичные стержни), полученные из ( d ) подсчеты интенсивности всех зарядовых состояний, обнаруженных в спектрах ESI-IM-MS.

                                Изображение в натуральную величину

                                Димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42 принимают глобулярную форму, лишенную определенной вторичной структуры для предоставления динамической и структурной информации об олигомерах, присутствующих в образце. Что касается характеристики химических модификаций, анализ ESI-IM-MS показал, что масса олигомеров LMW_CL Aβ соответствует ожидаемой потере двух атомов водорода для каждой ковалентной связи, образованной в реакции PICUP (дополнительная рис.

                                S7) 35 .

                                Чтобы установить влияние сшивания на динамику олигомера Aβ, мы измерили ширину линии пиков подвижности, связанных с определенными олигомерами Aβ. Ширина линии, соответствующая нековалентным олигомерам Aβ в образцах LMW, была значительно больше, чем у CL в образцах LMW_CL (дополнительный рисунок S8). Это открытие показало, что во время эксперимента подвижности каждый из обнаруженных нековалентных олигомеров Aβ выбирал больше конформаций, чем их соответствующие аналоги CL. Результат согласуется с общим ожиданием того, что сшивание, которое влечет за собой образование ковалентных связей, уменьшает количество доступных конформаций.

                                Что касается структурной информации, эксперименты ESI-IM-MS могут предоставить значения сечения столкновения (Ω) 8,11,22,23,24 , которые являются ключевыми структурными ограничениями, связанными с размером и формой олигомера. Мы определили Ω для наиболее распространенных олигомеров Aβ, обнаруженных в образцах LMW и LMW_CL Aβ40 и Aβ42 (рис. 4a и дополнительная таблица 2), и сравнили один и тот же тип олигомера в четырех образцах. Во-первых, мы сравнили один и тот же тип олигомера в образцах LMW Aβ40 и Aβ42, и не было обнаружено существенных различий во времени дрейфа (дополнительная рис. S8a) или значениях Ω (рис. 4a), что указывает на их сходство. Затем мы провели такое же сравнение для образцов LMW_CL Aβ40 и Aβ42 и обнаружили значительные различия во времени дрейфа (дополнительный рисунок S8a) и значениях Ω (рис. 4a). Этот результат не был неожиданным, поскольку сшивание снижает конформационную динамику олигомеров Aβ (дополнительный рисунок S8), поэтому мы ожидали, что различия в форме будет легче различить среди олигомеров CL, чем среди нековалентных. Однако, хотя это открытие может указывать на то, что олигомеры LMW_CL Aβ42 имеют более протяженную структуру, чем их аналоги Aβ40, наблюдаемая разница согласуется с тем фактом, что Aβ42 имеет на две аминокислоты больше, чем Aβ40 (дополнительная рис. S9).). Соответственно, мы пришли к выводу, что олигомеры Aβ40 и Aβ42 одного и того же порядка принимают одинаковую форму, независимо от того, сшиты ли они.

                                Рисунок 4

                                Димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42 принимают глобулярную форму без определенной вторичной структуры.

                                ( a ) Значения Ω, полученные из пиков подвижности, связанных с наиболее распространенными состояниями заряда для наиболее распространенных обнаруженных олигомеров Aβ (Te = тетрамеры, Tr = тримеры и D = димеры) Te +7 (синий), Tr + 6 (зеленый) и D +5 (оранжевый) для LMW Aβ40 (пустые столбцы), LMW Aβ42 (закрашенные столбцы), LMW_CL Aβ40 (пустые столбцы с кирпичным рисунком) и LMW_CL Aβ42 (закрашенные столбцы с кирпичным узором). Данные представляют собой среднее  ± sd. из трех независимых экспериментов. p-значения рассчитаны с использованием непарного двустороннего критерия Стьюдента (**p < 0,01 и ***p < 0,001). ( b ) Теоретические модели димера Aβ40, построенные с использованием известных структурных ограничений для агрегатов Aβ (ядерных 36 , фибриллярных 37 и компактных 9,38 ), а также полученных в результате моделирования REMD (глобулярных). ( c ) Сравнение значений Ω, полученных из теоретических моделей димерных структур, описанных в (b), с экспериментальными измерениями для нековалентных димеров и димеров CL Aβ40, представленных в (a). CD-анализ димеров CL (оранжевый) и тримеров CL (зеленый) для ( d ) Aβ40 и ( e ) Aβ42, полученные после фракционирования GdnHSCN-SEC.

                                Полноразмерное изображение

                                Чтобы рационализировать экспериментально полученные значения Ω, мы построили три структурные модели димеров Aβ для Aβ40 (рис. 4b) и Aβ42 (дополнительный рисунок S10a). Эти модели были построены и названы ядерными 36 , фибриллярными 37 или компактными 9,38 на основе различных структурных ограничений, о которых сообщалось для агрегатов Aβ. Все предсказанные значения Ω (рис. 4c и дополнительный рис. S10b) были заметно больше, чем экспериментальные, что указывает на то, что ни одна из предложенных моделей не соответствует экспериментальным данным. Таким образом, чтобы построить более реалистичные структурные модели и получить более качественную выборку, мы провели моделирование атомной молекулярной динамики (МД) с использованием метода обмена репликами (REMD) и условий моделирования, аналогичных тем, что были в эксперименте ESI-MS 9. 0730 39,40 . В первой части моделирования все модели, независимо от их исходной формы, разрушились, приняв глобулярные структуры (дополнительный рис. S11). Из трех структурных моделей ансамбль шаровидных структур для ядерной формы имел самую низкую энергию (дополнительный рис. S12). Таким образом, мы взяли этот низкоэнергетический ансамбль для представления структуры модели глобулярного димера (рис. 4b и дополнительный рис. S10a). Среднее значение Ω этого ансамбля было очень похоже на экспериментальные значения, полученные для нековалентных димеров и димеров CL (рис. 4c и дополнительный рисунок S10b), что указывает на то, что димеры Aβ имеют глобулярную форму. Затем, чтобы подтвердить отсутствие определенной вторичной структуры, принятой олигомерами Aβ, мы измерили спектр КД димеров и тримеров CL Aβ40 и Aβ42, полученных сразу после SEC (рис. 4d, e). Спектры для всех четырех образцов показали минимум около 200 нм, что свидетельствует об отсутствии определенной вторичной структуры. Кроме того, также наблюдался рукав около 230 нм, что может отражать существование динамических структурных ядер. Таким образом, результаты ESI-IM-MS, моделирования MD и спектроскопии CD согласуются с тем, что димеры и тримеры Aβ принимают глобулярную форму, лишенную определенной вторичной структуры (рис. 4 и дополнительная рис. S10).

                                Обсуждение

                                Наши результаты показывают, что SDS-PAGE приводит к артефактам в определении порядка и распределения образцов олигомера Aβ42, и представляют ESI-IM-MS как мощный метод для характеристики порядка, распределения, химических модификаций и структуры как ковалентные, так и нековалентно связанные олигомеры Aβ (рис. 5). Более того, наши результаты показывают, что пентамеры и гексамеры являются артефактами анализа SDS-PAGE и выявляют димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42, имеющие глобулярную структуру и не имеющие определенной вторичной структуры, как самые ранние олигомеры, образовавшиеся во время агрегации Aβ.

                                Рисунок 5

                                Схемы, описывающие условия и информацию, полученную с помощью различных методов, использованных в этом исследовании для характеристики образцов LMW и LMW_CL Aβ.

                                Методы, включающие денатурирующие условия при подготовке и/или фракционировании образцов, не подходят для характеризации образцов LMW Aβ. Закрашенные и пунктирные кружки обозначают, соответственно, среднее значение и стандартное отклонение M = мономеров (фиолетовый), D = димеров (оранжевый), Tr = тримеров (зеленый), Te = тетрамеров (синий), P = пентамеров (коричневый) , Hx = гексамеры (розовый) и Hp = гептамеры (голубой) относительная популяция в каждом из исследованных образцов. Информация, полученная с помощью каждого из методов, показана в последнем столбце. В скобках указаны дополнительные методы, используемые для дальнейшей поддержки и/или проверки конкретной информации, полученной либо из GdnHSCN-SEC, либо из ESI-IM-MS. Результаты, полученные из анализа SDS-PAGE, отмечены красным, поскольку мы показали, что этот метод дает неверную информацию о порядке и распределении олигомеров, присутствующих в образце (рис. 2).

                                Полноразмерное изображение

                                Хотя ни одна другая лаборатория не изучала образцы LMW_CL Aβ40 и Aβ42 с помощью ESI-IM-MS, они изучали образцы LMW Aβ40 и Aβ42 7,10 . В связи с этим важно отметить, что наши результаты согласуются только с исследованиями, в которых использовалось изотопное распределение 13 C для определения пиков, разделенных по измерению подвижности. Так обстоит дело с выводами о образцах LMW Aβ40, о которых сообщил Dadlez et al. 10 . Они сообщили о наличии различных олигомеров, от димеров до гексадекамеров, принимающих две конформации, а именно компактную и вытянутую9.0730 13 . Значения Ω для олигомеров, обнаруженные в нашем исследовании, согласуются со значениями, полученными группой Дадлеза. Различия в количестве олигомеров, обнаруженных в двух исследованиях, можно согласовать, приняв во внимание, что работа Дадлеза была выполнена с использованием более высокой концентрации Aβ40 (200 мкМ против 30 мкМ). Напротив, наши результаты не согласуются с результатами Бауэрса и его коллег 7 , которые обнаружили одно зарядовое состояние (D-5, они работают в отрицательном режиме), специфичное для олигомера Aβ, которое включало различные пики подвижности, назначено авторами на основе исследований энергии инжекции и экспериментов PICUP/SDS-PAGE 7,21 , к димерам и тетрамерам для Aβ40 и к димерам, тетрамерам, гексамерам и додекамерам для Aβ42. Эти же задания были повторены в последующих статьях из группы 41,42,43,44,45 . Поскольку их приборы не позволяли измерять распределения изотопов 13 C, они не могли отличить, возникает ли пик подвижности от структурного варианта олигомера того же порядка (, например, , компактная и расширенная формы) или от олигомеров разных типов. заказ. Мы действительно наблюдали два пика подвижности, связанные с зарядовым состоянием D + 5 для Aβ40 и Aβ42 (дополнительный рисунок S13). Однако на основании 13 C, мы отнесли эти пики к компактной и вытянутой конформациям димера, а не к отдельным олигомерным формам. Таким образом, важным выводом для применения ESI-IM-MS к изучению олигомеров Aβ является то, что отнесения должны быть основаны на изотопном распределении 13 C пиков, разделенных по измерению подвижности, как первоначально было предложено Dadlez et co. -рабочие 10 . Всякий раз, когда не хватает разрешения для определения состояния заряда, мы предлагаем, чтобы обнаружение по крайней мере двух последовательных состояний заряда для конкретного олигомера требовалось для присвоения пика подвижности конкретному олигомеру.

                                Ключевым аспектом настоящего исследования является то, что стратегия GdnHSCN-SEC позволила нам получить доступ к синтетическим олигомерам Aβ четко определенного порядка. Этот протокол значительно улучшает предыдущие усилия по фракционированию олигомеров CL Aβ из полос SDS-PAGE. Действительно, для Aβ40 16 был описан протокол выделения олигомеров CL Aβ определенного порядка из SDS-PAGE. Попытки применить тот же протокол к образцам CL Aβ42 не увенчались успехом 16 . По мнению авторов этого исследования, изолированные олигомеры CL Aβ42 не были стабильны при повторном электрофорезе. Этот результат подтверждает наши выводы о том, что пентамеры и гексамеры Aβ42 не являются добросовестно сшитые олигомеры , но представляют собой димеры и тримеры, которые превращаются в пентамеры и гексамеры в присутствии SDS. Разработав протокол фракционирования, который позволил получить олигомеры Aβ четко определенного порядка, мы также позволили нам охарактеризовать их с помощью спектроскопии КД. Комбинируя анализ CD со структурной информацией, полученной из значений Ω, полученных в результате исследований ESI-IM-MS и атомистического моделирования MD, мы показываем, что димеры и тримеры имеют глобулярную складку, в которой отсутствует определенная вторичная структура (рис. 4 и дополнительная рис. S10). Это наблюдение контрастирует с предыдущими публикациями, в которых предполагалось, что димеры, тримеры и тетрамеры CL Aβ40, очищенные с помощью SDS-PAGE, принимают структуру β-листа 16 . В вышеупомянутой работе авторы использовали условия PICUP, которые в наших руках давали гетерогенную смесь окисленных продуктов при анализе с помощью ОФ-ВЭЖХ и ЖХ-МСВР (дополнительный рисунок S1 и таблица S1). Кроме того, авторы фракционировали олигомеры с помощью SDS-PAGE, и, хотя было применено несколько стадий очистки, существует вероятность того, что SDS загрязнил образцы, что повлияло на структуру очищенных олигомеров.

                                Таким образом, наши результаты показывают, что SDS-PAGE приводит к искусственным результатам при определении порядка и распределения олигомеров Aβ42, в то время как ESI-IM-MS зарекомендовал себя как мощный метод для характеристики порядка, распределения, химических модификаций и структуры как ковалентные, так и нековалентно связанные олигомеры Aβ40 и Aβ42. Эти результаты бросают вызов предыдущим научным парадигмам в области БА, основанным на использовании SDS-PAGE для характеристики образцов олигомеров Aβ. Среди этих парадигм пентамеры и гексамеры были установлены как строительные блоки для агрегации Aβ. Однако здесь мы демонстрируем, что пентамеры и гексамеры искусственно образуются из димеров и тримеров в присутствии SDS. Важно отметить, что мы идентифицируем димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42, принимающие глобулярную структуру и не имеющие определенной вторичной структуры, как самые ранние олигомеры, образующиеся во время агрегации Aβ. Этот результат согласуется с элегантным исследованием гомо- и гетеромолекулярной агрегации Aβ40/Aβ42 46 . Это исследование показывает, что из всех возможных стадий агрегации Аβ40 и Аβ42 значимо взаимодействуют только на уровне первичной нуклеации. Авторы объясняют этот результат предположением, что структура первичных ядер менее организована, чем структура фибрилл. Этот более низкий уровень организации позволил бы лучше приспособиться к несоответствию двух остатков C-терминала. Наши результаты, указывающие на то, что димеры и тримеры Aβ40 и Aβ42 принимают очень похожие формы без определенной вторичной структуры, полностью согласуются с предложенным объяснением. Наконец, поскольку сообщалось, что структурные модели для других олигомеров Aβ более высокого порядка принимают структуру β-листа 9,38,47 , наши данные о том, что димеры и тримеры Aβ имеют глобулярную форму и не имеют определенной вторичной структуры, указывают на то, что основные структурные перестройки происходят во время образования фибрилл. Эти наблюдения подчеркивают важность определения структур и свойств различных видов, участвующих в агрегации Aβ. Действительно, только благодаря этому уровню молекулярной детализации мы сможем рационально вмешиваться в агрегацию Aβ.

                                Методы

                                Получение LMW Aβ40 и Aβ42

                                Пептиды Aβ из 40 и 42 остатков, Aβ40 и Aβ42, были синтезированы и очищены доктором Джеймсом И. Эллиоттом (Нью-Хейвен). Препараты LMW Aβ40 и Aβ42 получали с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC). Пептид Aβ растворяли в 6,8 М GdnHSCN (Life Technologies) в концентрации 8,5 мг/мл, обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут и разбавляли до 5 мг/мл пептида и 4 М GdnHSCN с H 2 O. Затем его центрифугировали при 10 000  g. в течение 6 мин при 4°С и пропускали через фильтр Millex 0,45 мкм (Millipore). Полученный раствор Aβ вводили в препарированную колонку HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare). Колонку уравновешивали, используя 10 мМ фосфата натрия, рН 7,4, и элюировали при 4 °С со скоростью потока 1 мл/мин. Собирали пик, относящийся к LMW Aβ, и определяли его концентрацию белка (см. раздел «Количественная оценка концентрации белков Aβ40 и Aβ42»). Затем раствор пептида разбавляли до 150 мкМ, замораживали и хранили при -20°С до использования.

                                Количественное определение концентрации белков Aβ40 и Aβ42

                                LMW Концентрацию Aβ, полученную из фракций SEC, определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) в сочетании с матричным фотодиодным детектором (PDA) (Waters Alliance 2695, оснащенный матричным фотодиодным детектором 2998). ). ОФ-ВЭЖХ анализ проводили на колонке Symmetry 300 C 4 (4,6 × 150 мм, 5 мкм, 300 Å; Waters), скорость потока 1 мл/мин и линейный градиент от 0 до 60% B в 15 мин (A = 0,045% трифторуксусной кислоты (TFA) в воде и B = 0,036% TFA в ацетонитриле) при 60 °C. Калибровочную кривую строили на основе растворов Aβ40 и Aβ42, которые ранее были количественно определены аминокислотным анализом.

                                Фотоиндуцированное перекрестное связывание немодифицированных белков (PICUP)

                                Реакцию PICUP первоначально проводили в соответствии с описаниями, приведенными в литературе 33 . Экспериментальная установка состояла из корпуса камеры и диапроектора мощностью 150 Вт. Пробирку для ПЦР, содержащую сшиваемую реакционную смесь, помещали внутрь корпуса камеры для облучения. Образец облучали через слайд-проектор в течение короткого времени, точно контролируемого затвором камеры. Реакции PICUP проводили с использованием Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS соотношение 1:2:40. С этой целью 4 мкл 3 мМ Ru(bpy) 3 2+ и 4 мкл 60 мМ АПС добавляли к 40 мкл 150 мкМ LMW Aβ в 10 мМ натрий-фосфатном буфере. Смесь облучали в течение 1 с на расстоянии 10 см и немедленно гасили добавлением 6,5 мкл 4 М дитиотреитола (ДТТ). Позже условия реакции были оптимизированы, чтобы предотвратить окисление Aβ (дополнительный рис. S1). Наилучшие условия были обнаружены при использовании более низкой доли АПС, Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS 1:2:5, расстояние 10 см и время облучения 1 с. Если не указано иное, мы использовали соотношение Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS, равное 1:2:5, чтобы предотвратить образование окисленных побочных продуктов и получить химически четко определенные сшитые олигомеры. После реакции PICUP реагенты, несовместимые с анализом ESI-IM-MS и RP-HPLC, удаляли с помощью колонок Bio-Spin P30 (Bio-Rad), уравновешенных 10 мМ ацетатом аммония при pH 8,5. В сравнительных целях образцы PICUP также пропускали через колонки Bio-Spin P30 при анализе с помощью SDS-PAGE.

                                SDS-PAGE

                                10 мкл 3X буфера для образцов (SB) (150 мкл 10% SDS, 75 мкл 4 М DTT, 400 мкл H , 9,3 мл 87% глицерина, 5 мг кумасси бриллиантового синего G, 2,8 мл H 2 O) добавляли к 20 мкл образца для анализа с помощью SDS-PAGE. Образцы кипятили при 95 °C в течение 5 мин, если не указано иное, и хранили при температуре –20 °C до использования. Аликвоту 20 мкл каждого образца подвергали электрофорезу в гелях SDS-PAGE толщиной 0,75 мм, содержащих 15% акриламида. Гели анализировали при 80–100 В и окрашивали серебром.

                                ОФ-ВЭЖХ

                                ОФ-ВЭЖХ анализ образцов LMW_CL Aβ40 проводили с использованием колонки Symmetry 300 C 4 (4,6 × 150 мм, 5 мкм, 300 Å; Waters) при скорости потока 1 мл/мин и линейный градиент от 0 до 60% B за 15 мин (A = 0,045% TFA в воде и B = 0,036% TFA в ацетонитриле) при 60 °C.

                                ЖХ-МСВР.

                                180 пмоль LMW_CL Aβ40 и LMW_CL Aβ42 (дополнительный рисунок S14) анализировали с использованием аналитической колонки BioSuite pPhenyl 1000 (10 мкм, 2 x 75 мкм, вода) при линейной скорости потока 100 л/мин. градиент от 5 до 80% B за 60 мин (A = 0,1% муравьиной кислоты (FA) в воде, B = 0,1% FA в ацетонитриле). Выход колонки был непосредственно соединен с Advion TriVersa NanoMate, который использовался в качестве делителя и в качестве источника нанораспыления масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo Scientific). Положительная полярность использовалась с напряжением распыления в источнике NanoMate, установленным на 1,7 кВ. Капиллярное напряжение, температура капилляра и трубчатая линза на LTQ-FT были настроены на 40 В, 200 °C и 100 В соответственно.

                                GdnHSCN-SEC

                                Хотя окисление метионина было сведено к минимуму при использовании соотношений Aβ/Ru(bpy) 3 2+ /APS 1:2:5, небольшой процент окисленного метионина был обнаружен после выделения CL Aβ димеры и тримеры. Чтобы полностью восстановить все окисленные боковые цепи метионина, 500 мкл погашенной реакции PICUP лиофилизировали и ресуспендировали в ТФУ, содержащей 30 экв. рулевое колесо. Затем ТФУ выпаривали в токе N 2 и 500 мкл H 2 O добавили к образцу. Затем смесь лиофилизировали, ресуспендировали в 6,8 М GdnHSCN при концентрации Аβ 8,5 мг/мл и затем разбавляли H 2 O до 5 мг/мл пептида и 4 М GdnHSCN. Полученный раствор Aβ вводили последовательно в три колонки Superdex 75 HR 10/300-Superdex 75 HR 10/300-Superdex 200 HR 10/300. Колонки уравновешивали 10 мМ ацетатом аммония, рН 8,5, и образцы элюировали при 4 °С со скоростью потока 0,5 мл/мин.

                                ESI-IM-MS

                                Эксперименты ESI-IM-MS проводились на масс-спектрометре Synapt HDMS (Waters) IMS-oaTOF с квадрупольной бегущей волной, оборудованном Advion TriVersa NanoMate (Advion Biosciences). Положительный ESI использовали при капиллярном напряжении 1,7 кВ. Для наблюдения за олигомерами Aβ с низким n-значением были установлены напряжение конуса отбора проб 40 В и противодавление 5,7 мбар. Хотя при частоте более 3000 m/z сигнал не был обнаружен, данные были получены в диапазоне m/z от 500 до 5000 в течение 2 мин. Ускоряющее напряжение ионов в ловушке Т-волн составляло 6 В, если не указано иное; ускоряющее напряжение ионов в устройстве для переноса Т-волн поддерживалось постоянным на уровне 4 В. Поток газа в/м поддерживался на уровне 23 мл/мин. Данные ESI-IM-MS были получены при трех высотах волны: 7, 7,5 и 8. Функция Ω времени дрейфа была откалибрована с использованием денатурированного убиквитина (состояния заряда +9до +11), миоглобина (состояния заряда от +15 до +22) и цитохрома С (состояния заряда от +11 до +18). Время дрейфа было скорректировано как для зависимого от массы, так и для независимого от массы времени 48,49 . Все неизвестные значения времени дрейфа, для которых было получено значение Ω, находились в пределах калибровочной кривой, полученной с использованием 19 состояний заряда трех белковых стандартов. Необработанные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Mass Lynx v4.1 (Waters). Представленные данные являются средними из трех независимых экспериментов. Соображения по отнесению пиков ESI-IM-MS к конкретным олигомерам Aβ описаны в дополнительном тексте. Для определения распределения олигомеров Aβ с низким n для всех четырех исследованных образцов мы использовали все ионы в зарядовом состоянии по всему спектру. Для тех зарядовых состояний, которые содержали вклады от разных видов Aβ в измерении подвижности, относительный вклад каждого из них определялся путем подгонки мобилограммы к сумме функций Гаусса g (x c , w, A), где x c , w и A соответствуют центру, ширине на полувысоте и площади пика Гаусса соответственно. Подобранная функция, полученная для каждой мобилограммы, f_im, может быть записана как:

                                , где k_im — базовая интенсивность мобилограммы, Σ g (x c N , w N , A 3 N ) представляет собой сумму гауссианов, составляющих каждую мобилограмму, а N представляет собой количество гауссианов/видов, используемых для соответствия каждой мобилограмме. Относительную популяцию вида, вносящего вклад в данное состояние заряда, получали путем деления площади пика, представляющего этот вид, на сумму площадей каждого из других видов, вносящих вклад в данное состояние заряда. Вклад вида в общую интенсивность зарядового состояния иона был получен путем умножения его на его относительную численность. Популяцию вида получали суммированием интенсивности всех зарядовых состояний, характерных для конкретного вида, и делением ее на сумму интенсивностей всех зарядовых состояний ионов по всему спектру.

                                Моделирование структуры димера Aβ

                                Построение моделей димера Aβ

                                Три структурные модели для димеров Aβ40 и Aβ42 были построены с учетом известных структурных ограничений для агрегатов Aβ (ядерных 36 , фибриллярных 37 и компактных 907 38 ) (рис. 4b для Aβ40, дополнительный рисунок S10a для Aβ42). Последовательность Aβ была разделена на три сегмента: N-конец (остатки с 1 по 11), средний сегмент (остатки с 12 по 26) и C-конец (остатки с 27 по 40 для Aβ40 или с 27 по 42 для Aβ42). . Во всех моделях две единицы Aβ взаимодействуют через области β-цепи, определенные внутри каждой единицы Aβ, с образованием параллельных β-слоев посредством межмолекулярных водородных связей. Предыдущие отчеты предполагали, что область, содержащая остатки с 17 по 21, зародышеобразует самосборку Aβ 9. 0730 36 . В ядерной модели остатки с 12 по 24 принимают конформацию β-цепи. В фибриллярной модели области, охватывающие остатки с 12 по 24 и остатки с 30 по 40 (для Aβ40) или 42 (для Aβ42), принимают конформацию β-цепи. Остатки 25–29 содержат изгиб, который приводит две β-цепи в контакт посредством взаимодействий между боковыми цепями. Эта модель соответствует структуре Aβ, когда он включен в фибриллу 37 . Компактная модель была построена с учетом структурных моделей конкретных препаратов олигомеров Aβ, обнаруживающих стабильную N-концевую β-цепь 9.0730 9,38 . Таким образом, каждая единица Aβ содержала три области β-цепи, включающие остатки с 1 по 6, с 12 по 24 и с 30 по 40 (для Aβ40) или 42 (для Aβ42). Остатки с 7 по 11 и с 25 по 29 включают изгиб пептида, который приводит в контакт три β-цепи посредством взаимодействий боковых цепей. Каждая из шести структурных моделей, три для Aβ40 и три для Aβ42, были построены с использованием инструментов PyMol и Modeller, начиная со структуры фибрилл Aβ40, полученной из данных твердотельной ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии (ssNMR) (идентификатор банка данных белков — 2LMN) 37 .

                                Уравновешивание структуры в воде

                                Шесть структурных моделей были построены, оптимизированы, сольватированы в виде усеченного октаэдра, а затем последовательно нейтрализованы шестью ионами натрия 50 . Параметры Transferable Interaction Potential 3 Point (TIP3P) 51 использовались для воды и силового поля AMBER99SB-ILDN 52 для белков. Моделирование в воде проводилось с использованием периодических граничных условий и метода сетки частиц Эвальда 53 для дальнодействующей электростатической обработки (размер сетки 0,12 нм) в сочетании с радиусом отсечки 1 нм для взаимодействий Леннарда-Джонса. Все водные модели проводились в изотермическо-изобарическом ансамбле (T = 300 K и P = 1 атм) с использованием термостата Берендсена и баростата 54 . Алгоритм SHAKE 55 использовался для ограничения всех расстояний связи до их равновесного значения, что позволяет использовать временной шаг интегрирования 2 фс для условий решения. Мы провели 5 нс уравновешивания в воде и вычислили и минимизировали усредненную структуру снимков, сделанных за последние нс. Значения Ω для каждой из структурных моделей были рассчитаны методом точного рассеяния на твердых сферах (EHSS), который состоит из расчета траектории с использованием твердых сфер с центром в положении каждого атома 56 .

                                Моделирование REMD в газовой фазе

                                В качестве исходной структуры для моделирования REMD были удалены молекулы воды и противоионы. Мы использовали метод REMD 57 для выполнения расширенного моделирования в диапазоне температур для трех моделей димеров Aβ40 и Aβ42 в газовой фазе. Моделирование проводилось с учетом состояния заряда +5, которое является наиболее заполненным состоянием заряда для димеров в профиле ESI-MS. Для каждой структуры было выбрано 19 температур моделирования, охватывающих диапазон от 300 К до 614 К, что соответствует диапазону изменчивости температуры при измерениях подвижности 58 . При моделировании газовой фазы мы не использовали отсечку для несвязанных взаимодействий. Мы использовали алгоритм SHAKE для ограничения связей и временной шаг интегрирования 1 фс. Для каждой структуры димера Aβ мы выполнили 1 мкс моделирования REMD. Для анализа мы рассмотрели траектории при температуре 300 K, моделирующей идеально мягкие условия парообразования, и использовали пакет Gromacs.4.5.3. Значения Ω для ансамбля структур, сгенерированных в течение последних 500  нс REMD, также были рассчитаны с помощью точного метода рассеяния на твердых сферах (EHSS) 56 .

                                Спектроскопия КД в дальнем УФ-диапазоне

                                Спектры КД записывали на спектрометре Jasco 815 в диапазоне длин волн от 190 до 250 нм с шагом данных 0,2 нм, шириной полосы 2 нм и скоростью сканирования 50 нм/мин с интервалом 4 с. время отклика. Использовалась ячейка размером 1 см. После фракционирования GdnHSCN-SEC с использованием трех последовательно уравновешенных колонок в 10 мМ фосфата натрия при pH 8,5 были получены спектры для димеров и тримеров CL Aβ40 и Aβ42 при 4°C. Данные КД анализировали с помощью программы SpectraManager.

                                Резюме статистического анализа

                                Призма GraphPad использовалась для всех статистических анализов. Данные представлены как среднее ± sd. если не указано иное. Для расчета статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента (непарный, двусторонний). Показанные изображения являются репрезентативными для изображений, полученных как минимум в трех независимых экспериментах.

                                Дополнительная информация

                                Как цитировать эту статью : Pujol-Pina, R. et al. Анализ олигомеров Aβ в SDS-PAGE не оправдывает себя в исследованиях болезни Альцгеймера: он привлекателен для ESI-IM-MS. Науч. Респ. 5 , 14809; doi: 10.1038/srep14809 (2015).

                                Ссылки

                                • Haass, C. & Selkoe, D.J. Растворимые белковые олигомеры при нейродегенерации: уроки бета-амилоидного пептида болезни Альцгеймера. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 8, 101–112 (2007).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Hefti, F. et al. Дело о растворимых олигомерах Абета в качестве мишени для лекарств при болезни Альцгеймера. Тренды Фармакол. науч. 34, 261–266 (2013).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Редакция. Агрегатное состояние. Нац. Неврологи. 14, 399 (2011).

                                • Бенилова И., Карран Э. и Де Струпер Б. Токсичный олигомер Абета и болезнь Альцгеймера: императору нужна одежда. Нац. Неврологи. 15, 349–357 (2012).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Битан, Г. и др. Сборка бета-амилоидного белка (Абета): Абета 40 и Абета 42 олигомеризуются разными путями. проц. Натл. акад. науч. США 100, 330–335 (2003).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед Google ученый

                                • Necula, M. , Kayed, R., Milton, S. & Glabe, C.G. Низкомолекулярные ингибиторы агрегации указывают на то, что пути олигомеризации и фибрилляции бета-амилоида независимы и различны. Дж. Биол. хим. 282, 10311–10324 (2007).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Bernstein, S.L. et al. Олигомеризация бета-амилоидных белков и значение тетрамеров и додекамеров в этиологии болезни Альцгеймера. Нац. хим. 1, 326–331 (2009).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Ю. Л. и др. Структурная характеристика растворимого амилоидного бета-пептидного олигомера. Биохимия 48, 1870–1877 (2009 г.)).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Ахмед, М. и др. Структурное превращение нейротоксичных олигомеров бета-амилоида (1-42) в фибриллы. Нац. Структура Мол. биол. 17, 561–567 (2010).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Клонецки, М. и др. Разделение ионной подвижности в сочетании с МС обнаруживает два структурных состояния олигомеров пептида Abeta1-40 болезни Альцгеймера. Дж. Мол. биол. 407, 110–124 (2011).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Lee, J., Culyba, E.K., Powers, E.T. & Kelly, J.W. Амилоид-бета образует фибриллы зародышевым конформационным преобразованием олигомеров. Нац. хим. биол. 7, 602–609 (2011).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Нараян, П. и др. Кластерин внеклеточного шаперона изолирует олигомерные формы амилоид-бета(1-40) пептида. Нац. Структура Мол. биол. 19, 79–83 (2012).

                                  КАС Статья Google ученый

                                • Битан Г. и Теплоу Д. Б. Быстрое фотохимическое сшивание – новый инструмент для изучения метастабильных амилоидогенных белковых комплексов. Акк. хим. Рез. 37, 357–364 (2004).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Citron, M. et al. Мутантные пресенилины болезни Альцгеймера увеличивают продукцию амилоидного бета-белка из 42 остатков как в трансфицированных клетках, так и у трансгенных мышей. Нац. Мед. 3, 67–72 (1997).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Бленноу, К., Зеттерберг, Х. и Фаган, А. М. Биомаркеры жидкости при болезни Альцгеймера. Харб Колд Спринг. Перспектива. Мед. 2, а006221 (2012).

                                  Артикул пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Оно, К., Кондрон, М.М. и Теплоу, Д.Б. Взаимосвязь структуры и нейротоксичности амилоидных бета-белковых олигомеров. проц. Натл. акад. науч. США 106, 14745–14750 (2009 г.)).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Paravastu, A. K., Qahwash, I., Leapman, R.D., Meredith, S.C. & Tycko, R. Засеянный рост бета-амилоидных фибрилл из мозговых фибрилл, полученных при болезни Альцгеймера, дает отчетливую структуру фибрилл. проц. Натл. акад. науч. США 106, 7443–7448 (2009).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Ройчаудхури Р., Ян М., Хоши М. М. и Теплоу Д. Б. Сборка бета-амилоидного белка и болезнь Альцгеймера. Дж. Биол. хим. 284, 4749–4753 (2009).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Битан Г., Фрадингер Э. А., Спринг С. М. и Теплоу Д. Б. Нейротоксичные белковые олигомеры: то, что вы видите, не всегда то, что вы получаете. Амилоид 12, 88–95 (2005).

                                  Артикул пабмед Google ученый

                                • Ватт, А. Д. и др. Олигомеры, факт или артефакт? SDS-PAGE индуцирует димеризацию бета-амилоида в образцах головного мозга человека. Акта Нейропатол. 125, 549–564 (2013).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Bernstein, S.L. et al. Амилоидный бета-белок: структура мономера и ранние состояния агрегации Abeta42 и его аллоформы Pro19. Варенье. хим. соц. 127, 2075–2084 (2005).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Smith, D.P., Radford, S.E. & Ashcroft, A.E. Удлиненные олигомеры в амилоидной сборке бета2-микроглобулина, обнаруженные с помощью спектрометрии ионной подвижности-масс-спектрометрии. проц. Натл. акад. науч. США 107, 6794–6798 (2010).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Sitkiewicz, E., Oledzki, J., Poznanski, J. & Dadlez, M. Дитирозиновая поперечная связь уменьшает сечение столкновений димеров и тримеров пептида Abeta в газовой фазе: исследование ионной подвижности . ПлоС один 9, e100200 (2014).

                                  Артикул ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Ситкевич, Э., Клонецкий, М., Познански, Дж., Бал, В. и Дадлез, М. Факторы, влияющие на равновесие компактно-вытянутой структуры в олигомерах пептида Abeta1-40 – исследование масс-спектрометрии ионной подвижности. Дж. Мол. биол. 426, 2871–2885 (2014).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Hernandez, H. & Robinson, C.V. Определение стехиометрии и взаимодействий макромолекулярных ансамблей с помощью масс-спектрометрии. Нац. протокол 2, 715–726 (2007).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Айед А., Кручинский А. Н., Энс В., Стандинг К. Г. и Дакворт Х. В. Количественная оценка белково-белкового и лиганд-белкового равновесий большого аллостерического фермента с помощью ионизации электрораспылением времяпролетная масса спектрометрия. Быстрое общение. Масс-спектр. 12, 339–344 (1998).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед Google ученый

                                • Габелица, В., Галич, Н., Росу, Ф., Хуссье, К. и Де Пау, Э. Влияние факторов отклика на определение равновесных констант ассоциации нековалентных комплексов с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Дж. Масс-спектр. 38, 491–501 (2003).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед Google ученый

                                • Читта Р.К., Ремпель Д.Л. и Гросс М.Л. Определение констант сродства и коэффициентов отклика нековалентного димера грамицидина с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и математического моделирования. Варенье. соц. Масс-спектр. 16, 1031–1038 (2005).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Liu, J. & Konermann, L. Сродство связывания белок-белок в растворе, определенное масс-спектрометрией с электрораспылением. Варенье. соц. Масс-спектр. 22, 408–417 (2011).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед Google ученый

                                • Боэри Эрба, Э., Барилюк, К., Ян, Ю. и Зеноби, Р. Количественная оценка белок-белковых взаимодействий в нековалентных комплексах с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анальный. хим. 83, 9251–9259 (2011).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Теплоу Д. Б. Получение бета-амилоидного белка для структурных и функциональных исследований. Методы Энзимол. 413, 20–33 (2006).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Ян, А., Хартли, Д. М. и Лашуэль, Х. А. Подготовка и характеристика токсичных агрегатов Абета для структурных и функциональных исследований в исследованиях болезни Альцгеймера. Нац. протокол 5, 1186–1209 (2010).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Битан Г. Структурное исследование метастабильных амилоидогенных белковых олигомеров с помощью фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков. Методы Энзимол. 413, 217–236 (2006).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Selkoe, D.J., Abraham, C.R., Podlisny, M.B. & Duffy, L.K. Выделение низкомолекулярных белков из волокон амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера. Дж. Нейрохим. 46, 1820–1834 (1986).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Фэнси Д. А. и Кодадек Т. Химия для анализа белок-белковых взаимодействий: быстрое и эффективное сшивание, вызванное длинноволновым светом. проц. Натл. акад. науч. США 96, 6020–6024 (1999).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Рейнке, А. А., Унг, П. М., Кинтеро, Дж. Дж., Карлсон, Х. А. и Гествикки, Дж. Э. Химические зонды, которые избирательно распознают самые ранние олигомеры Абета в сложных смесях. Варенье. хим. соц. 132, 17655–17657 (2010).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Петкова А. Т., Яу В. М. и Тыко Р. Экспериментальные ограничения четвертичной структуры в бета-амилоидных фибриллах болезни Альцгеймера. Биохимия 45, 498–512 (2006).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Haupt, C. et al. Структурные основы бета-амилоидзависимых синаптических дисфункций. Ангью. хим. Междунар. Эд. англ. 51, 1576–1579 (2012).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Арселла, А. и др. Структура и динамика олигонуклеотидов в газовой фазе. Ангью. хим. Междунар. Эд. англ. 54, 467–471 (2015).

                                  КАС пабмед Google ученый

                                • Мейер Т. , Габелика В., Грубмюллер Х. и Ороско М. Белки в газовой фазе. ПРОВОДА Вычисл. Мол. науч. 3, 408–425 (2012).

                                  Артикул Google ученый

                                • Murray, M.M. et al. Бета-амилоидный белок: Abeta40 ингибирует олигомеризацию Abeta42. Варенье. хим. соц. 131, 6316–6317 (2009 г.)).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Гессель, М. М., Бернштейн, С., Кемпер, М., Теплоу, Д. Б. и Бауэрс, М. Т. Мутации семейной болезни Альцгеймера по-разному изменяют олигомеризацию бета-амилоидного белка. АКС хим. Неврологи. 3, 909–918 (2012).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Gessel, M.M. et al. Абета (39–42) модулирует олигомеризацию Абета, но не образование фибрилл. Биохимия 51, 108–117 (2012).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Zheng, X. et al. Z-Phe-Ala-диазометилкетон (PADK) разрушает и ремоделирует ранние олигомерные состояния белка Abeta42, вызывающего болезнь Альцгеймера. Дж. Биол. хим. 287, 6084–6088 (2012).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Zheng, X. et al. Сборка бета-амилоидного белка: эффект молекулярного пинцета CLR01 и CLR03. J. Phys Chem. Б. 119, 4831–4841 (2015).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Чукалевски, Р. и др. Пептиды Aβ40 и Aβ42 самоорганизуются в отдельные гомомолекулярные фибриллы в бинарных смесях, но перекрестно реагируют во время первичной нуклеации. хим. науч. 6, 4215–4233 (2015).

                                  КАС Статья пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Lendel, C. et al. Гексамерный пептидный бочонок как строительный блок протофибрилл бета-амилоида. Ангью. хим. Междунар. Эд. англ. 53, 12756–12760 (2014).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Руотоло, Б.Т., Бенеш, Дж.Л., Сандеркок, А.М., Хюнг, С.Дж. и Робинсон, К.В. Анализ ионной подвижности и масс-спектрометрии больших белковых комплексов. Нац. протокол 3, 1139–1152 (2008 г.).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                • Smith, D. P. et al. Расшифровка измерений времени дрейфа по данным спектрометрии и масс-спектрометрии подвижности ионов бегущей волны. Евро. Дж. Масс-спектр. 15, 113–130 (2009).

                                  КАС Статья Google ученый

                                • Smith, D.E. & Dang, L.X. Компьютерное моделирование ассоциации NaCl в поляризуемой воде. Дж. Хим. физ. 100, 3757–3766 (1994).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Йоргенсен В. Л. , Чандрасекар Дж., Мадура Дж. Д., Импей Р. В. и Кляйн М. Л. Сравнение простых потенциальных функций для моделирования жидкой воды. Дж. Хим. физ. 79, 926–935 (1983).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Линдорф-Ларсен, К. и др. Улучшены торсионные потенциалы боковой цепи для Amber ff9.Силовое поле белка 9SB. Белки 78, 1950–1958 (2010).

                                  КАС пабмед ПабМед Центральный Google ученый

                                • Йорк, Д. М., Дарден, Т. А. и Педерсен, Л. Г. Эффект дальнодействующих электростатических взаимодействий в моделировании макромолекулярных кристаллов: сравнение методов Эвальда и усеченного списка. Дж. Хим. физ. 99, 8345–8348 (1993).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Берендсен, Х. Дж. К., Постма, Дж. П. М., ван Гюнстерен, В. Ф., ДиНола, А. и Хаак, Дж. Р. Молекулярная динамика с подключением к внешней ванне. Дж. Хим. физ. 81, 3684–3690 (1984).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Рикарт, П., Чикотти, Г. и Берендсен, Х. Дж. К. Численное интегрирование декартовых уравнений движения системы с ограничениями: молекулярная динамика н-алканов. Дж. Вычисл. физ. 23, 327–341 (1977).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Шварцбург А. А. и Джаррольд М. Ф. Точная модель рассеяния твердых сфер для подвижностей многоатомных ионов. хим. физ. лат. 261, 86–91 (1996).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Sugita, Y. & Okamoto, Y. Метод молекулярной динамики с обменом репликами для укладки белков. хим. физ. лат. 314, 141–151 (1999).

                                  КАС Статья ОБЪЯВЛЕНИЯ Google ученый

                                • Морса, Д., Габелика, В. и Де Пау, Э. Эффективная температура ионов в спектрометрии ионной подвижности бегущей волны. Анальный. хим. 83, 5775–5782 (2011).

                                  КАС Статья пабмед Google ученый

                                Скачать ссылки

                                Благодарности

                                Р.П. и С.В. признать программы IRB Barcelona и правительства Испании FPI, соответственно, для получения докторских стипендий. Мы благодарим профессора Эрнеста Гиральта за полезные обсуждения и критическое прочтение рукописи, доктора Серджио Мадургу за создание предварительных моделей для сравнения с экспериментальным Ω и помощь в подгонке по Гауссу, доктора Марину Гей и Мар Виланову за поддержку масс-спектрометрии и Т. Йейтса. за редакционную помощь. Н.К. и М.В. являются активными участниками и членами MC Европейской инициативы COST BM 1403. Основной центр масс-спектрометрии IRB в Барселоне является лабораторией ProteoRed, частью PRB2-ISCIII, поддерживаемой грантом PT13/0001. Эта работа была поддержана грантами от MINECO-FEDER (SAF2012-35226) и от Ассоциации болезни Альцгеймера (NIRP-12-256641), оба для NC

                                Информация об авторе

                                Примечания автора

                                1. Пухоль-Пина Роса и Вилаприньо-Паскуаль Сильвия внесли равный вклад в эту работу.

                                Авторы и принадлежности

                                1. Институт исследований в области биомедицины (IRB Barcelona), Baldiri Reixac 10, Barcelona, ​​08028, Spain

                                  Rosa Pujol-Pina, Sílvia vilapriny-Pascula, Roberta, Rosa Pujol-Pina, Sílvia vilaprinya-pascula, Rosa Pujol-Pina, Sílvia vilaprinya-pascula, Rosa Pujol-Pina, Sílvia vilaprinya-pascula, Rosa Pujol-Pina.

                                  Совместная исследовательская программа IRB-BSC в области вычислительной биологии, Институт исследований в области биомедицины (IRB Barcelona), Baldiri Reixac 10, Барселона, 08028, Испания

                                  Annalisa Arcella & Modesto Orozco

                                2. Основной центр масс-спектрометрии, Институт биомедицинских исследований (IRB Barcelona), Baldiri Reixac 10, Барселона, 08028, Испания Университет Барселоны, Диагональ 647, Барселона, 08028, Испания

                                  Модесто Ороско

                                Авторы

                                1. Роза Пухоль-Пина

                                  Посмотреть публикации авторов

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                2. Sílvia Vilaprinyó-Pascual

                                  Просмотреть публикации автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                3. Roberta Mazzucato

                                  Просмотр публикаций автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                4. Annalisa Arcella

                                  Посмотреть публикации автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                5. Marta Vilaseca

                                  Просмотр публикаций автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                6. Modesto Orozco

                                  Просмотр публикаций автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Scholar

                                7. Natalia Carulla

                                  Просмотр публикаций автора

                                  Вы также можете искать этого автора в PubMed Google Академия

                                Взносы

                                Р. П. и С.В. оптимизированные условия PICUP для приготовления химически четких образцов LMW_CL Aβ. С.В. разработал, выполнил и проанализировал результаты анализа SDS-PAGE. С.В. и Р.М. разработал и внедрил протокол GdnHSCN-SEC. RP спроектировал, провел и проанализировал эксперименты ESI-IM-MS. С.В. полученное распределение олигомеров по данным ESI-IM-MS. Что касается построения моделей димера Aβ и моделирования атомистической МД, А.А. и М.О. конструировал эксперименты, А.А. исполняли их и А.А. и М.О. проанализировал данные. М.В. провела эксперименты LC-HRMS и ESI-MS, а также предоставила техническую поддержку и концептуальные рекомендации по экспериментам ESI-IM-MS. С.В. и Р.М. разработал, выполнил и проанализировал результаты экспериментов CD. NC задумал исследование, разработал и руководил всеми экспериментами и написал рукопись. Все авторы обсудили результаты, прокомментировали и внесли свой вклад в разделы рукописи.

                                Заявление об этике

                                Конкурирующие интересы

                                Авторы не заявляют о конкурирующих финансовых интересах.

                                Электронные дополнительные материалы

                                Дополнительная информация

                                Права и разрешения

                                Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons на статью, если иное не указано в кредитной строке; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям необходимо будет получить разрешение от держателя лицензии на воспроизведение материала. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

                                Перепечатка и разрешения

                                Об этой статье

                                Дополнительная литература

                                • Оценка свойств усиления самосборки гексамерного амилоида-β клеточного происхождения

                                  • Девке М. Вадукул
                                  • Селин Вранкс
                                  • Паскаль Кинлен-Кампард

                                  Научные отчеты (2021)

                                • Продукция посевных пептидов амилоида-β в модели прионных заболеваний при гиперактивации PDK1, индуцированной PrPSc

                                  • Джульетта Эспелета
                                  • Винсент Бодуэн
                                  • Бенуа Шнайдер

                                  Nature Communications (2019)

                                • Ионизационная масс-спектрометрия распыления бумаги с растворителем (SAPSI-MS) для анализа биомолекул и биожидкостей

                                  • Николо Рибони
                                  • Алессандро Куаранта
                                  • Леопольд Л. Илаг

                                  Научные отчеты (2019)

                                • Спектрометрия ионной подвижности в сочетании с многомерным статистическим анализом: выявление влияния кандидата на лекарство от болезни Альцгеймера на раннюю сборку пептида Aβ1-40

                                  • Серена Лаззаро
                                  • Нина Огринц
                                  • Рон М. А. Хирен

                                  Аналитическая и биоаналитическая химия (2019)

                                • Сложность амилоида-β и тау — на пути к улучшению биомаркеров и таргетной терапии

                                  • Хуан Карлос Поланко
                                  • Чуаньчжоу Ли
                                  • Юрген Гётц

                                  Nature Reviews Неврология (2018)

                                Комментарии

                                Отправляя комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Правила сообщества. 2, тем самым предоставляя неверную информацию об их порядке и распределении. Напротив, ESI-IM-MS предоставил точную информацию, а также сообщил о химической природе и структуре олигомеров. Наши результаты имеют важные последствия, поскольку они бросают вызов научным парадигмам в области БА, основанным на характеристике SDS-PAGE образцов олигомеров Af.

                                А( олигомеры, виды, которые образуются на ранней стадии агрегации А(, считаются патогенной молекулярной формой А( при БА1. Следовательно, они были выделены в качестве мишени для лечения этого заболевания2. Однако характеристика олигомеров А( представляет собой сложную задачу, потому что они неоднородны — включают в себя ряд агрегатных состояний — и потому что они формируются временно — развиваясь в зависимости от времени 3, 4. Несмотря на эти трудности, были разработаны различные подходы и методы для их характеристики 5–12. Подход основан на получении сшитых олигомеров с помощью реакции фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков (PICUP) и их последующем анализе с помощью SDS-PAGE (рис. 1)5,13. A(1-40) (A(40) и A(1-42) (A(42) представляют собой две основные формы A(), отличающиеся только двумя гидрофобными остатками на C-конце. Анализ PICUP сшитых A(40 и A(42) образцы с помощью SDS-PAGE показали, что A( 40 олигомеризуется через димеры до тетрамеров, в то время как A (42 делает это в основном через пентамеры и гексамеры5,13. Поскольку было показано, что A(42) играет более заметную роль в AD14,15, анализ PICUP/SDS-PAGE привел к выводу, что пентамеры и гексамеры составляют основные строительные блоки для A(агрегации5,13,9).0003

                                Важность агрегации пентамеров и гексамеров в A() стала научной парадигмой в этой области. Например, согласно Web of Science, существует шесть ключевых статей7-9,16-18, которые часто цитируются вместе (более одной тысяч раз), которые составляют основу исследовательского фронта под названием «А (олигомеры, фибриллы и АД»). Reixac 10, Barcelona 08028, Испания.Совместная исследовательская программа IRB-BSC в области вычислительной биологии, Институт исследований в области биомедицины (IRB Barcelona), Baldiri Reixac 10, Barcelona 08028, Испания. 3 Основной центр масс-спектрометрии, Институт исследований в области биомедицины (IRB Barcelona). ), Baldiri Reixac 10, Barcelona 08028, Испания. 4Кафедра биохимии и молекулярной биологии, Университет Барселоны, Diagonal 647, Barcelona 08028, Испания. ce и запросы на материалы должны быть адресованы N.C. (email: [email protected]) 9CLD CLTr CLTe

                                b A|3:Ru(bpy)32+:APS 1:0:0 +

                                Рис. 1. Анализ PICUP и SDS-PAGE, очевидно, указывает на то, что A|40 и A|42 олигомеризуются разными путями. (а) Образцы LMW Af3 содержат мономеры в равновесии с олигомерами Af3 низкого порядка (слева). Синтетические образцы LMW_CL Af3 получают, подвергая их аналоги LMW PICUP (справа). (b) Характеристика распределения олигомеров LMW и LMW_CL Af340 и Af342 с помощью анализа SDS-PAGE. Образцы LMW_CL Af340 и Af342 были приготовлены с использованием двух различных соотношений Af3/Ru(bpy)32+/APS, а именно 1:2:5 и 1:2:40.

                                выводы, полученные из анализа PICUP/SDS-PAGE. Однако анализ SDS-PAGE может быть необъективным, поскольку предполагалось, что SDS влияет на состояние олигомеризации Af, особенно Af 428,19,20. Учитывая потенциальные артефакты SDS, очень важно оценить полезность SDS-PAGE для характеристики олигомеров Af, чтобы иметь критерии для пересмотра выводов, сделанных на основе его использования. Для целей этой оценки важно рассмотреть новые методы, не зависящие от SDS. ESI-IM-MS — новый метод с большим потенциалом для характеристики олигомеров7,10,21-24. ESI-IM-MS дает возможность разделить образцы гетерогенных олигомеров на основе различий в порядке и/или структуре олигомеров, присутствующих в образце. Более того, временная шкала экспериментов с ИМ (десятки мс) намного короче, чем у обычных структурных методов (от нескольких секунд до часов), что делает их идеальными для структурной характеристики гетерогенных и динамических образцов, таких как олигомеры Af. Кроме того, поскольку ESI-MS позволяет сохранить многие нековалентные взаимодействия внутри комплексов25, даже некоторые из них включают уменьшенную поверхность взаимодействия26-30, ESI-IM-MS становится подходящим методом для характеристики не только поперечно-сшитых олигомеров, но и нековалентные.

                                Здесь мы приводим критическую оценку SDS-PAGE и ESI-IM-MS для характеристики олигомеров Af. С этой целью мы сначала разработали протокол для получения чистых PICUP сшитых (CL) олигомеров Af 40 и Af 42 определенного порядка. Используя эти образцы, мы однозначно установили, что SDS-PAGE приводит к артефактам при определении порядка и распределения олигомеров Af42. модификации и структура как ковалентно, так и нековалентно связанных олигомеров Af. Наши результаты имеют важные последствия, поскольку они бросают вызов предыдущим научным парадигмам в этой области, основанным на результатах, полученных с помощью SDS-PAGE характеристики олигомеров Af. В этом контексте мы демонстрируем, что пентамеры и гексамеры являются артефактами анализа SDS-PAGE. Более того, мы идентифицируем димеры и тримеры Af40 и Af 42, принимающие глобулярную структуру и лишенные определенной вторичной структуры, как самые ранние формы, которые следует учитывать при разработке терапевтических стратегий, нацеленных на олигомеризацию Af.

                                Результаты

                                PICUP и SDS-PAGE явно указывают на то, что AI40 и AI42 олигомеризуются разными путями. Следуя ранее описанным протоколам31,32, мы получили образцы Af40 и Af 42 в их самом низком агрегатном состоянии, используя эксклюзионную хроматографию (SEC). Мы называем эти образцы низкомолекулярными (LMW) A(340 и Af42) (рис. 1a), поскольку различные методы показали, что они содержат мономеры, находящиеся в быстром равновесии с олигомерами низкого порядка 31. Чтобы заморозить это динамическое равновесие, LMW A ( образцы были сшиты с помощью PICUP5,13. Мы называем эти образцы LMW сшитыми (LMW_CL) A(40 и A(42) (рис. 1а). Первоначально мы использовали ранее описанные условия — A( /трис(бипиридил) комплекс Ru(II) (Ru(bpy)32+)/персульфат аммония (АПС) в соотношении 1:2:40 — для получения LMW_CL A(40 и A(425,13,33). Анализ этих образцы с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром воспроизвели предыдущие результаты, описанные в литературе (рис. 1b). Несшитый LMW A(40) имел молекулярную массу, соответствующую молекулярной массе мономеров. LMW_CL A(40) представил распределение олигомеров, характеризующееся вплоть до пентамеров, демонстрируя снижение интенсивности с увеличением порядка олигомера. Несшитый A(42) дает преимущественно три полосы, соответствующие мономеры, тримеры и тетрамеры. LMW_CL A( 42 переходил от мономеров к тримерам, показывая уменьшение интенсивности с увеличением порядка олигомеров, и как гауссово-подобное распределение, включающее от тетрамеров до октамеров, с максимумом у пентамеров и гексамеров. Эти результаты, по-видимому, подтверждают гипотезу Теплоу и соавт. -рабочие, которые олигомеризуются A(40 и A(42) разными путями5,13, ​​

                                Чтобы определить гомогенность образцов LMW_CL A(, мы проанализировали LMW_CL A( 40 с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ) и ЖХ в сочетании с МС высокого разрешения (ЖХ-МСВР). Этот анализ показал, что Соотношение A(/Ru(bpy)32+/APS, равное 1:2:40, приводило к различной степени окисления побочных продуктов (дополнительный рисунок S1a и таблица S1). Затем мы оптимизировали условия PICUP и обнаружили, что A(/Ru(bpy ) 32 + / APS соотношение 1: 2: 5 в значительной степени преодолело образование этих побочных продуктов (дополнительная рис. S1b, c).Хотя оптимизированные условия привели к более низкому выходу сшитых олигомеров (рис. 1b), они были использовались на протяжении всего нашего исследования, поскольку они обеспечивали химически четко определенные олигомеры CL A(9).0003

                                Пентамеры и гексамеры AP42 являются артефактами анализа SDS-PAGE. Различные исследования показали, что SDS влияет на состояние олигомеризации образцов A(8, 19, 20). Чтобы учесть эту возможность, мы попытались определить порядок олигомеров и распределение образцов LMW_CL A(, используя новую стратегию, включающую те же принципы, что и используемые в SDS-PAGE, то есть денатурация/дезагрегация с последующим фракционированием по размеру, но без использования SDS. Денатурация/дезагрегация была достигнута путем лиофилизации образцов LMW и LMW_CL A(40 и A(42) с последующим ресуспендированием их в 6,8 М тиоцианатном гуанидине (GdnHSCN). ), условия, используемые для растворения ядер бляшек 34. Таким образом, обработка образцов LMW и LMW_CL A( 6,8 M GdnHSCN должна разрушить все нековалентные взаимодействия A(-A) с сохранением только ковалентных взаимодействий, образовавшихся во время реакции сшивки. Полученные олигомеры получали методом SEC с использованием в качестве элюирующего буфера 10 мМ ацетата аммония при pH 8,5. Этот буфер был выбран потому, что он предотвращал агрегацию образцов во время SEC. фракционирование. После этой обработки, называемой анализом GdnHSCN-SEC, LMW A(40 и A(42) элюировались в виде одного пика (рис. 2a,b), подтверждая, что GdnHSCN нарушил все нековалентные взаимодействия и что агрегация была предотвращена во время SEC. Напротив, образцы LMW_CL A( 40 и A( 42) элюировались в виде четырех основных пиков (рис. 2c, d). Анализ ESI-MS подтвердил, что пики, элюирующиеся при 390,5, 34,7 и 32,6 мл в LMW_CL A(40) и при 38,4, 33,5 и 31,6 мл в LMW_CL A(42) образцы соответствовали «мономерам», димерам и тримерам CL A(40) (рис. 2д) и A( 42 (рис. 2f) соответственно. Хотя пики, элюирующиеся при 31,3 мл в образцах LMW_CL A(40 (рис. 2c) и при 30,5 мл в LMW_CL A(42 (рис. 2d)), были небольшими, ESI-MS анализ показал наличие зарядовых состояний +8 и +7, соответствующих тетрамерам. Следует отметить, что анализ ESI-MS пиков, соответствующих «мономерам» в образцах LMW и LMW_CL A(, также показал, что они содержат зарядовые состояния, соответствующие нековалентным димерам и тримеры (рис. 2e,f). Эти наблюдения согласуются с предыдущими результатами, указывающими на то, что мономеры A( находятся в быстром равновесии с олигомерами A( низкого порядка (рис. 1a)31. В целом, анализ GdnHSCN-SEC показал, что распределение олигомеров для LMW_CL образцы A( 40 и A( 42) были одинаковыми и включали димеры, тримеры и тетрамеры (рис. 2c, d). Этот результат не согласуется с полученным при n те же образцы были проанализированы с помощью SDS-PAGE (рис. 1b), что позволяет предположить, что SDS влияет на олигомеризацию A(, особенно на A(42,9). 0003

                                Имея доступ к образцам чисто синтетических олигомеров CL A( четко определенного порядка, мы получили уникальную возможность изучить влияние SDS на олигомеризацию A(40). Мы проанализировали изолированные димеры и тримеры CL A(40 и A(42), а также их смеси, полученные после GdnHSCN-SEC, с помощью SDS-PAGE. Димеры и тримеры CL A(40) работали, как и ожидалось (рис. 2g). гексамеры, а также смеси димеров и тримеров CL A(42) в виде тетрамеров, пентамеров и гексамеров (рис. 2h). Эти данные имеют два важных следствия: i) SDS отвечает за влияние на состояние олигомеризации олигомеров A(42). , температура и время инкубации перед анализом SDS-PAGE не повлияли на состояние олигомеризации образцов (дополнительный рисунок S2). Следовательно, SDS-PAGE не является надежным методом для характеристики порядка и распределения A ( олигомеры, присутствующие в образце; ii) они бросают вызов общепринятым vi Известно, что пентамеры и гексамеры являются основными строительными блоками А(агрегации.

                                Анализ ESI-IM-MS показывает, что Af 40 и Af 42 преимущественно олигомеризуются через димеры и тримеры. Учитывая, что анализ SDS-PAGE приводит к артефактам в характеристике олигомеров A(), мы считаем крайне важным разработать методы, которые могут обеспечить надежные результаты. Как подробно описано во введении, ESI-IM-MS является новым методом с большим потенциалом для характеристики олигомеры, присутствующие в образце7, 10, 22, что позволяет обойти проблемы, связанные с использованием SDS8, 19, 20. Для оценки осуществимости

                                Рисунок 2. Пентамеры и гексамеры Aß42 являются артефактами анализа SDS-PAGE. Анализ GdnHSCN-SEC (а) LMW Aß40, (b) LMW Aß42, (c) LMW_CL Aß40 и (d) LMW_CL Aß42. Спектры ESI-MS, соответствующие пикам, обнаруженным после анализа GdnHSCN-SEC образцов (e) LMW_CL Aß40 и (f) LMW_CL Aß42. SDS-PAGE анализ выделенных димеров и тримеров CL, а также их смесей на (g) Aß40 и (h) Aß42, полученные после фракционирования GdnHSCN-SEC. M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры и Hx = гексамеры. Красные стрелки указывают на олигомеры, искусственно образованные в присутствии ДСН.

                                Рисунок 3. Анализ ESI-IM-MS показывает, что Aß40 и Aß42 олигомеризуются преимущественно через димеры и тримеры. (а) Спектры ESI-IM-MS для LMW Aß40. M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры и Hx = гексамеры. Число рядом с каждым агрегатным состоянием относится к зарядовому состоянию иона. Суммарный спектр m/z показан справа. Проекции спектров ESI-IM-MS на ось времени дрейфа для (b) m/z 2166 (M +2, D +4, Tr +6 и Te + 8) и (c) m/z 1732 (D +5), оба отмечены стрелкой на (а). Для каждого обнаруженного пика подвижности также показан связанный с ним спектр m/z. Пики были назначены с учетом соображений, описанных в дополнительном тексте. Анализ ESI-IM-MS образцов LMW_CL Aß40, LMW_CL Aß42 и LMW_CL Aß42 показан на дополнительных рисунках S3-S5 соответственно. Относительная популяция M (фиолетовый), D (оранжевый), Tr (зеленый), Te (синий), P (коричневый) и Hx (розовый) в LMW Aß40 (пустые столбцы), LMW Aß42 (закрашенные столбцы), LMW_CL Aß40 (пустые столбцы кирпичного узора) и LMW_CL Aß42 (заполненные кирпичные столбики узора) образцы, полученные из (d) подсчета интенсивности всех состояний заряда, обнаруженных в спектрах ESI-IM-MS.

                                ESI-IM-MS для характеристики олигомеров Aß, мы затем исследовали образцы LMW и LMW_CL Aß40 и Aß 42 в 10 мМ ацетата аммония при pH 8,5 (рис. 3 и дополнительные рисунки S3-S5). Мы начали анализ ESI-IM-MS, сначала назначив все пики в каждом спектре конкретным олигомерам Aβ (см. Дополнительный текст). Вкратце, назначения были выполнены на основе распределения изотопа 13C (рис. 3b,c и дополнительные рисунки S3b,c-S5b,c), как это предлагается в литературе10. Всякий раз, когда разрешения было недостаточно, назначение выполнялось путем обнаружения по крайней мере двух последовательных состояний заряда для определенного олигомера Aβ (рис. 3a и дополнительные рисунки S3a-S5a). Образцы LMW и LMW_CL Aß40 и Aß 42 варьировались преимущественно от мономеров до тримеров, хотя также были обнаружены зарядовые состояния низкой интенсивности для тетрамеров, пентамеров и гексамеров (M = мономеры, D = димеры, Tr = тримеры, Te = тетрамеры, P = пентамеры). и Hx = гексамеры) (рис. 3а и дополнительные рисунки S3a-S5a). Затем мы определили распределение олигомеров в каждом образце, используя все ионы в зарядовом состоянии по всему спектру (рис. 3г). Не было никаких существенных различий между распределением олигомеров Aß 40 и Aß42 при сравнении в образцах LMW или LMW_CL. Отсюда мы сделали вывод, что олигомер 9Распределение 0003

                                для A( 40 и A( 42) было одинаковым, состоящим в основном из димеров и тримеров, и PICUP предоставил точную картину этого распределения. Примечательно, что распределение олигомеров ESI-IM-MS соответствовало анализу GdnHSCN-SEC. (Дополнительный рис. S6), тем самым подтверждая надежность ESI-IM-MS для характеристики олигомеров A (. Кроме того, в отличие от анализа GdnHSCN-SEC, ESI-IM-MS позволял обнаруживать олигомеры с низким содержанием, такие как пентамеры и гексамеры и характеристика порядка олигомеров и распределения нековалентно связанных олигомеров.

                                Димеры и тримеры Af 40 и Af 42 принимают глобулярную форму без определенной вторичной структуры. В дополнение к характеристике порядка и распределения олигомеров A(, ESI-IM-MS может идентифицировать химические модификации, а также предоставлять динамическую и структурную информацию об олигомерах, присутствующих в образце. Что касается характеристики химических модификаций, Анализ ESI-IM-MS показал, что масса олигомеров LMW_CL A( согласуется с ожидаемой потерей двух атомов водорода для каждой ковалентной связи, образованной в реакции PICUP (дополнительный рисунок S7) 35.

                                Чтобы установить влияние сшивания на динамику олигомера A(, мы измерили ширину линий пиков подвижности, связанных со специфическими олигомерами A(). Ширина линии, соответствующая нековалентным олигомерам A(, в образцах LMW была значительно больше, чем что у CL в образцах LMW_CL (дополнительный рисунок S8). Этот вывод показал, что во время эксперимента по подвижности каждый из обнаруженных нековалентных олигомеров A (выбрал больше конформаций, чем их соответствующие аналоги CL. Результат согласуется с общим ожиданием, что кросс -сшивание, которое влечет за собой образование ковалентных связей, уменьшает количество доступных конформаций.

                                Что касается структурной информации, эксперименты ESI-IM-MS могут предоставить значения сечения столкновения (0)8,11,22-24, которые являются ключевыми структурными ограничениями, связанными с размером и формой олигомера. (дополнительный рис. S8), поэтому мы ожидали, что различия в форме будет легче различить среди олигомеров CL, чем среди нековалентных.Однако, хотя это открытие может указывать на то, что олигомеры LMW_CL A (42) имеют более протяженная структура, чем их аналоги A(40), Наблюдаемая разница согласовывалась с тем фактом, что A(42) содержит на две аминокислоты больше, чем A(40) (дополнительная рис. S9). Соответственно, мы пришли к выводу, что олигомеры A(40 и A(42) одного и того же порядка принимают одинаковую форму, независимо от того, сшиты ли они.

                                для A(40 (рис. 4b) и A(42) (дополнительный рис. S10a). Эти модели были построены и названы ядерными36, фибриллярными37 или компактными9,38 на основе различных структурных ограничений, о которых сообщалось для агрегатов A(. Все предсказанные значения 0 (рис. 4c и дополнительный рисунок S10b) были заметно больше, чем экспериментальные, что указывает на то, что ни одна из предложенных моделей не соответствует экспериментальным данным Таким образом, чтобы построить более реалистичные структурные модели и добиться лучшей выборки, мы запустили атомистический моделирование молекулярной динамики (МД) с использованием метода обмена репликами (REMD) и условий моделирования, аналогичных условиям эксперимента ESI-MS39. ,40. В первой части моделирования все модели, независимо от их исходной формы, разрушились, приняв глобулярные структуры (дополнительный рис. S11). Из трех структурных моделей ансамбль шаровидных структур для ядерной формы имел самую низкую энергию (дополнительный рис. S12). Таким образом, мы взяли этот низкоэнергетический ансамбль для представления структуры модели глобулярного димера (рис. 4b и дополнительный рис. S10a). Среднее значение 0 этого ансамбля было очень похоже на экспериментальные значения, полученные для нековалентных димеров и димеров CL (рис. 4c и дополнительная рис. S10b), что указывает на то, что димеры A( имеют глобулярную форму. Далее, чтобы подтвердить отсутствия определенной вторичной структуры, принятой олигомерами А(, мы измерили спектр КД димеров и тримеров ХЛ А(40 и А(42), полученных сразу после ЭХ (рис. 4г, д). Спектры для всех четырех образцов показали минимум около 200 нм, что свидетельствует об отсутствии определенной вторичной структуры. Кроме того, также наблюдалось плечо около 230 нм, что может отражать существование динамических структурных ядер. Таким образом, результаты ESI-IM-MS, моделирования MD, и CD-спектроскопия соответствовали димерам и тримерам A(, принимающим глобулярную форму, лишенную определенной вторичной структуры (рис. 4 и дополнительная рис. S10).

                                Обсуждение

                                Наши результаты показывают, что SDS-PAGE приводит к артефактам в определении порядка и распределения образцов олигомера A(42) и представляют ESI-IM-MS как мощный метод для характеристики порядка, распределения, химических модификаций, и структуру как ковалентных, так и нековалентно связанных олигомеров A( (рис. 5). Более того, наши результаты показывают, что пентамеры и гексамеры являются артефактами анализа SDS-PAGE и выявляют димеры и тримеры A(40 и A(42), принимая глобулярную структуру и не имеет выраженной вторичной структуры, поскольку самые ранние олигомеры образовались во время А(агрегации).0003

                                Хотя ни одна другая лаборатория не изучала образцы LMW_CL A(40 и A(42) с помощью ESI-IM-MS, они рассматривали образцы LMW_CL A(40 и A(427,10). В этом отношении важно отметить, что наша результаты

                                Рисунок 4. Димеры и тримеры A|40 и A|42 принимают глобулярную форму, лишенную определенной вторичной структуры (a) Значения Q, полученные из пиков подвижности, связанных с наиболее распространенными зарядовыми состояниями для наиболее часто встречающихся обнаруженных олигомеров Af3 (Te = тетрамеры, Tr = тримеры и D = димеры) Te +7 (синий), Tr +6 (зеленый) и D +5 (оранжевый) для LMW Af340 (пустые столбцы), LMW Af342 (закрашенные столбцы), LMW_CL Af40 (пустые столбцы в виде кирпичей) и LMW_CL Af42 (заполненные столбцы в виде кирпичей). Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Значения p рассчитаны с использованием непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (**p < 0,01 и ***p <0,001. (b) Теоретические модели димера Af340, построенные с использованием известных структурных ограничений для агрегатов Af (ядерных36, фибриллярных37 и компактных9,38), а также полученные при моделировании REMD (глобулярные). (c) Сравнение значений Q, полученных из теоретических моделей димерных структур, описанных в (b), с экспериментальными измерениями для нековалентных димеров и димеров CL Af40, представленных в (a). CD-анализ димеров CL (оранжевый) и тримеров CL (зеленый) для (d) Af340 и (e) Af342, полученных после фракционирования GdnHSCN-SEC.

                                согласуются только с исследованиями, в которых использовалось изотопное распределение 13C для определения пиков, разделенных по измерению подвижности. Так обстоит дело с выводами о образцах LMW Af40, о которых сообщил Dadlez et al.10. Они сообщили о наличии различных олигомеров, от димеров до гексадекамеров, принимающих две конформации, а именно компактную и вытянутую13. Значения Q для олигомеров, обнаруженных в нашем исследовании, согласуются со значениями, полученными группой Дадлеза. Различия в количестве олигомеров, обнаруженных в двух исследованиях, можно согласовать, приняв во внимание, что работа Dadlez была выполнена с использованием более высокой концентрации Af40 (200 мкМ против 30 мкМ). Напротив, наши результаты не согласуются с результатами Bowers и соавт.7, которые обнаружили одно зарядовое состояние (D-5, они работают в отрицательном режиме), характерное для олигомера Af, которое включало различные пики подвижности, определяемые авторов на основе исследований энергии инжекции и экспериментов PICUP/SDS-PAGE7, 21, к димерам и тетрамерам для Af40 и к димерам, тетрамерам, гексамерам и додекамерам для Af42. Эти же задания были повторены в последующих работах группы 41-45. С момента их оснащения

                                Рисунок 5. Схемы, описывающие условия и информацию, полученную с помощью различных методов, использованных в этом исследовании для характеристики LMW и LMW_CL A| образцы. Методы, включающие денатурирующие условия при подготовке и/или фракционировании образцов, не подходят для характеристики образцов LMW Ap. Закрашенные и пунктирные кружки обозначают, соответственно, среднее значение и стандартное отклонение M = мономеры (фиолетовый), D = димеры (оранжевый), Tr = тримеры (зеленый), Te = тетрамеры (синий), P = пентамеры (коричневый) , Hx = гексамеры (розовый) и Hp = гептамеры (голубой) относительная популяция в каждом из исследованных образцов. Информация, полученная с помощью каждого из методов, показана в последнем столбце. В скобках указаны дополнительные методы, используемые для дальнейшей поддержки и/или проверки конкретной информации, полученной либо из GdnHSCN-SEC, либо из ESI-IM-MS. Результаты, полученные из анализа SDS-PAGE, отмечены красным, поскольку мы показали, что этот метод дает неверную информацию о порядке и распределении олигомеров, присутствующих в образце (рис. 2).

                                не позволяли измерять распределения изотопа 13С, они не могли различить, происходит ли пик подвижности от структурного варианта олигомера того же порядка (например, компактной и вытянутой форм) или от олигомеров другого порядка. Мы действительно наблюдали два пика подвижности, связанные с зарядовым состоянием D + 5 для A (40 и A (42) (дополнительный рис. S13). Однако на основе изотопного распределения 13C мы приписали эти пики компактным и расширенным конформациям димера, а не к различным олигомерным формам. Таким образом, важным выводом для применения ESI-IM-MS к изучению олигомеров A() является то, что отнесение должно быть основано на изотопном распределении 13C пиков, разделенных по измерению подвижности, как первоначально предложенный Дадлезом и его коллегами 10. Всякий раз, когда для определения состояния заряда недостаточно разрешения, мы предлагаем, чтобы для приписывания пика подвижности конкретному олигомеру требовалось обнаружение по крайней мере двух последовательных состояний заряда для конкретного олигомера.

                                Ключевым аспектом настоящего исследования является то, что стратегия GdnHSCN-SEC позволила нам получить доступ к синтетическим олигомерам A( четко определенного порядка. Этот протокол значительно улучшает предыдущие попытки фракционировать олигомеры CL A( из полос SDS-PAGE. Действительно, протокол выделения олигомеров CL A( определенного порядка из SDS-PAGE описан для A(4016). Попытки применить тот же протокол к 42 образцам CL A( не увенчались успехом16. Олигомеры A(42) не были стабильны при повторном электрофорезе. Этот результат подтверждает наши выводы о том, что пентамеры и гексамеры A(42) не являются добросовестными сшитыми олигомерами, а представляют собой димеры и тримеры, которые превращаются в пентамеры и гексамеры в присутствии SDS. разработал протокол фракционирования, который позволил получить олигомеры A( четко определенного порядка, а также позволил нам охарактеризовать их с помощью спектроскопии КД. Комбинируя анализ КД со структурной информацией, полученной из значений O, полученных из ES Исследования I-IM-MS и атомистическое моделирование MD показывают, что димеры и тримеры имеют глобулярную складку, в которой отсутствует определенная вторичная структура (рис. 4 и дополнительный рис. S10). Это наблюдение контрастирует с предыдущими публикациями, в которых было предложено, чтобы димеры, тримеры и тетрамеры CL A(40, очищенные с помощью SDS-PAGE, принимали трехслойную структуру16. В вышеупомянутой работе авторы использовали условия PICUP, которые в наших руках давали гетерогенная смесь окисленных продуктов при анализе с помощью RP-HPLC и LC-HRMS (дополнительный рис. S1 и таблица S1).Более того, авторы фракционировали олигомеры с помощью SDS-PAGE, и, хотя было применено несколько стадий очистки, есть возможность что SDS загрязнял образцы, влияя таким образом на структуру очищенных олигомеров.

                                Таким образом, наши результаты показывают, что SDS-PAGE приводит к артефактным результатам при определении порядка и распределения олигомеров A( 42, в то время как ESI-IM-MS считается мощным методом для характеристики порядка, распределения, химических модификаций, и структура как ковалентных, так и нековалентно связанных

                                олигомеров Af40 и Af42. Эти результаты бросают вызов предыдущим научным парадигмам в области AD, основанным на использовании SDS-PAGE для характеристики образцов олигомеров Af. Среди этих парадигм пентамеры и гексамеры были установлены в качестве строительных блоков для агрегации Af. Однако здесь мы демонстрируем, что пентамеры и гексамеры искусственно образуются из димеров и тримеров в присутствии SDS. Важно отметить, что мы идентифицируем димеры и тримеры Af40 и Af42, принимающие глобулярную структуру и не имеющие определенной вторичной структуры, так как самые ранние олигомеры образовались во время агрегации Af. Этот результат согласуется с элегантным исследованием, посвященным гомо- и гете Ромолекулярная агрегация Af40/Af4246. Это исследование показывает, что из всех возможных стадий агрегации Af40 и Af42 значимо взаимодействуют только на уровне первичной нуклеации. Авторы объясняют этот результат предположением, что структура первичных ядер менее организована, чем структура фибрилл. Этот более низкий уровень организации позволил бы лучше приспособиться к несоответствию двух остатков C-терминала. Наши данные, указывающие на то, что димеры и тримеры Af 40 и Af 42 принимают очень сходные формы без определенной вторичной структуры, полностью согласуются с предложенным объяснением. Наконец, поскольку сообщалось, что структурные модели других олигомеров Af более высокого порядка принимают f-листовую структуру9,38,47, наши данные о том, что димеры и тримеры Af являются глобулярными и не имеют определенной вторичной структуры, указывают на то, что основные структурные перестройки происходят во время образования фибрилл. Эти наблюдения подчеркивают важность определения структур и свойств различных видов, участвующих в агрегации Af. Действительно, только благодаря этому уровню молекулярной детализации мы сможем рационально вмешиваться в агрегацию Af.

                                Методы

                                Получение LMW AP40 и AP42. Пептиды Af из 40 и 42 остатков, Af40 и Af42, были синтезированы и очищены доктором Джеймсом И. Эллиоттом (Нью-Хейвен). Препараты LMW Af40 и Af42 получали с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Пептид Af растворяли в 6,8 М GdnHSCN (Life Technologies) в концентрации 8,5 мг/мл, обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин и разбавляли до 5 мг/мл пептида и 4 М GdnHSCN с помощью Н3О. Затем его центрифугировали при 10 000 g в течение 6 мин при 4 °C и пропускали через фильтр Millex 0,45 мкм (Millipore). Полученный раствор Af вводили в препарированную колонку HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare). Колонку уравновешивали, используя 10 мМ фосфата натрия, рН 7,4, и элюировали при 4°С со скоростью потока 1 мл/мин. Собирали пик, относящийся к LMW Af, и определяли его концентрацию белка (см. раздел «Количественная оценка концентрации белков Af40 и Af42»). Затем раствор пептида разбавляли до 150 мкМ, замораживали и хранили при -20°С до использования.

                                Количественное определение концентрации белков AP40 и AP42. Концентрацию LMW Af, полученную из фракций SEC, определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ), соединенной с матричным фотодиодным детектором (PDA) (Waters Alliance 2695, оснащенным матричным фотодиодным детектором 2998). Анализ ОФ-ВЭЖХ проводили с использованием колонки Symmetry 300 C4 (4,6 x 150 мм, 5 мкм, 300 A; Waters), скорость потока 1 мл/мин и линейный градиент от 0 до 60% B в 15 мин (A = 0,045% трифторуксусной кислоты (TFA) в воде и B = 0,036% TFA в ацетонитриле) при 60 °C. Калибровочную кривую строили на основе растворов Af 40 и Af42, которые ранее были количественно определены аминокислотным анализом.

                                Фотоиндуцированное перекрестное связывание немодифицированных белков (PICUP). Реакция PICUP первоначально проводилась в соответствии с описаниями в литературе33. Экспериментальная установка состояла из корпуса камеры и диапроектора мощностью 150 Вт. Пробирку для ПЦР, содержащую сшиваемую реакционную смесь, помещали внутрь корпуса камеры для облучения. Образец облучали через слайд-проектор в течение короткого времени, точно контролируемого затвором камеры. Реакции PICUP проводили с использованием соотношения Af/Ru(bpy)32+/APS 1:2:40. Для этого к 40 мкл 150 мкМ LMW Af в 10 мМ натрий-фосфатном буфере добавляли 4 мкл 3 мМ Ru(bpy)32+ и 4 мкл 60 мМ АПС. Смесь облучали в течение 1 с на расстоянии 10 см и немедленно гасили добавлением 6,5 мкл 4 М дитиотреитола (ДТТ). Позже условия реакции были оптимизированы, чтобы предотвратить окисление Af (дополнительный рис. S1). Наилучшие условия были получены при использовании более низкой доли АПС, Af/Ru(bpy)32+/АПС 1:2:5, расстоянии 10 см и времени облучения 1 с. Если не указано иное, мы использовали соотношение Af/Ru(bpy)32+/APS, равное 1:2:5, чтобы предотвратить образование побочных продуктов окисления и получить химически хорошо определенные сшитые олигомеры. После реакции PICUP реагенты, несовместимые с анализом ESI-IM-MS и RP-HPLC, удаляли с помощью колонок Bio-Spin P30 (Bio-Rad), уравновешенных 10 мМ ацетатом аммония при pH 8,5. В сравнительных целях образцы PICUP также пропускали через колонки Bio-Spin P30 при анализе с помощью SDS-PAGE.

                                ПБ-СТРАНИЦА. 10 мкл 3X буфера для образцов (SB) (150 мкл 10% SDS, 75 мкл 4M DTT, 400 мкл h3O, 375 мкл 8X буфера для образцов -8 мл 1M Tris pH 6,8, 9,3 мл 87% глицерина , 5 мг кумасси бриллиантового синего G, 2,8 мл водного раствора добавляли к 20 мкл образца для анализа с помощью SDS-PAGE. Образцы кипятили при 95°С в течение 5 мин, если не указано иное, и хранили при -20°С до использования. Аликвоту 20 мкл каждого образца подвергали электрофорезу в гелях SDS-PAGE толщиной 0,75 мм, содержащих 15% акриламида. Гели прогоняли при 80-100 В и окрашивали серебром.

                                ОФ-ВЭЖХ. ОФ-ВЭЖХ анализ LMW_CL A(40 образцов) проводили с использованием колонки Symmetry 300 C4 (4,6 x 150 мм, 5 мкм, 300 A; Waters) при скорости потока 1 мл/мин и линейном градиенте от 0 до 60 % B за 15 минут (A = 0,045% TFA в воде и B = 0,036% TFA в ацетонитриле) при 60 ° C.

                                ЖХ-МСВР. 180 пмоль LMW_CL A (40 и LMW_CL A (42) (дополнительный рисунок. S14) анализировали с использованием аналитической колонки BioSuite pPhenyl 1000 (10 мкм, 2 x 75 мм; Waters) при скорости потока 100 мкл/мин с линейным градиентом от 5 до 80% B за 60 мин (A = 0,1% муравьиной кислоты (FA) в воде, B = 0,1% FA в ацетонитриле). Выход колонки был напрямую соединен с Advion TriVersa NanoMate, который использовался как делитель и как источник нанораспыления масс-спектрометра LTQ-FT Ultra. (Thermo Scientific).Использовалась положительная полярность с напряжением распыления в источнике NanoMate, установленным на 1,7 кВ. Напряжение на капилляре, температура капилляра и трубчатая линза на LTQ-FT были настроены на 40 В, 200 °C и 100 В. , соответственно.

                                GdnHSCN-SEC. Хотя окисление метионина было сведено к минимуму при использовании соотношения A(/Ru(bpy)32+/APS 1:2:5, небольшой процент окисленного метионина был обнаружен после выделения димеров и тримеров CL A(. Для полного восстановления всего окисленного метионина боковых цепей, 500 мкл погашенной реакции PICUP лиофилизировали и ресуспендировали в ТФУ, содержащей 30 экв. Me2S-Nh5I, и оставляли на 2 ч при 4°С на вращающемся колесе. После этого ТФУ выпаривали в токе N2 и К образцу добавляли 500 мкл h3O. Затем смесь лиофилизировали, ресуспендировали в 6,8 М GdnHSCN при концентрации А 8,5 мг/мл, а затем разбавляли водой до 5 мг/мл пептида и 4 М GdnHSCN. полученный раствор А() вводили последовательно в три колонки: Superdex 75 HR 10/300-Superdex 75 HR 10/300-Superdex 200 HR 10/300. Колонки уравновешивали 10 мМ ацетатом аммония, pH 8,5, и образцы элюировали при 4 °C при скорости потока 0,5 мл/мин

                                ЭСИ-ИМ-МС. Эксперименты ESI-IM-MS проводились на масс-спектрометре IMS-oaTOF с квадрупольной бегущей волной Synapt HDMS (Waters), оснащенном Advion TriVersa NanoMate (Advion Biosciences). Положительный ESI использовали при капиллярном напряжении 1,7 кВ. Напряжение пробоотборного конуса 40 В и противодавление 5,7 мбар были установлены для наблюдения за олигомерами с низким n A(). 5000 в течение 2 мин.Ускоряющее напряжение ионов в ловушке Т-волнового устройства составляло 6 В, если не указано иное, ионное ускоряющее напряжение в передающем Т-волновом устройстве поддерживалось постоянным на уровне 4 В. Поток газа ИМ поддерживался на уровне 23 мл. Данные ESI-IM-MS были получены при трех высотах волны: 7, 7,5 и 8. Функция O времени дрейфа была откалибрована с использованием денатурированного убиквитина (состояния заряда +9до +11), миоглобина (состояния заряда от +15 до +22) и цитохрома С (состояния заряда от +11 до +18). Время дрейфа было скорректировано как для зависимого от массы, так и для независимого от массы времени48,49. Все неизвестные значения времени дрейфа, для которых было получено значение O, находились в пределах калибровочной кривой, полученной с использованием 19 состояний заряда трех белковых стандартов. Необработанные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения Mass Lynx v4.1 (Waters). Представленные данные являются средними из трех независимых экспериментов. Соображения, связанные с отнесением пиков ESI-IM-MS к конкретным олигомерам A, описаны в дополнительном тексте. Чтобы определить распределение олигомеров A с низким n для всех четырех исследуемых образцов, мы использовали все ионы в зарядовом состоянии по всему спектру. Для те зарядовые состояния, которые содержали вклады от разных A(видов в измерении подвижности, относительный вклад каждого из них определялся путем подгонки мобилограммы к сумме гауссовых функций g(xc, w, A), где xc, w и A соответствуют центру, ширине на полувысоте и площади пика Гаусса соответственно.Подобранная функция, полученная для каждой мобилограммы, f_im, может быть записана как:

                                f_im = k_im + £ g(xcN, wN, An) (1)

                                где k_im — базовая интенсивность мобилограммы, £ g(xcN, wN, AN) — сумма гауссианов, дающих вклад в каждую мобилограмму, и N — количество гауссовых/видов, используемых для соответствия каждой мобилограмме. Относительную популяцию вида, вносящего вклад в данное состояние заряда, получали путем деления площади пика, представляющего этот вид, на сумму площадей каждого из других видов, вносящих вклад в данное состояние заряда. Вклад вида в общую интенсивность зарядового состояния иона был получен путем умножения его на его относительную численность. Популяцию вида получали суммированием интенсивности всех зарядовых состояний, характерных для конкретного вида, и делением ее на сумму интенсивностей всех зарядовых состояний ионов по всему спектру.

                                Моделирование структуры димера A|3. Построение моделей димеров A0. Три структурные модели для димеров A(40 и A(42) были построены с учетом известных структурных ограничений для агрегатов A( (ядерных36, фибриллярных37 и компактных9,38) (рис. 4b для A(40, дополнительная рис. S10a для A (42). Последовательность A( была разделена на три сегмента: N-конец (остатки с 1 по 11), средний сегмент (остатки с 12 по 26) и C-конец (остатки с 27 по 40 для A(40 , или от 27 до 42 для A(42). Во всех моделях две единицы A() взаимодействуют через ( -нитевые области, определенные внутри каждой единицы A(), образуя параллельные ( -листы посредством межмолекулярных водородных связей. В предыдущих отчетах предполагалось, что область, включающая остатки с 17 по 21, образует зародыши A( самосборки36. В ядерной модели остатки с 12 по 24 принимают конформацию -цепи. В фибриллярной модели области, охватывающие остатки с 12 по 24 и остатки с 30 по 40 (для A( 40) или 42 (для A(42) принимают конформацию (-цепи). Остатки 25-29содержат изгиб, который

                                приводит две f-цепи в контакт посредством взаимодействия боковых цепей. Эта модель соответствует структуре Af, когда он включен в фибриллу 37. Компактная модель была построена с учетом структурных моделей специфических препаратов олигомеров Af, которые обнаруживают стабильную N-концевую f-цепь9,38. Таким образом, каждая единица Af содержала три участка f-цепи, включающие остатки с 1 по 6, с 12 по 24 и с 30 по 40 (для Af40) или 42 (для Af42). Остатки с 7 по 11 и с 25 по 29включают изгиб пептида, который приводит три f-цепи в контакт посредством взаимодействия боковых цепей. Каждая из шести структурных моделей, три для Af40 и три для Af42, были построены с использованием инструментов PyMol и Modeller, начиная со структуры фибрилл Af40, полученной из данных твердотельной ядерно-магнитно-резонансной спектроскопии (ssNMR) (идентификатор банка данных белков — 2LMN)37. .

                                Уравновешивание структуры в воде. Шесть структурных моделей были построены, оптимизированы, сольватированы в усеченном октаэдре, а затем последовательно нейтрализованы шестью ионами натрия50. Параметры Transferable Interaction Potential 3 Point (TIP3P)51 были использованы для воды и AMBER9.9SB-ILDN силовое поле52 для белков. Моделирование в воде было выполнено с использованием периодических граничных условий и метода сетки частиц Эвальда53 для дальнодействующей электростатической обработки (размер сетки 0,12 нм) в сочетании с радиусом отсечки 1 нм для взаимодействий Леннарда-Джонса. Все водные модели проводились в изотермическо-изобарическом ансамбле (T = 300 K и P = 1 атм) с использованием термостата Берендсена и баростата54. Алгоритм SHAKE55 был использован для ограничения всех расстояний связи до их равновесного значения, допуская временной шаг интегрирования в 2 фс для условий решения. Мы провели 5 нс уравновешивания в воде, вычислили и минимизировали усредненную структуру снимков, собранных за последние нс. Значения Q для каждой из структурных моделей были рассчитаны методом точного рассеяния на твердых сферах (EHSS), который состоит из расчета траектории с использованием твердых сфер с центром в положении каждого атома56.

                                Моделирование REMD в газовой фазе. В качестве исходной структуры для моделирования REMD были удалены молекулы воды и противоионы. Мы использовали метод REMD57 для выполнения расширенного моделирования в диапазоне температур для трех моделей димеров Af40 и Af42 в газовой фазе. Моделирование проводилось с учетом состояния заряда +5, которое является наиболее заполненным состоянием заряда для димеров в профиле ESI-MS. Мы выбрали 19 температур моделирования для каждой структуры, охватывающих диапазон от 300 К до 614 К, что соответствует диапазону изменчивости температуры при измерениях подвижности58. При моделировании газовой фазы мы не использовали отсечку для несвязанных взаимодействий. Мы использовали алгоритм SHAKE для ограничения связей и временной шаг интегрирования 1 фс. Для каждой структуры димера Af мы выполнили моделирование REMD в течение 1 мкс. Для анализа мы рассмотрели траектории при температуре 300 К, моделирующей идеально мягкие условия парообразования, и использовали пакет Gromacs. 4.5.3. Значения Q для ансамбля структур, сгенерированных в течение последних 500 нс REMD, также были рассчитаны с помощью точного метода рассеяния на твердых сферах (EHSS)56.

                                КД-спектроскопия в дальнем ультрафиолетовом диапазоне. Спектры КД записывали на спектрометре Jasco 815 в диапазоне длин волн от 190 до 250 нм с шагом данных 0,2 нм, шириной полосы 2 нм и скоростью сканирования 50 нм/мин с временем отклика 4 с. Использовалась ячейка размером 1 см. После фракционирования GdnHSCN-SEC с использованием трех последовательных колонок, уравновешенных 10 мМ фосфатом натрия при pH 8,5, спектры для димеров и тримеров CL Af40 и Af42 были получены при 4 ° C. Данные КД анализировали с помощью программы SpectraManager.

                                Резюме статистического анализа. GraphPad Prism использовался для всех статистических анализов. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. если не указано иное. Для расчета статистической значимости использовали t-критерий Стьюдента (непарный, двусторонний). Показанные изображения являются репрезентативными для изображений, полученных как минимум в трех независимых экспериментах.

                                Ссылки

                                1. Haass, C. & Selkoe, D.J. Растворимые белковые олигомеры при нейродегенерации: уроки бета-амилоидного пептида болезни Альцгеймера. Нац. Преподобный Мол. Клеточная биол. 8, 101-112 (2007).

                                2. Hefti, F. et al. Дело о растворимых олигомерах Abeta в качестве мишени для лекарств при болезни Альцгеймера. Тренды Фармакол. науч. 34, 261-266 (2013).

                                3. Редакция. Агрегатное состояние. Нац. Неврологи. 14, 399 (2011).

                                4. Бенилова И., Карран Э. и Де Струпер Б. Токсичный олигомер Абета и болезнь Альцгеймера: императору нужна одежда. Нац. Неврологи. 15, 349-357 (2012).

                                5. Битан Г. и др. Сборка бета-амилоидного белка (Абета): Абета 40 и Абета 42 олигомеризуются разными путями. проц. Натл. акад. науч. США 100, 330-335 (2003).

                                6. Necula, M., Kayed, R., Milton, S. & Glabe, C.G. Низкомолекулярные ингибиторы агрегации указывают на то, что пути олигомеризации и фибрилляции бета-амилоида независимы и различны. Дж. Биол. хим. 282, 10311-10324 (2007).

                                7. Bernstein, S.L. et al. Олигомеризация бета-амилоидного белка и значение тетрамеров и додекамеров в этиологии болезни Альцгеймера. Нац. хим. 1, 326-331 (2009 г.)).

                                8. Ю. Л. и соавт. Структурная характеристика растворимого амилоидного бета-пептидного олигомера. Биохимия 48, 1870-1877 (2009).

                                9. Ахмед М. и др. Структурное превращение нейротоксичных олигомеров бета-амилоида (1-42) в фибриллы. Нац. Структура Мол. биол. 17, 561-567 (2010).

                                10. Kloniecki, M. et al. Разделение по ионной подвижности в сочетании с МС обнаруживает два структурных состояния пептидных олигомеров Abeta1-40 болезни Альцгеймера. Дж. Мол. биол. 407, 110-124 (2011).

                                11. Lee, J., Culyba, E.K., Powers, E.T. & Kelly, J.W. Бета-амилоид образует фибриллы путем зародышевого конформационного преобразования олигомеров. Нац. хим. биол. 7, 602-609(2011).

                                12. Нараян П. и др. Кластерин внеклеточного шаперона секвестрирует олигомерные формы пептида амилоид-бета (1-40). Нац. Структура Мол. биол. 19, 79-83 (2012).

                                13. Битан Г. и Теплоу Д. Б. Быстрое фотохимическое сшивание — новый инструмент для изучения метастабильных амилоидогенных белковых комплексов. Акк. хим. Рез. 37, 357-364 (2004).

                                14. Citron, M. et al. Мутантные пресенилины болезни Альцгеймера увеличивают продукцию амилоидного бета-белка из 42 остатков как в трансфицированных клетках, так и у трансгенных мышей. Нац. Мед. 3, 67-72 (1997).

                                15. Бленноу, К., Зеттерберг, Х. и Фаган, А. М. Биомаркеры жидкости при болезни Альцгеймера. Харб Колд Спринг. Перспектива. Мед. 2, а006221 (2012).

                                16. Оно, К., Кондрон, М.М. и Теплоу, Д.Б. Взаимосвязь структуры и нейротоксичности амилоидных бета-белковых олигомеров. проц. Натл. акад. науч. США 106, 14745-14750 (2009).

                                17. Paravastu, A.K., Qahwash, I., Leapman, R.D., Meredith, S.C. & Tycko, R. Выращивание бета-амилоидных фибрилл из мозговых фибрилл, полученных при болезни Альцгеймера, дает отчетливую структуру фибрилл. проц. Натл. акад. науч. США 106, 7443-7448 (2009 г.)).

                                18. Roychaudhuri, R., Yang, M., Hoshi, M.M. & Teplow, D.B. Сборка бета-амилоидного белка и болезнь Альцгеймера. Дж. Биол. хим. 284, 4749-4753 (2009).

                                19. Битан Г., Фрадингер Э. А., Спринг С. М. и Теплоу Д. Б. Нейротоксичные белковые олигомеры: то, что вы видите, не всегда то, что вы получаете.

                                Амилоид 12, 88-95 (2005).

                                20. Watt, A.D. et al. Олигомеры, факт или артефакт? SDS-PAGE индуцирует димеризацию бета-амилоида в образцах головного мозга человека. Акта Нейропатол. 125, 549-564 (2013).

                                21. Bernstein, S.L. et al. Амилоидный бета-белок: структура мономера и ранние состояния агрегации Abeta42 и его аллоформы Pro19. Варенье. хим. соц. 127, 2075-2084 (2005).

                                22. Smith, D.P., Radford, S.E. & Ashcroft, A.E. Удлиненные олигомеры в амилоидной сборке бета2-микроглобулина, обнаруженные с помощью спектрометрии ионной подвижности-масс-спектрометрии. проц. Натл. акад. науч. США 107, 6794-6798 (2010).

                                23. Sitkiewicz, E., Oledzki, J., Poznanski, J. & Dadlez, M. Дитирозиновая поперечная связь уменьшает сечение столкновений димеров и тримеров пептида Abeta в газовой фазе: исследование ионной подвижности . ПлоС один 9, e100200 (2014).

                                24. Sitkiewicz, E., Kloniecki, M., Poznanski, J., Bal, W. & Dadlez, M. Факторы, влияющие на равновесие компактно-вытянутой структуры в олигомерах пептида Abeta1-40 — масс-спектрометрическое исследование подвижности ионов. Дж. Мол. биол. 426, 2871-2885 (2014).

                                25. Hernandez, H. & Robinson, C.V. Определение стехиометрии и взаимодействий макромолекулярных ансамблей с помощью масс-спектрометрии. Нац. протокол 2, 715-726 (2007).

                                26. Айед А., Кручинский А. Н., Энс В., Стандинг К. Г. и Дакворт Х. В. Количественная оценка белково-белкового и лиганд-белкового равновесий большого аллостерического фермента методом ионизации электрораспылением времяпролетная масса спектрометрия. Быстрое общение. Масс-спектр. 12, 339-344 (1998).

                                27. Габелица, В., Галич, Н., Росу, Ф., Хуссье, К. и Де Пау, Э. Влияние факторов отклика на определение констант равновесной ассоциации нековалентных комплексов с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Дж. Масс-спектр. 38, 491-501 (2003).

                                28. Читта Р.К., Ремпель Д.Л. и Гросс М.Л. Определение констант аффинности и коэффициентов отклика нековалентного димера грамицидина с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и математического моделирования. Варенье. соц. Масс-спектр. 16, 1031-1038 (2005).

                                29. Лю Дж. и Конерманн Л. Сродство связывания белок-белок в растворе, определенное с помощью масс-спектрометрии с электрораспылением. Варенье. соц. Масс-спектр. 22, 408-417 (2011).

                                30. Boeri Erba, E., Barylyuk, K., Yang, Y. & Zenobi, R. Количественная оценка белок-белковых взаимодействий в нековалентных комплексах с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Анальный. хим. 83, 9251-9259 (2011).

                                31. Теплоу Д.Б. Получение бета-амилоидного белка для структурно-функциональных исследований. Методы Энзимол. 413, 20-33 (2006).

                                32. Ян А., Хартли Д. М. и Лашуэль Х. А. Подготовка и характеристика токсичных агрегатов Абета для структурных и функциональных исследований в исследованиях болезни Альцгеймера. Нац. протокол 5, 1186-1209 (2010).

                                33. Битан Г. Структурное исследование метастабильных амилоидогенных белковых олигомеров с помощью фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков. Методы Энзимол. 413, 217-236 (2006).

                                34. Selkoe, D.J., Abraham, C.R., Podlisny, M.B. & Duffy, L.K. Выделение низкомолекулярных белков из волокон амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера. Дж. Нейрохим. 46, 1820-1834 (1986).

                                35. Фэнси Д. А. и Кодадек Т. Химия для анализа белок-белковых взаимодействий: быстрое и эффективное сшивание, вызванное длинноволновым светом. проц. Натл. акад. науч. США 96, 6020-6024 (1999).

                                36. Reinke, A.A., Ung, P.M., Quintero, J.J., Carlson, H.A. и Gestwicki, J.E. Химические зонды, которые избирательно распознают самые ранние олигомеры Abeta в сложных смесях. Варенье. хим. соц. 132, 17655-17657 (2010).

                                37. Петкова А. Т., Яу В. М. и Тыко Р. Экспериментальные ограничения четвертичной структуры в бета-амилоидных фибриллах болезни Альцгеймера. Биохимия 45, 498-512 (2006).

                                38. Haupt, C. et al. Структурные основы бета-амилоидзависимых синаптических дисфункций. Ангью. хим. Междунар. Эд. англ. 51, 1576-1579 (2012).

                                39. Arcella, A. et al. Структура и динамика олигонуклеотидов в газовой фазе. Ангью. хим. Междунар. Эд. англ. 54, 467-471 (2015).

                                40. Мейер Т., Габелица В., Грубмюллер Х. и Ороско М. Белки в газовой фазе. ПРОВОДА Вычисл. Мол. науч. 3, 408-425 (2012).

                                41. Murray, M.M. et al. Бета-амилоидный белок: Abeta40 ингибирует олигомеризацию Abeta42. Варенье. хим. соц. 131, 6316-6317 (2009 г.)).

                                42. Gessel, M.M., Bernstein, S., Kemper, M., Teplow, D.B. & Bowers, M.T. Мутации семейной болезни Альцгеймера по-разному изменяют олигомеризацию бета-амилоидного белка. АКС хим. Неврологи. 3, 909-918 (2012).

                                43. Gessel, M.M. et al. Абета (39-42) модулирует олигомеризацию Абета, но не образование фибрилл. Биохимия 51, 108-117 (2012).

                                44. Zheng, X. et al. Z-Phe-Ala-диазометилкетон (PADK) разрушает и ремоделирует ранние олигомерные состояния белка Abeta42, вызывающего болезнь Альцгеймера. Дж. Биол. хим. 287, 6084-6088 (2012).

                                45. Zheng, X. et al. Сборка бета-амилоидного белка: эффект молекулярного пинцета CLR01 и CLR03. J. Phys Chem. В 119, 4831-4841 (2015).

                                46. Чукалевски Р. и др. Пептиды A(40 и A(42) самособираются в отдельные гомомолекулярные фибриллы в бинарных смесях, но перекрестно реагируют во время первичной нуклеации. Chem. Sci. 6, 4215-4233 (2015).

                                47. Lendel, C. et al. .Гекзамерный пептидный бочонок как строительный блок протофибрилл бета-амилоида.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53,

                                12756-12760 (2014).

                                48. Руотоло, Б.Т., Бенеш, Дж.Л., Сандеркок, А.М., Хюнг, С.Дж. и Робинсон, К.В. Масс-спектрометрический анализ подвижности ионов больших белковых комплексов. Нац. протокол 3, 1139-1152 (2008).

                                49. Smith, D.P. et al. Расшифровка измерений времени дрейфа по данным спектрометрии и масс-спектрометрии подвижности ионов бегущей волны. Евро. Дж. Масс-спектр. 15, 113-130 (2009).

                                50. Smith, D.E. & Dang, L.X. Компьютерное моделирование ассоциации NaCl в поляризуемой воде. Дж. Хим. физ. 100, 3757-3766 (1994).

                                51. Йоргенсен В.Л., Чандрасекар Дж., Мадура Дж.Д., Импи Р.В. и Клейн М.Л. Сравнение простых потенциальных функций для моделирования жидкой воды. Дж. Хим. физ. 79, 926-935 (1983).

                                52. Lindorff-Larsen, K. et al. Улучшенные торсионные потенциалы боковой цепи для силового поля белка Amber ff99SB. Белки 78, 1950-1958 (2010).

                                53. Йорк, Д. М., Дарден, Т. А. и Педерсен, Л. Г. Эффект дальнодействующих электростатических взаимодействий в моделировании макромолекулярных кристаллов: сравнение методов Эвальда и усеченного списка. Дж. Хим. физ. 99, 8345-8348 (1993).

                                54. Берендсен, Х. Дж. К., Постма, Дж. П. М. , ван Гюнстерен, В. Ф., ДиНола, А. и Хаак, Дж. Р. Молекулярная динамика с подключением к внешней ванне. Дж. Хим. физ. 81, 3684-3690 (1984).

                                55. Рикарт, П., Чикотти, Г. и Берендсен, Х. Дж. К. Численное интегрирование декартовых уравнений движения системы с ограничениями: молекулярная динамика н-алканов. Дж. Вычисл. физ. 23, 327-341 (1977).

                                56. Шварцбург А. А. и Джаррольд М. Ф. Точная модель рассеяния твердых сфер для подвижностей многоатомных ионов. хим. физ. лат. 261, 86-91 (1996).

                                57. Sugita, Y. & Okamoto, Y. Метод молекулярной динамики с обменом репликами для укладки белков. хим. физ. лат. 314, 141–151 (1999).

                                58. Морса Д., Габелика В. и Де Пау Э. Эффективная температура ионов в спектрометрии ионной подвижности бегущей волны. Анальный. хим. 83, 5775-5782 (2011).

                                Благодарности

                                Р.П. и С.В. признать программы IRB Barcelona и правительства Испании FPI, соответственно, для получения докторских стипендий. Мы благодарим профессора Эрнеста Гиралта за полезные обсуждения и критическое прочтение рукописи, доктора Серджио Мадурга за создание предварительных моделей для сравнения с экспериментальным Q и помощь в подгонке по Гауссу, доктора Марину Гей и Мар Виланову за поддержку масс-спектрометрии и Т. Йейтс за редакционную помощь. Н.К. и М.В. являются активными участниками и членами MC Европейской инициативы COST BM 1403. Основной центр масс-спектрометрии IRB в Барселоне является лабораторией ProteoRed, частью PRB2-ISCIII, поддерживаемой грантом PT13/0001. Эта работа была поддержана грантами от MINECO-FEDER (SAF2012-35226) и от Ассоциации Альцгеймера (NIRP-12-256641), оба для NC

                                Вклад авторов

                                Р.П. и С.В. оптимизированные условия PICUP для приготовления образцов LMW_CL Af с определенным химическим составом. С.В. разработал, выполнил и проанализировал результаты анализа SDS-PAGE. С.В. и Р.М. разработал и внедрил протокол GdnHSCN-SEC. RP спроектировал, провел и проанализировал эксперименты ESI-IM-MS. С.В. полученное распределение олигомеров по данным ESI-IM-MS. Что касается построения моделей димеров Af и моделирования атомистической МД, А.А. и М.О. конструировал эксперименты, А.А. их исполняли, а А.А. и М.О. проанализировал данные. М.В. провела эксперименты LC-HRMS и ESI-MS, а также предоставила техническую поддержку и концептуальные рекомендации по экспериментам ESI-IM-MS. С.В. и Р.М. разработал, выполнил и проанализировал результаты экспериментов CD. NC задумал исследование, спроектировал все эксперименты и руководил ими, а также написал рукопись. Все авторы обсудили результаты, прокомментировали и внесли свой вклад в разделы рукописи.

                                Дополнительная информация

                                Дополнительная информация прилагается к данному документу на http://www.nature.com/srep

                                Конкурирующие финансовые интересы: Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

                                Как цитировать эту статью: Pujol-Pina, R. et al. SDS-PAGE-анализ олигомеров Af не оправдывает себя в исследованиях болезни Альцгеймера: он привлекателен для ESI-IM-MS. науч. 5, 14809; doi: 10.1038/srep14809 (2015).

                                l/gv 0 I Эта работа находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons для статьи, если иное не указано в кредитной строке; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям необходимо будет получить разрешение от держателя лицензии на воспроизведение материала.

                                alexxlab

                                Добавить комментарий

                                Ваш адрес email не будет опубликован.